תרבות ראשונית של הלב Myocytes למבוגרים עכברוש

Summary

במאמר זה תיארנו את הדרך טיפוסי לבודד תרבות עכברוש מבוגר myocytes לב. Collagenase ו פרוטאז משמשים לעכל לבודד myocytes יחיד. Myocytes תרבותי לעקוב בפרוטוקול זה לעמוד בדרישות הניסוי ביותר.

Abstract

Cultured העיקרי מכרסמים מבוגרים לתאי לב הם מערכת מודל חשוב למחקר קרדיווסקולרי. עם זאת, הקמתה של החזקה, myocytes קיימא מבוגר תרבותי יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית, שער הגבלת צעד עבור חוקרים רבים. כאן אנו תיאר פרוטוקול להשיג תשואה גבוהה של מבוגר לב myocytes עכברוש שנותרו קיימא בתרבות במשך כמה ימים. הלב הוא מבודד perfused עם collagenase ו פרוטאז תחת Ca נמוך

Protocol

חלק א הכנה לניתוח

1. יום לפני הניתוח חולדה, לוודא את כל פתרונות מורכבים, אבל לא להוסיף כל האנזימים עדיין. Buffers, B ו החיץ לשטוף צריכים להיות מסוננים על סטריליות לפני האחסון. מאגרים צריכים להיות מאוחסנים 4 ° C.
2. 6 גם תרבות צלחות רקמות חייב להיות מצופה עם 10-20 מיקרוגרם / מ"ל laminin ב 2 מ"ל 1XSFM יום לפני, וגם צריך להיות מאוחסן על 37 מעלות צלזיוס CO ₂ באינקובטור.
3. ביום הניתוח, להכין את מכשירי ניתוח עיקור על ידי מהדק, מספריים, מלקחיים עם אתנול ו 70% ולתת להם להתייבש על מגבת נייר.
4. מזרק 1 מ"ל מלאים פתרון 0.5 מ"ל הפרין (90 U / ml) היא מוכנות.
5. עכשיו זה תרגול טוב לשטוף את מנגנון זלוף ידי פועל באמצעות אתנול 70%, באמצעות המשאבה peristaltic הפוך. סיים לאחר שטיפה עם אתנול, לשטוף את המנגנון עם מים מזוקקים פעמיים, ולבסוף לשטוף עם הצפת א לזרום דרך נאסף בכוס להציב אמבטיה 37 מעלות צלזיוס המים.
6. כדי להכין את מנגנון זלוף לנקות, למלא את הצינור מזרק ימין עם 40 מ"ל של הצפת ואת הצינור מזרק נשאר עם 40 מ"ל של הצפת B.
7. ראש בצינור זלוף אל קצה הצנתר על ידי מתן הצפת לזרום דרך המנגנון. מילוי למאגר מזרק לרמה 40 מ"ל. ודא שאין בועות אוויר שנלכדו בצינור לאחר שלב זה.
8. עכשיו, לסגור את המאגר שסתום שסתום המזרק לחזור על התהליך עם B מאגר כזה צינורות טפטוף ערוכה עכשיו עם הצפת B.
9. לבסוף, מנגנון זלוף נשאר עם B חוצץ שסתום שסתום פתוח, אך עם הזרם הפסיק להשתמש הרגולטור על הקו הרביעי.
10. מחק את המאגר זרימה למרות בכוס האיסוף.
11. הדבר האחרון לעשות לפני הניתוח היא להוסיף את האנזימים הדרושים לפתרון המניות שלך, ואז לסנן את הפתרון אנזים בדיוק כמו פתרונות אחרים סוננו יום קודם לכן. לאחר סינון, פתרון זה אפשר להשאיר בטמפרטורת החדר.

