Summary
Bu video, etiket ve görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi kullanılarak goldfish retina bipolar hücreleri tek sinaptik vezikül ekzositoz ve ticareti nasıl göstermek.
Abstract
Toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu, cam gibi yüksek bir kırılma indisi maddeye yakın floresan moleküllerin seçici görüntüleme, hücre zarı meydana gelen olayların çalışma sağlayan bir tekniktir
Protocol
Bölüm 1: Diseksiyon ve Bipolar Hücre İzolasyonu
- Tablo 2'de listelenen çözümler hazırlayın; zilleri 'pH (harici) çözümleri NaOH ile 7.4' e ayarlanmış olmalı ve iç çözüm pH 7.2 CsOH ile ayarlanabilir olmalıdır. Iç çözüm alüminyum folyo ile ışıktan korumak ve tutmak 4 ° C kullanana kadar;
- Diseksiyon önce en az 30 dakika için bir Japon balığı Karanlık uyum;
- (Sigma, St Louis, MO tip V hiyalüronidaz düşük Ca 2 + ringer, 1100 adet / ml) ve L-sistein (0.5 mg / ml, 10 ml hayvan koyu adapte ederken, 5 ml hiyalüronidaz hazırlamak düşük Ca 2 + ringer) çözümleri ve papain tartmak (liyofilize toz, 40 adet / ml, 5 ml sindirim çözüm Sigma, St Louis, MO);
- Cerrahi makas ile hızlı dekapitasyon goldfish Euthanize ve # 11 neşter bıçağı ile beyin ve omurilik yok;
- # 7 kavisli Dumont forseps yardımı ile ekstra oküler kaslar yok ve iris makası ile optik sinir kesme gözleri çıkarın;
- Filtre kağıdı ve delinme skleral limbus # 11 neşter bıçak ucu ile bir parça bir göz ampul;
- Delinmiş bütün içinde vannas makas bir çift bıçak tanıtmak ve hemen tüm anterior segment kesebilirsiniz;
- Kalan optik fincan filtre kağıdı küçük bir parça koyun ve kağıt vitreus mizah ile emmek için bazı baskı;
- Ona bağlı retina ile filtre kağıdı kaldırın ve bir par vannas makas ile optik sinir kesmek;
- # 7 Dumont cımbız yardımı ile filtre kağıdı retina kapalı hiyalüronidaz çözüm ve soyulma ile 35 mm plastik kültür çanak retina içeren filtre kağıdı yerleştirin;
- Retinanın bir endüstriyel karbon çelik tek ağızlı bıçak yarısı 4-6 parçalar halinde kesin ve 20 dakika boyunca hiyalüronidaz bir çözüm bekletin;
- Yürürlüğe girmesi hiyalüronidaz için beklerken, L-sistein çözüm papain 5 ml ekleyin ve sıvı şeffaf hale gelinceye kadar (yaklaşık 5-10 dakika) oturup izin;
- Düşük Ca 2 + Ringer 3x retinanın adet yıkayın ve bunları 30-35 dakika papain çözüm bekletin;
- Düşük Ca 2 + Ringer 3x retinanın adet yıkayın ve kullanana kadar saklayabilirsiniz 4 ° C düşük Ca 2 içeren 35 mm plastik kültür çanak + Ringer;
- Hücreleri ayırmak, düşük Ca 2 + Ringer 500 ml içeren bir mikrosantrifüj tüp içinde retinanın bir parça koydu ve yavaş yavaş hava kabarcığı üretmek için dikkatli bir şekilde, bir bardak disosiasyon pipet ile yukarı ve aşağı pipetleme retina çiğnemek . Bunsen beki ile bir bardak Pasteur pipeti ucu ısınma ve anatomik forseps yardımı ile hafif bükme Disosiyasyon pipetler fabrikasyon;
- Plate izole hücreler retina süspansiyon, daha önce 2 mL düşük Ca 2 + ringer ile dolu bir ev yapımı kayıt odasına bir damla ekleyerek. Odanın ortasında dairesel bir bütün ile 35 mm plastik kültür çanağı ve bir silikon elastomer (Sylgard 184 altına yapıştırılmış 1.78 refraktif indeks cam (PlanOptik Almanya) dairesel bir lamel alt yarısında oluşur; Dow Corning Midland).
