Imaging exocytos i näthinnan bipolär Celler med TIRF Mikroskopi

Summary

I denna video visar vi hur du kan märka och visualisera enda synaptiska vesikler exocytos och handel med guldfiskar retinal bipolära celler med total inre reflektans fluorescens (TIRF) mikroskopi.

Abstract

Total inre reflektans fluorescens (TIRF) mikroskopi är en teknik som gör det möjligt att studera händelser som händer i cellmembranet, genom selektiv avbildning av fluorescerande molekyler som ligger närmast ett högt brytningsindex ämne som glas

Protocol

Del 1: Dissection och bipolär Cell Isolation

1. Förbered lösningarna enligt tabell 2, pH ringsignaler "(extern) bör lösningar justeras till 7,4 med NaOH och pH-värdet av den interna lösningen ska justeras till 7,2 med CsOH. Skydda intern lösning från ljus med aluminiumfolie och förvara den i 4 ° C fram till användning;
2. Dark-anpassa en guldfisk i minst 30 minuter före dissektion;
3. Medan djuret mörka anpassar sig, förbereda 5 ml hyaluronidas (typ V hyaluronidas, 1100 enheter / ml i låga Ca ^{2 +} Ringers, Sigma, St Louis, MO) och 10 ml av L-cystein (0,5 mg / ml i låga Ca ^{2 +} Ringerlösning) lösningar och väga papain (frystorkat pulver, 40 enheter / ml, Sigma, St Louis, MO) för 5 ml av matsmältningen lösning;
4. Euthanize guldfisken genom snabb halshuggning med kirurgiska saxar och förstöra hjärnan och ryggmärgen med en # 11 skalpell blad;
5. Ta bort ögonen genom att förstöra den extra okulär muskler med hjälp av en # 7 böjd Dumont pincett och skär synnerven med iris sax;
6. Placera ena ögat glödlampa på en bit filtrerpapper och punktera skleral limbus med spetsen på en # 11 skalpell blad;
7. Introducera bladet av ett par Vannas sax inuti punkteras hela och skär hela främre segmentet bort;
8. Placera en liten bit filterpapper på toppen av de återstående optiska koppen och utöva ett visst tryck för att få pappret suga med glaskroppen;
9. Lyft filterpapper med näthinnan fäst vid den och skär synnerven med ett par av Vannas sax;
10. Placera filterpappret innehåller näthinnan i en 35 mm plast kultur fat med hyaluronidas lösningen och dra av näthinnan från filtret papper med hjälp av # 7 Dumont pincett;
11. Skär näthinnan i 4-6 bitar med hälften av en industriell kolstål enda kanter blad och låt det sitta i hyaluronidas lösningen i 20 minuter;
12. I väntan på hyaluronidas ska börja gälla, tillsätt 5 ml av L-cystein lösning på papain och låt det sitta tills vätskan blir transparent (ca 5-10 minuter);
13. Tvätta bitar av näthinnan 3x i låga Ca ^{2 +} Ringer och låta dem sitta i papain lösningen i 30-35 minuter;
14. Tvätta bitar av näthinnan 3x i låga Ca ^{2 +} Ringer och förvara dem tills de ska användas vid 4 ° C i en 35 mm plast kultur maträtt som innehåller låga Ca ^{2 +} Ringers;
15. Att skilja cellerna, lägg en bit av näthinnan i ett mikrocentrifugrör innehåller 500 ml av låg Ca ^{2 +} Ringer och långsamt mal sönder näthinnan genom att pipettera upp och ner med ett glas dissociation pipett försiktigt att inte producera några luftbubblor. Dissociation pipetter tillverkas genom att värma upp toppen av ett glas pasteurpipett med en Bunsenbrännare och något böja den med hjälp av anatomiska tång;
16. Tavla de isolerade cellerna genom att tillsätta en droppe av näthinnans suspensionen en hemmagjord inspelning kammare tidigare fylld med 2 ml låg Ca ^{2 +} Ringers. Kammaren består av den nedre halvan av en 35-mm plast kultur skålen med en rund helt i mitten och en rund täckglas på 1,78 brytningsindex glas (PlanOptik, Tyskland) limmas på botten med en silikon elastomer (Sylgard 184, Dow Corning , Midland, MI).

