Summary
Midollare surrenale cromaffini sistemi di colture cellulari sono estremamente utili per lo studio della secrezione di accoppiamento eccitazione-in un ambiente in vitro. Questo protocollo illustra il metodo utilizzato per analizzare le ghiandole surrenali e quindi isolare la regione midollare strappando via la corteccia surrenale. La digestione del midollo in singole cellule cromaffini è poi dimostrato.
Abstract
Midollare surrenale cromaffini sistemi di colture cellulari sono estremamente utili per lo studio della secrezione di accoppiamento eccitazione-in un ambiente in vitro. Questo protocollo illustra il metodo utilizzato per analizzare le ghiandole surrenali e quindi isolare la regione midollare strappando via la corteccia surrenale. La digestione del midollo in singole cellule cromaffini è poi dimostrato.
Protocol
Abbreviazioni:
ACC - surrenale cellule cromaffini, E. Soln - soluzione enzimatica, E. DMEM - Arricchito Dulbecco modificato Aquila Media
- Preparazione
- Aggiungi alla papaina quantità desiderata di E. Soln (40 unità papaina / 1ml E. Soln.).
- Attivare la papaina con CarboGen per circa 15 minuti in ghiaccio. Buffer di ossigenare di Locke sul ghiaccio pure.
- Dissezione
- Utilizzare il mouse 8-10 settimana.
- Prima di rimuovere la digestione ossigenato tampone di Locke e posto sul ghiaccio.
- Fare riferimento al video per la procedura di dissezione.
- Una volta asportato, ghiandole posto in ossigenato buffer di Locke.
- Preparazione di Gland
- Rimuovere il grasso dalla ghiandola.
- Striscia di corteccia dalla ghiandola.
- Digestione enzimatica
- Filtro sterile ossigenato papaina.
- Fare quattro piscine di papaina ossigenata su una piastra di Petri.
- 3 piscine dovrebbe essere di circa 100uls.
- 1 del pool dovrebbe essere di circa 400uls.
- Lavare medullae attraverso piscine
- 1 al 3 piscine 100ul.
- Poi attraverso il pool 400ul
- Pippette 300ul E. Soln e midollo pezzi da piscina 400ul in provetta per microcentrifuga.
- Qrap parafilm in provetta da microcentrifuga e porre in bagno d'acqua a 37 ° C per 20 min.
- Ricordatevi di continuare a ossigenare restanti E. Soln contenenti papaina.
- Dopo 20 minuti filtro sterile più E. Soln.
- Sostituire il vecchio E. medullae balneari Soln con nuova filtrata E. Soln.
- Triturazioni
- Aspirare e scartare E. Soln.
- Lavare medullae in 1 ml E. DMEM.
- Aspirare e scartare E. DMEM.
- Aggiungi 300ul E. DMEM e triturare 20X con 1 ml di punta.
- Taglio punta 200ul con lama di rasoio sterile.
- Triturare 5-10X con punta tagliata 200ul.
- Scartare E. DMEM pezzi medullae bagno. Media conterrà detriti.
- Aggiungi 300uls fresca E. DMEM medullae a pezzi.
- Triturare con punta 200ul 20x
- Pippette E. DMEM per microcentrifuga tubo withough pezzi medullae. Media conterrà ACC libero.
- Aggiungi 300uls fresca E. DMEM medullae a pezzi.
- Triturare medullae con un ago da siringa 23,5 calibro 20x.
- Combina E. DMEM da entrambe le triturazioni. Pezzi Medullae non dovrebbe essere presente e ora dovrebbe avere un aspetto piume.
- Placcatura
- Microcentrifuga E. DMEM dagli ultimi due passi triturazione per 2,5 minuti a 3.7g s.
- Risospendere le sfere in 50uls-200 E. DMEM, a seconda esperimenti successivi.
- Piastra 10-30uls su un vetrino di vetro.
- Attendere 15 minuti per le cellule di aderire.
- Aggiungi 750uls di E. DMEM.
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