Bölüm 2: Bipolar Hücre Yükleme ve Out yıkayın
Sinaptik veziküllerin TIRF görüntüleme en iyi şekilde, çok yüksek bir NA nesnel ve duyarlı bir kamera, objektif bir tip TIRFM mikroskop kullanılarak gerçekleştirilir. Deneyler için, bir EMCCD (Cascade 512B, Roper Bilimsel, Tucson, AZ) ile 1.65 NA objektif (Apo x100 O HR, NA 1.65, Olympus, Japonya) kullanmayı tercih. Çok yüksek NA objektif kullanımı, yüksek kırılma cam lamelleri ve daldırma sıvısı (kükürt ile di-iodomethane) kullanımını zorunlu kılmaktadır. Koşullar altında, yaklaşık 50 nm sabit bir uzunluk ile uyarma ışık katlanarak çürüyen bir alanda sınırlıdır.
- Mikroskop objektif yüksek kırılma indisi sıvı (M serisi, refraktif indeksi = 1,7800, Cargille Labs, Cedar Grove, NJ) bir damla ekleyin;
- Mikroskop objektif üstüne dikkatlice kayıt odasına yerleştirin ve dikkatli bir şekilde toprak elektrot ve odasına superfusion çıkış borusu monte;
- Kamara, hücreleri lavabo ve alt uymak için izin mikroskopta 10-20 dakika oturup;
- Bu arada, 1mm Trolox ® ((±)- 6-hidroksi-2 ,5,7,8-tetramethylchromane-2-karboksilik asit 5 ml hazırlamak; Sigma, St Louis, MO), yüksek K + ringer çözüm . Eriyene kadar sonikasyon;
- Düşük Ca 2 + ringer 1 mM ADVASEP-7 (Sigma, St Louis, MO): ADVASEP-7 yıkama solüsyonu 15 mL hazırlayın. ADVASEP-7 kullanımı isteğe bağlıdır ve istenirse atlanabilir unutmayın;
- Superfusion li Temizleeşya ve eklemek ADVASEP-7 yıkama solüsyonu, düşük Ca 2 + ringer ve kontrolü zil sesi superfusion sistemi;
- Ince duvarlı borosilikat cam (TEFE, Sarasota, FL Kwik-Fil ® TW150-3) pipetler yükleme çekin. Puffer pipet dirençler 1.5-2.5 M aralığı;
- Çözümleri; FM1-43 ® (Invitrogen, Carlsbad, CA - (4 (dibutylamino) styryl) piridinium dibromür, "özel paketleme" N-(3-triethylammoniumpropyl) -4) hazırlayın. Birincisi, bir flakon FM1-43 (100 mg) ® 160 mcL distile su ekleyerek 1 mM stok olun. Bu stok, bir haftaya kadar 4 ° C'de muhafaza edilebilir. Sonra FM1-43 5 mcL eklemek ® 1 ml yüksek K + ringer + 1mm Trolox ®. Çözüm alüminyum folyo ile ışıktan koruyun ve 4 tutmak ° C kullanana kadar;
- Mikroskop parlak bir alan ışığı açın ve sağlam bipolar hücreleri aramak. Biraz nöronlar odasının altına sıkıca bağlı olduğundan emin olmak için dokunun mikroskop;
- Superfusion kalem yakın ilgi hücreye yerleştirin ve sürekli düşük Ca 2 + ringer hazırlık serpmek;
- Odanın lambalarını kapatın ve kırmızı uzun geçiren filtre (yani RG630; Schott, Almanya) FM boya uyarma en aza indirmek için optik yol;
- 10 mcL FM boya çözüm ile doldurun mikromanipülatör bir yükleme pipet pipet montajı ve basınç olmadan, yüklemek istediğiniz bipolar hücre aynı odak düzlemli kadar hazırlanması üzerine pipet düşük. En az iki elektrot tutucu olduğundan emin olun: FM boya için kullanılan bir başka hücre içi bir çözüm kontamine olabilir yama sıkma için kullanılır, ya da değildir;
- Akson terminalinden yaklaşık 10 mikron mesafe kirpi açılış Pozisyon, superfusion sistemi kapatın ve 10 saniye boyunca boya çözüm pipet basınç çevirerek puff;
- 30 saniye bekleyin, pipet hareket ettirmeden, basınç kapatın ve;
- Superfusion çevirin ve 5 dakika ADVASEP-7 çözüm odasının banyo. Bu arada, banyo kirpi pipet kaldırmak;
- 5 dakika sonra, düşük Ca 2 + ringer geçmek ve 25-30 dakika süreyle odasının serpmek aşırı boya atılmasına izin verir.