Del 2: Bipolär Cell Lastning och tvätta ur

TIRF avbildning av synaptiska vesikler är bäst utförs med hjälp av en objektiv-typ TIRFM mikroskop med mycket hög NA mål och en känslig kamera. För våra experiment, väljer vi att använda en 1,65 NA mål (Apo x100 O HR, NA 1,65, Olympus, Japan) med ett EMCCD (Cascade 512B, Roper Vetenskapliga, Tucson, AZ). Användningen av mycket hög NA mål måste det användning av höga täckglas refraktiv glas och nedsänkning vätska (di-iodomethane med svavel). Under våra förhållanden är excitation ljus begränsad till ett exponentiellt ruttnande fält med en längd konstant på ca 50 nm.

1. Tillsätt en droppe av hög brytningsindex vätska (M-serien, brytningsindex = 1,7800, Cargille Labs, Cedar Grove, NJ) till mikroskop mål;
2. Placera inspelningen kammaren försiktigt på toppen av mikroskop objektiva och noggrant montera jordelektrod och superfusion avsluta röret kammare;
3. Låt kammare sitta på mikroskop i 10-20 minuter så att cellerna att sjunka och följa botten;
4. Under tiden förbereder 5 mL av en 1mm Trolox ® ((±)- 6-hydroxy-2 ,5,7,8-tetramethylchromane-2-karboxylsyra, Sigma, St Louis, MO) lösning i hög K ⁺ Ringers . Sonikera tills det är upplöst;
5. Förbered 15 mL ADVASEP-7 tvättlösning: 1 mm ADVASEP-7 (Sigma, St Louis, MO) i låga Ca ^{2 +} Ringers. Observera att ADVASEP-7 användningen är valfri och kan utelämnas om så önskas;
6. Rensa superfusion liNES och lägga ADVASEP-7 tvättlösning, lågt Ca ^{2 +} Ringer och kontroll Ringer till superfusion systemet;
7. Dra lastning pipetter från tunnväggiga borosilikatglas (Kwik-Fil ® TW150-3, WPI, Sarasota, FL). Puffer pipett resistanser är i 1,5-2,5 Mohm området;
8. Förbered FM1-43 ® (N-(3-triethylammoniumpropyl) -4 - (4 - (dibutylamino) styryl) pyridintvärbindningar dibromide, "speciella förpackningar", Invitrogen, Carlsbad, CA) lösningar. Gör först en 1 mm lager genom att tillsätta 160 mikroliter destillerat vatten till en injektionsflaska (100 mg) FM1-43 ®. Detta lager kan hållas vid 4 ° C i upp till en vecka. Lägg sedan till 5 mikroliter av FM1-43 ® till 1 ml hög K ⁺ Ringers + 1mm Trolox ®. Skydda lösningen från ljus med aluminiumfolie och förvara den i 4 ° C fram till användning;
9. Vrid mikroskop ljusa fältet ljus och söka efter intakta bipolära celler. Något knacka på mikroskop för att se till att nervceller är fast knutna till botten av kammaren;
10. Placera superfusion penna nära till cellen av intresse och kontinuerligt BEGJUTA beredning med låg Ca ^{2 +} Ringers;
11. Stäng av rummet ljus och lägga en röd lång pass filter (dvs. RG630, Schott, Tyskland) till den optiska vägen för att minimera excitation av FM-färg;
12. Fyll en belastning pipett med 10 mikroliter av FM färglösningen, montera pipetten i mikromanipulator och sänk pipetten på preparatet utan övertryck tills den är på samma fokalplanet som bipolär cell du vill ladda. Se till att du har minst två elektrodhållare: den som används för FM-färgämnet kan inte användas för patch fastspänning, annars kan kontaminera det intracellulära lösning;
13. Placera puffer öppningen på en sträcka av cirka 10 mikrometer i axonet terminalen, stäng av superfusion systemet och puff färgen lösningen i 10 sekunder genom att vrida på pipett övertryck på;
14. Stäng av övertryck av och utan att flytta pipett, vänta 30 sekunder;
15. Vänd superfusion på och bada den kammare i ADVASEP-7-lösning i 5 minuter. Under tiden, ta bort Puffer pipett ur badet;
16. Efter 5 minuter, byt till låga Ca ^{2 +} Ringer och BEGJUTA kammaren i 25-30 minuter för att avlägsna överflödig färg.

