Summary
В этой статье мы описали типичный способ, чтобы изолировать и культуры взрослых миоцитах сердца крысы. Коллагеназы и протеаз, которые используются, чтобы переварить и выделить одного миоцитов. Миоциты культурный следовать этому протоколу отвечает большинству требований эксперимента.
Abstract
Искусственный первичных клеток грызунов взрослого сердца являются важной модельной системой для сердечно-сосудистых исследований. Тем не менее, создание надежной, жизнеспособной культурной миоцитов взрослых может быть технически сложными, ограничение скорости шаг для многих исследователей. Здесь мы описали протокол для получения высокого выхода взрослой крысы сердце миоцитов, которые остаются жизнеспособными в культуре в течение нескольких дней. Сердце изолированы и озарен коллагеназы и протеаз при низкой Ca
Protocol
Часть I. Подготовка к операции
- За день до операции крысы, убедитесь, что все решения принимаются, но не добавляют ферменты еще. Буферы, В и промывочный буфер все должны быть отфильтрованы на стерильность перед хранением. Буферы все должны храниться при температуре 4 ° C.
- 6-луночных культуре ткани должны быть покрыты 10-20 мкг / мл ламинин в 2 мл 1XSFM день до, так и должны храниться при температуре 37 ° C в CO 2 инкубаторе.
- В день операции, подготовки хирургических инструментов к стерилизации зажим, ножницы, щипцы и с 70% этанола и дайте им высохнуть на бумажном полотенце.
- 1 мл шприц с 0,5 мл раствора гепарина (90 ед / мл) приготовили.
- Теперь это хорошая практика, чтобы вымыть перфузии аппарата проходит через 70% этанола, используя перистальтического насоса в обратном направлении. После завершения промывки этанолом, промыть аппарат с двойным дистиллированной воды, и, наконец, полоскание с буфером А. потока через собирают в стакан помещается в 37 ° С водяной бане.
- Для подготовки очищены перфузии аппарата, заполните правую трубку шприц с 40 мл буфера и левой трубки шприц с 40 мл буфера B.
- Премьер перфузии трубы до кончика катетера, позволяя буфера течь через аппарат. Пополнение в буфер шприц 40 мл уровне. Убедитесь Есть нет воздушных пузырьков в трубке после этого шага.
- Теперь закройте буфера клапан шприца кран и повторить процесс с буфером B такие, что перфузии трубки теперь загрунтовать буфера B.
- Наконец, перфузии аппарат ушел с буфером B кран клапан открыт, но с потоком перестали использовать регулятора на линии IV.
- Отменить буфер потока, хотя в сборе стакан.
- Последнее, что нужно сделать, прежде чем операция, чтобы добавить необходимые ферменты для вашего исходного раствора, а затем отфильтровать раствор фермента так же, как и другие решения были отфильтрованы накануне. Как только фильтруются, это решение можно оставить при комнатной температуре.
Часть II. Рассечение сердце крысы
- После стандартного протокола усыпить крысу с изофлюрана в газовой камере.
- Стерилизовать разрез область грудной клетки с 70% этанола.
- Открытая грудь с помощью ножниц и подвергать сердце.
- Inject левого желудочка с 0,5 мл раствора гепарина (90 ед / мл).
- Удалить сердце большая часть аорты нетронутыми, место в ледяной буфера B.
Часть III. Миоциты изоляции
- Типичный сердца крысы должны дать высокую долю палочковидные миоциты (в отличие от мертвой округлые клетки), если следующая процедура должным образом соблюдаться.
- Во-первых, зажим аорты катетер. Кончике катетера не должно заходить слишком далеко в сердце, чтобы обеспечить хорошее кровоснабжение сердца через коронарные артерии.
- После зажат, галстук аорты катетер с швом.
- Далее, откройте регулятор IV линия позволит быстрыми темпами капельно (~ 60 капель / мин) и позволяет буфера B, чтобы смыть сердце.
- Во время мытья буфера B, используйте маленькие ножницы и пинцет для удаления предсердий и любое жирное или легочной ткани, цепляясь за сердце.
- После буфера B закончена, переключение потока в буфер А.
- Хотя буфера разрешено поступать в течение 5 минут, несколько небольших задач должно быть быстро выполнена.
- Во-первых, теплый раствор фермента в 37 ° С водяной бане.