Bölüm 3: Patch Sıkma ve TIRFM Görüntüleme
- Hazırlık yıkama, kalın duvarlı borosilikat cam (Sutter Instrument Company, Novato, CA B150-86-10) yama pipetler çekin. Patch pipet dirençleri 8-10 M aralığı;
- Yıkayın tamamlandıktan sonra, akson terminaline görüş alanının merkezinde yer;
- Mikromanipülatör monte iç çözüm 7μL bir yama pipet ile doldurun, hava kabarcıkları, mont, erimiş diş balmumu (Kerr Corporation, Orange, CA Sabit Wax) ile pipet kurtulmak için pipet dokunun;
- Pipet basınç açın ve pipet hazırlanması üzerine yavaş yavaş daha düşük. Amplifikatör pipet direnci ve doğru pipet uzaklıklar ilgili amplifikatör kontrolleri ile kapasitans ve kontrol edin;
- Ringer kontrol superfusion geçin. Pipet ve hücre arasında bir gigaseal oluşturmak için, hücre gövdesi karşı elektrot ucu hafifçe dokunun ve hafifçe elektrot negatif basınç uygularken pipet basınç kapatmak;
- Kapatılmış olsa da, amplifikatör "tam hücreli" modunu seçin ve potansiyeli -60 mV tutan hücre ayarlamak;
- Tüm akson terminali kapsayan görüntüleme yazılımı ile ilgi bir bölge seçin, parlak bir alan ışığı kapatın ve kısaca (30 ms) 488 nm lazer terminal açığa TIRF görüntüleme için doğru bir odak düzlemli bulmak;
- Pipet biraz negatif basınç uygularken amplifikatör "zap" komutunu kullanarak hücre içine break;
- Sinaptik veziküllerin hücre kapasitans ve seri direnç, doğru ve daha sonra ise ilgi gerilim protokolü uygulamak görüntüleme hareketi. Bu gerilim protokol kamera kare hızı ile senkronize olması için bu aşamada önemlidir. Bizim durumumuzda, her bir kare 30 ms uzun, voltaj değişiklikleri meydana gelen bu değeri (yani, her 300 ms veya 10 kare) katları;
- Kurtarma için izin denemeleri arasında en az 40 saniye bekleyin;
- 561 nm lazer açarken sinaptik şeritler konumunu kontrol etmek, fotoğraf çekmek.
Şekil 1: deney düzeneği. 488 nm lazer (mavi) amacı, arka odak düzlemi çevre odaklı ve cam sulu ortamda arayüzü ulaştığında toplam iç yansıma uğrar. Yansıyan ışın tarafından üretilen elektromanyetik alan Bott yakın sinaptik veziküller içine yüklenen fluorofor heyecanlandıran(yeşil) floresan cam odasının om. Floresan ışık, daha sonra gözlemci göz (tasvir) veya CCD kamera yönlendirilir. Patch-sıkma görüntülü hücrelerinin membran potansiyeli aynı anda kontrol edilir. Bu yaklaşım, gelen sinyalleri (membran voltaj) ve nöronal çıkışı (ekzositoz) arasındaki ilişki çalışma sağlar.