Del 3: Patch spännanordningar och TIRFM Imaging

1. Medan beredningen är att skölja, dra patch pipetter från tjocka väggar borosilikatglas (B150-86-10, Sutter Instrument Company, Novato, CA). Patch pipett resistanser är i 8-10 Mohm området;
2. Efter tvätt ute är klar, placera axonet terminalen i centrum av synfältet;
3. Fyll en patch pipett med 7μL av intern lösning, tryck på pipetten för att bli av med luftbubblor, päls pipetten med smält dentalvax (Sticky Wax, Kerr Corporation, Orange, CA) och montera den i mikromanipulator;
4. Vänd pipetten övertryck på och sänk pipetten sakta på förberedelser. Kontrollera pipett resistansen i förstärkaren och korrekt offset pipett och kapacitans med respektive förstärkare kontroller;
5. Växla superfusion att kontrollera Ringers. För att skapa en gigaseal mellan pipetten och cellen, något vidrör spetsen på elektroden mot cellkroppen och vrid pipetten övertryck av medan du försiktigt tillämpa undertryck till elektroden;
6. Medan förseglade, välj "helcells"-läge i förstärkaren och ställ cellen hålla potential till -60 mV;
7. Välj en region av intresse med bildbehandlingsprogram som omfattar hela axonet terminalen, vrid den ljusa fältet lampan, och genom att kort utsätta (30 ms) terminalen till 488 nm laser, hitta rätt fokalplanet för TIRF avbildning;
8. Bryta sig in i cellen genom att använda "zappar" kommandot av förstärkaren samtidigt som något negativ press på pipett;
9. Korrekt för cell kapacitans och serier motstånd, och sedan använda spänningen protokollet intressanta vid avbildning rörelse synaptiska blåsor. Det är i detta skede viktigt att ha spänningen protokollet synkroniserad till kameran bildhastighet. I vårt fall är varje bildruta 30 ms lång, så spänningen förändringar sker i multiplar av detta värde (dvs, varje 300 ms eller 10 bilder);
10. Vänta minst 40 sekunder mellan försöken för att möjliggöra återvinning,
11. För att kontrollera positionen för synaptiska band, ta bilder medan du slår på 561 nm laser på.

Figur 1: experiment. En 488 nm laser (blå) är fokuserad till periferin av ryggen fokalplan målet och lider total inre reflektion när den når glaset vattenhaltigt medium gränssnitt. Den elektromagnetiska fält som genereras av den reflekterade strålen väcker fluoroforen laddas i synaptiska vesikler närmast BottOm av glaset kammare, som sedan fluorescerar (grön). Den fluorescerande ljus är sedan guidas till betraktarens öga (avbildade) eller till en CCD-kamera. Membranet potential avbildade cellerna styrs samtidigt av patch-fastspänning dem. Detta tillvägagångssätt gör att studera förhållandet mellan inkommande signaler (membranet spänning) och neuronala utgång (exocytos).

Figur 2: Typiska resultat. Vänster: ljusa fält bilden av en isolerad guldfiskar bipolär cell. Övre höger: TIRF bild av synaptiska blåsor i den bipolära cellen axon terminalen laddade med FM 1-43 ® och avbildade med 488 nm laser (FM färg). Nere till höger: bilden av samma terminal efter lapp cellen och bildhantering axonet terminalen med 561 nm laser. Synaptic band är märkta av Rhodamine-baserade Ribeye-bindande peptid (Rpep_rhod).

Tabell 1: Specifika Reagenser och utrustning.