- Наконец, когда буфер истощается из шприца (но все еще присутствует в НКТ), нагрузка 50 мл раствора фермента в шприц из перфузии аппарата
- Теперь необходимо, чтобы отменить все проточные из коллекции стакан в ванну с водой (с помощью пипетки), пока ферментов сердца Решение perfuses.
- Как только раствор фермента perfuses сердце, активировать перистальтического насоса, который настроен на передачу раствора фермента от сбора стакан для пополнения шприц А.
- Разрешить раствора фермента течь через сердце в течение 10 мин. Как сердце дайджесты, оно начинает выглядеть раздутой.
- Добавить 37,5 мкл 0,1 М CaCl 2 до ферментного раствора в шприце, чтобы дать эффективные концентрации 0,1 мМ Ca 2 +.
- Через 10 минут повышают концентрацию кальция до 0,2 мм путем добавления дополнительных 50 мкл 0,1 М CaCl 2 до шприца и пусть перфузии действовать еще в течение 10 минут.
- Отрежьте желудочков и трансфер в небольшой стерильный стакан, содержащий 20 мл раствора фермента.
- В стакан увеличения концентрации кальция до 0,4 мм, добавив еще 40 мкл 0,1 М CaCl 2.
- Аккуратно фарш сердце в 10 или более частей с парой мелких стерильных ножниц.
- Инкубируйте стакан в течение 5 минут при 37 ° С с нежным качалки.
- Добавить 40 мл 0,1 М CaCl 2 додать эффективные концентрации 0,6 мМ Са 2 + и нежно растирают сердца куски пластиковой пипетки передачи 3-5 раз.
- После инкубации в течение еще 5 минут при 37 ° С, добавить 40 мл 0,1 М CaCl 2 и нежно растирают, как раньше.
- Отдельные переваривается одного миоциты от не переваренной соединительной ткани с помощью фильтрации через стерильную 500 мкм сетки.
- Разрешить клетки поселиться в 50 мл трубку в течение 10 минут при комнатной температуре.
- Удалите надосадочную с передачей пипетки.
- Аккуратно ресуспендирования клеток в промывочный буфер # 1 и позволяют клеткам урегулировать в течение 10-20 мин при комнатной температуре.
- В то время как клетки урегулирования, возьмите небольшую аликвоту, и использовать это время как возможность оценить качество и жизнеспособность клеток в суспензии под инвертированным микроскопом. Хорошая подготовка будет иметь высокую долю (> 80%) стержень, как клетки с четкими страт.
- Как только клетки осели, отбросить супернатант и мягко ресуспендирования клеток в промывочный буфер # 2. Пусть клетки урегулировать при комнатной температуре, которая должна снова принять 10-20 минут, и отбросить супернатант.
- Повторите процесс стирки еще раз промывочным буфером # 3, и клетки будут готовы к культуре.
Часть IV. Миоцитов культуре клеток
- Аккуратно ресуспендирования клеток в 5% сыворотки Media. Перед передачей клетки пластины культуре ткани, промыть пластины с 1x УЛ. Передача клеток при требуемой плотности и инкубировать в CO 2 в тканевой культуре инкубаторе в течение 3-5 часов.
- Коммутатор СМИ 1x УЛ.
- Клетки можно культивировать в течение четырех дней и используются в качестве необходимых для экспериментов.
Часть V. представитель Результаты / Результаты
Там должно быть более 70% живут миоцитов сердца под инвертированным микроскопом, когда протокол будет сделано правильно.
Таблица 1: Решение рецепт 1 л 10X Са 2 +-свободные буфера KH:
| масса | Конечная концентрация | |
| NaCl | 68,96 г | 1180 мм |
| KCl | 3,58 г | 48 мм |
| HEPES | 59,58 г | 250 мМ |
| K 2 HPO 4 | 2,85 г | 12,5 мм |
| MgSO 4 | 3,08 г | 12,5 мм |
Таблица 2: Решение рецепт 1 л буфера:
Добавить 1,98 г глюкозы в 100 мл 10X буфера KH и довести до конечного объема 1 л Отрегулируйте осмолярность почти до условием физиологии (~ 300) с глюкозой. Довести до рН 7,4 с помощью NaOH.