Şekil 2: Tipik bir sonuç. Sol: izole bir Japon balığı bipolar hücre parlak alan görüntü. Üst sağ: bipolar hücre akson terminaline sinaptik veziküllerin TIRF görüntü FM 1-43 yüklü ® ve 488 nm lazer (FM boya) ile görüntülenmiş. Sağ alt: 561 nm lazer ile yama hücre ve görüntüleme akson terminaline sonra aynı terminal görüntüsü. Synaptic şeritler rodamin tabanlı RIBEYE bağlayıcı peptid (Rpep_rhod) tarafından etiketlenir.
Tablo 1: Belirli Reaktifler ve Ekipmanları.
Isim | Tip | Üretici | Katalog | Yorum |
| - | Hava Tablo | Newport Corporation'ın | - | - |
| IX70 | Ters Mikroskop | Olympus | - | Tungsten lamba ve parlak bir alan için TIRF lateral açılış portu ile donatılan |
| TH4-100 | Lamba Güç Kaynağı | Olympus | - | - |
| FF498_581-DI01 | Dikroik Filtre | Semrock | - | - |
| NF01-405_488_568 | Emisyon Filtre | Semrock | - | - |
| Apo x100 O İK | Nesnel | Olympus | - | NA 1.65 |
| RG630 | Kırmızı Cam Filtresi | Schott | - | - |
| - | 488 nm Lazer | Tutarlı | - | Minimum güç kullanımı |
| - | Panjur | Uniblitz | - | - |
| VMM-D1 | Deklanşör Sürücü | Uniblitz | - | - |
| - | 561 nm Lazer | Melles Griot | - | - |
| - | Panjur | Uniblitz | - | - |
| VMM-D3 | Deklanşör Sürücü | Uniblitz | - | - |
| Perfüzyon basıncı Kiti | Superfusion Sistemi | Bilimsel otomatikleştirin | 09-04 | - |
| Perfüzyon Kalem | Superfusion Sistemi | Bilimsel otomatikleştirin | - | - |
| Valvelink 8 | Superfusion Sistemi Kontrolörü | Bilimsel otomatikleştirin | - | - |
| Cascade 512B | EM CCD Kamera | Roper Bilimsel | - | - |
| Metamorph 7.1 | Görüntüleme Yazılımı | Moleküler Cihazlar | - | - |
| EPC-9 | Yama Kelepçe Amplifikatör | Heka Elektronik | - | - |
| Nabız | Amplifikatör Yazılım | Heka Elektronik | - | - |
| MP-285 | Mikromanipülatör | Sutter Enstrüman | - | - |
| - | Elektrod tutucu | Heka Elektronik | - | 1.5 mm cam, 2 adet için |
| Kwik-Fil ® TW150-3 | Borosilikat Kılcal Cam | TEFE | - | Filament olmadan |
| B150-86-10 | Borosilikat Kılcal Cam | Sutter Enstrüman | - | Filament ile |
| P-97 | Mikroelektrod Çektirme | Sutter Enstrüman | - | 3x3 kutusunda filament ve çevre bölmesi ile donatılmış |
| - | Basınç Vakum Hava Pompası | Thomas Bilimsel | 7893B05 | Pipetler için oda ve aşırı basınç sıvı kaldırmak için bir vakum yaratır. |
| MatLab R2008a | Analiz Yazılımı | MathWorks | - | - |
| 353001 | 35 mm Plastik Kültür Yemekleri | Şahin | - | - |
| - | Yüksek Kırılma Endeksli Camı | PlanOptik | - | Kırılma indisi 488 nm = 1.78 |
| M Serisi | Yüksek Refraktif İndeks Sıvı | Cargille Labs | - | Kırılma indeksi = 1.78 |
| Sylgard 184 | Silikon Elastomer Kiti | Dow Corning | - | - |
| Glutatyon | Tripeptide | Merck Kimyasallar | Ücretsiz RADİKAl çöpçü | |
| Hyaluronidase | Enzim | Sigma | H6254 | Tip V |
| L-sistein | Amino Asit | Fluka | 30090 | Papain etkinleştirir |
| Papain | Enzim | Fluka | 76220 | From carica papaya |
| Trolox ® | Çözünen vitamin E | Sigma | 56510 | Serbest radikal temizleyicisidir |
| ADVASEP-7 | Sülfonatlı B-siklodekstrin Türev | Sigma | A3723 | FM 1-43 azaltır ® eşiğe |
| FM 1-43 ® | Floresan Boya | Invitrogen | T35356 | "Özel ambalaj" |
| Sabit Wax | Pipet Kaplama Agent | Kerr Corporation'ın | - | Pipet kapasitans azaltır |
Tablo 2: Bu Çalışmasında Kullanılan Fizyolojik Çözümler.