Namn	Typ	Tillverkare	Katalog	Kommentar
-	Air Table	Newport Corporation	-	-
IX70	Inverterat mikroskop	Olympus	-	Utrustad med en tungsten lampa för ljusa fält och en lateral öppna port för TIRF
TH4-100	Lampa Strömkälla	Olympus	-	-
FF498_581-Di01	Dichroic filter	Semrock	-	-
NF01-405_488_568	Emission filter	Semrock	-	-
Apo X100 O HR	Mål	Olympus	-	NA 1,65
RG630	Röd glasfilter	Schott	-	-
-	488 nm laser	Sammanhängande	-	Använd på lägsta effekt
-	Shutter	Uniblitz	-	-
VMM-D1	Shutter Driver	Uniblitz	-	-
-	561 nm laser	Melles Griot	-	-
-	Shutter	Uniblitz	-	-
VMM-D3	Shutter Driver	Uniblitz	-	-
Perfusionstryck Kit	Superfusion System	Automatisera Vetenskapliga	09-04	-
Perfusion Pen	Superfusion System	Automatisera Vetenskapliga	-	-
Valvelink 8	Superfusion System Controller	Automatisera Vetenskapliga	-	-
Cascade 512B	EM CCD-kamera	Roper Vetenskapliga	-	-
Metamorfa 7,1	Mjukvara för bildhantering	Molecular Devices	-	-
EPC-9	Patch Clamp Förstärkare	Heka Elektronik	-	-
Puls	Förstärkare Software	Heka Elektronik	-	-
MP-285	Mikromanipulator	Sutter Instrument	-	-
-	Elektrodhållare	Heka Elektronik	-	För 1,5 mm YD glas, 2 enheter
Kwik-Fil ® TW150-3	Borosilicate Kapillär Glas	WPI	-	Utan glödtråd
B150-86 till 10	Borosilicate Kapillär Glas	Sutter Instrument	-	Med glödlampa
P-97	Mikroelektrod Puller	Sutter Instrument	-	Utrustad med 3x3 låda glödlampor och klimatkammare
-	Tryck Vakuum luftpump	Thomas Vetenskapliga	7893B05	Skapar vakuum för att avlägsna vätska från kammare och övertryck för pipetter
MatLab R2008a	Analysis Software	MathWorks	-	-
353.001	35 mm Plast kultur rätter	Falcon	-	-
-	Högt brytningsindex Glas	PlanOptik	-	Brytningsindex 488 Nm = 1,78
Serien M	Högt brytningsindex Liquid	Cargille Labs	-	Brytningsindex = 1,78
Sylgard 184	Silicon Elastomer Kit	Dow Corning	-	-
Glutation	Tripeptid	EMD Kemikalier		Gratis Radical renhållare
Hyaluronidas	Enzyme	Sigma	H6254	Typ V
L-cystein	Amino Acid	Fluka	30.090	Aktiverar papain
Papain	Enzyme	Fluka	76.220	Från Carica papaya
Trolox ®	Vitamin E	Sigma	56.510	Fria radikaler
ADVASEP-7	Sulfonerad B-cyklodextrin Derivata	Sigma	A3723	Minskar FM 1-43 ® bakgrundsfluorescens
FM 1-43 ®	Fluorescerande färg	Invitrogen	T35356	"Särskilda förpackningar"
Sticky Wax	Pipettera Beläggning Agent	Kerr Corporation	-	Minskar pipett kapacitans

Tabell 2: Fysiologiska lösningar som används i denna studie.

Ämne	Låg Ca 2 + Ringers	Kontroll Ringers	Höga K + Ringers	Intern lösning
NaCl	120 mm	120 mm	97,5 mM	-
KCl	2,5 mm	2,5 mm	25 mM	-
MgCl 2	1 mM	1 mM	1 mM	4 mm
CaCl 2	0,5 mM	2,5 mm	2,5 mm	-
HEPES	10 mM	10 mM	10 mM	10 mM
EGTA	0,75 mm	-	-	0,5 mM
Glukos	10 mM	10 mM	-	-
Glutation	2 mM	2 mM	-	1 mM
CH 3 CSO 3 S *	-	-	-	100 mM
TEACl	-	-	-	10 mM
ATP-Mg	-	-	-	10 mM
GTP-Li	-	-	-	1 mM
Rpep-Rhod **	-	-	-	5 mM
Volym	200 ml	100 ml	5 mikroliter	100 mikroliter

* Cesium methanesulfonate.
** Ribeye-bindande peptid: Rhodamine + EQTVPVDLSVARDR-COOH (MW 1997,75).

Discussion

Fördelarna med objektiv-typ TIRF mikroskopi är att 1) ​​det ger utmärkta optiska sektionering genom att begränsa excitation ljuset till en smal region inom fokalplan målet, vilket minimerar out-of-fokus ljus, 2) eftersom ljuset faller exponentiellt med avståndet kan rörelse i lodrät riktning skall övervakas som en förändring av fluorescensintensiteten, 3) ett effektivt ljus insamling genom höga numeriska bländaröppningen mål ^1,5.

Den största nackdelen med tekniken är att den är begränsad till avbildning som utspelas inom 100 & nm från cellytan, vilket är ungefär likvärdig med en ultratunn avsnitt i elektronmikroskopi. Därför beror visualisering av dessa händelser kritiskt på cellerna vara fast följas glaset, om förekomsten av synaptiska band nära den fläck av membranet följs glaset och på den framgångsrika lastning av blåsor. Vår protokollet möjliggör lastning av endast 1-2% av det totala antalet blåsor inom den bipolära cellen synaptiska terminalen ^2,6. Med det sagt är det tydligt att det finns mycket mer som utspelas på cellytan än de vi kan bild.