| - | Масса | Конечная концентрация |
| 10X буфера KH | 100 мл | 100 мл |
| Глюкоза | 1,98 г | 11 мм |
| Довести до 1 л | ||
| Довести до рН 7,4 с NaOH | ||
| Отрегулируйте осмолярность почти до физиологического состояния (~ 300) с глюкозой. | ||
Таблица 3: Решение рецепт ферментов Буферы
| масса | Конечная концентрация | |
| Коллагеназы II типа | 25 мг | 0,05% (м / о) |
| Протеазы XIV | 10 мг | 0,02% (м / о) |
| BDM | 0,025 г | 5 мМ |
| Карнитин | 0,020 г | 2 мМ |
| Таурин | 0,031 г | 5 мМ |
| Глутаминовая кислота | 0,020 г | 2 мМ |
| 0,1 М CaCl 2 | 12,5 мкл | 25 мкМ |
| Буфер | Заполнить до 50 мл |
Таблица 4: Решение рецепт 25X BDM / Таурин / BSA (B / T / B)
| масса | Конечная концентрация | |
| BDM | 0,076 г | 125 мМ |
| Таурин | 0,094 г | 125 мМ |
| BSA | 0,1% (м / о) | |
| Буфер | Заполнить до 6 мл |
Таблица 5: Решение рецепт B буфера и вымойте Буферы
| Буфер: | B | # 1 | # 2 | # 3 |
| Добавить: | ||||
| 0,5 М CaCl 2 | 0,4 мл | 0,1 мл | 0,125 мл | 0,15 мл |
| Конечная концентрация CaCl 2 | 1 мМ | 1 мМ | 1,25 мМ | 1,5 мМ |
| 25X B / T / B | --- | 2 мл | 2 мл | 2 мл |
| Буфер для конечного объема | 200 мл | 50 мл | 50 мл | 50 мл |
Таблица 6: Решение Рецепт для культивирования СМИ
| 2X сыворотки среде (SFM) | ||
| Конечная концентрация | ||
| (После разведения) | ||
| Карнитин | 0,099 г | 10 мм (5 мМ) |
| Таурин | 0,063 г | 10 мм (5 мМ) |
| Креатин | 0,075 г | 10 мм (5 мМ) |
| Антибиотик / противогрибковым | 0,5 мл | 1% (0,5%) (объем / объем) |
| Медиа-199 | 45 мл | Заполнить до 50 мл |
| 1X SFM | ||
| Конечная концентрация | ||
| 2X SFM | 25 мл | 1X |
| Медиа-199 | Заполнить до 50 мл | |
| 1X 5% сыворотки СМИ | ||
| Конечная концентрация | ||
| 2X SFM | 25 мл | 1X |
| FBS | 2,5 мл | 5% (об. / об) |
| Медиа-199 | Заполнить до 50 мл |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Важным шагом является скорость, с которой изолированного сердца вешается на перфузию системы. Длина ферментативных период пищеварения может быть немного различны для каждой крысы. Регулировка зависит от того, как мягкая сердце становится после очередного периода пищеварения. Медленно восстановления Са 2 + после ферментативного расщепления имеет важное значение для получения Са 2 +-толерантный здоровые клетки.
Для морской свинки, протокол же, за исключением гиалуронидазы используется вместо протеазы XIV. Как правило, мы находим, что первоначальный процент живых клеток ниже для морской свинки по сравнению с крысой, хотя они выживают только до тех пор в культуре.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P9666 | |
| MgSO4 | Fluka | 63068 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Carnitine | Sigma-Aldrich | C9500 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Creatine | Sigma-Aldrich | C3630 | |
| Antibiotic | Cellgro | 30-009-CI | |
| Media 199 | GIBCO, by Life Technologies | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Laminin | BD Biosciences | 354232 | |
| water bath | Fisher Scientific | 15-462-5 | |
| variable flow chemical pump | Fisher Scientific | 15-077-67 | |
| 6-well culture plate | Corning | 3516 |
References
- Miriyala, J., Nguyen, T., Yue, D. T., Colecraft, H. M. Role of CaVbeta subunits, and lack of functional reserve, in protein kinase A modulation of cardiac CaV1.2 channels. Circ Res. 102 (7), e54-e64 (2008).
- SX, T. akahashi, Mittman, S., Colecraft, H. M. Distinctive modulatory effects of five human auxiliary beta2 subunit splice variants on L-type calcium channel gating. Biophys. , 84-845 (2003).