Madde | Düşük Ca 2 + Ringer | Kontrol Ringer | Yüksek K + Ringer | İç Çözüm |
| NaCl | 120 mm | 120 mm | 97.5 mM | - |
| KCl | 2.5 mM | 2.5 mM | 25 mM | - |
| MgCl 2 | 1 mM | 1 mM | 1 mM | 4 mM |
| CaCl 2 | 0.5 mM | 2.5 mM | 2.5 mM | - |
| Hepes | 10 mM | 10 mM | 10 mM | 10 mM |
| EGTA | 0.75 mM | - | - | 0.5 mM |
| Glikoz | 10 mM | 10 mM | - | - |
| Glutatyon | 2 mM | 2 mM | - | 1 mM |
| CH 3 STK 3 S * | - | - | - | 100 mM |
| TEACl | - | - | - | 10 mM |
| ATP-Mg | - | - | - | 10 mM |
| GTP-Li | - | - | - | 1 mM |
| Rpep-rhod ** | - | - | - | 5 mM |
| Hacim | 200 mL | 100 mL | 5 mcL | 100 mcL |
* Sezyum methanesulfonate.
** RIBEYE bağlayıcı peptid: rodamin + EQTVPVDLSVARDR-COOH (mw 1997,75).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Işık mesafe ile katlanarak düşer bu yana 2); objektif tip TIRF mikroskopi avantajları 1), böylece ışık-odak en aza indirmek amacı, odak düzlemi içinde dar bir bölgeye uyarma ışık kısıtlayarak mükemmel optik kesit sağladığı floresan yoğunluğunda bir değişiklik olarak, dikey yönde hareket izlenebilir; 3) yüksek sayısal açıklık hedefi 1,5 ile verimli bir ışık toplama .
Bu tekniğin en önemli dezavantajı, elektron mikroskobu ile ultra ince bölümüne eşdeğerdir hücre yüzeyi, 100 ve mil içinde gerçekleşen görüntüleme olaylarla sınırlı olmasıdır. Bu nedenle, bu olayların görselleştirme cama yapıştırılmış membran yama yakın sinaptik şeritler varlığı ve başarılı bir şekilde yükleme veziküller cam sıkıca yapıştırılır hücreleri, eleştirel bağlıdır. Bizim protokol, bipolar hücre sinaptik terminali 2,6 içinde vezikül toplam sayısının sadece% 1-2 yüklenmesini sağlar . Söyledi, görüntü mümkün olanlardan daha hücre yüzeyinde meydana gelen çok daha fazla etkinlik olduğu açıktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, Grant EY 14990 tarafından desteklenen oldu.
References
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2, 764-774 (2001).
- Zenisek, D., Steyer, J. A., Almers, W. Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones. Nature. 406, 849-854 (2000).
- Zenisek, D. Vesicle association and exocytosis at ribbon and extraribbon sites in retinal bipolar cell presynaptic terminals. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 4922-4927 (2008).
- Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. Visualizing synaptic ribbons in the living cell. J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).
- Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives. J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).
- Rouze, N. C., Schwartz, E. A. Continous and transient vesicle cycling at a ribbon synapse. J. Neurosci. 18, 8614-8624 (1998).