חלק II. הלב עכברוש לנתיחה

1. הפרוטוקול הסטנדרטי בעקבות להרדים את עכברוש עם Isoflurane בתא הגזים.
2. לחטא את אזור החתך על החזה עם 70% אתנול.
3. החזה פתח באמצעות מספריים לחשוף לב.
4. הזרק החדר השמאלי עם פתרון 0.5 מ"ל הפרין (90 U / mL).
5. הסר את הלב עם חלק גדול של האאורטה המקום ללא פגע, בקרח קר הצפת B.

חלק III. Myocytes בידוד

1. לב עכברוש טיפוסי צריך תשואה גבוהה של חלק בצורת מוט myocytes (בניגוד לתאי מעוגל מת) אם ההליך הבא הוא דבק כראוי.
2. כדי להתחיל, מהדק אל אבי העורקים הקטטר. קצה הצנתר לא צריך להיות חזק מדי ללב, כדי להבטיח זלוף טוב של הלב דרך העורק הכלילי.
3. הידק פעם לקשור את אבי העורקים אל קטטר עם תפר.
4. לאחר מכן, לפתוח את קו IV הרגולטור על מנת לאפשר קצב טפטוף מהיר (~ 60 טיפות / min) ולאפשר B הצפת לשטוף החוצה את הלב.
5. במהלך לשטוף B חוצץ, השתמש במספריים קטנים מלקחיים כדי להסיר את הפרוזדורים וכל רקמת שומן או ריאות נצמד ללב.
6. לאחר הצפת B הוא סיים, לעבור את זרימת למאגר א
7. למרות הצפת מותר לזרום במשך 5 דקות, קטן מספר משימות יש לבצע במהירות.
8. ראשית, לחמם את הפתרון אנזימים בתוך אמבט המים 37 מעלות צלזיוס.
9. לבסוף, כאשר מאגר מתרוקן מן המזרק (אבל עדיין קיימת בצינור), עומס 50 מ"ל הפתרון אנזימים בתוך מזרק של המנגנון זלוף
10. עכשיו זה צריך לבטל את כל זרימה דרך מן הקנקן אוסף באמבט מים (על ידי pipetting), עד לב הפתרון אנזימים perfuses.
11. ברגע פתרון אנזימים perfuses הלב, להפעיל את המשאבה peristaltic אשר מוגדר להעביר את פתרון האנזים מן הקנקן איסוף לחדש מזרק א
12. אפשר פתרון אנזים לזרום דרך הלב עבור 10 דקות. כמו הלב מעכל, הוא מתחיל להיראות נפוח.
13. הוסף 37.5 μL של 0.1 מ 'CaCl ₂ לפתרון האנזים מזרק לתת ריכוז יעיל של 0.1 מ"מ Ca ^{2 +.}
14. לאחר 10 דקות להעלות את ריכוז הסידן mM 0.2 ידי הוספת μL נוסף של 50 0.1 M CaCl ₂ אל מזרק ולתת זלוף להמשיך במשך 10 דקות נוספות.
15. לנתק את החדרים ולהעביר מבחנה סטרילית קטן המכיל 20 מ"ל אנזימים פתרון.
16. ב כוס להגדיל את ריכוז הסידן מ"מ 0.4 ידי הוספת 40 μL יותר של 0.1 מ 'CaCl _2.
17. בעדינות לרכך את הלב לתוך 10 או יותר חתיכות עם זוג מספריים סטרילי קטן.
18. דגירה את הכוס במשך 5 דקות ב 37 מעלות עם נדנדה עדין.
19. הוסף 40 מ"ל של 0.1 מ 'CaCl ₂ אללתת ריכוז יעיל של 0.6 mM Ca ^{2 +} בעדינות triturate את חתיכות הלב עם pipet העברה פלסטיק 3-5 פעמים.
20. לאחר דוגרים במשך 5 דקות נוספות על 37 מעלות צלזיוס, להוסיף 40 מ"ל של 0.1 מ 'CaCl ₂ בעדינות triturate כמו קודם.
21. הפרד myocytes יחיד מעוכל מן הלא מעוכל רקמת חיבור באמצעות סינון דרך רשת סטרילי 500 מיקרומטר.
22. אפשר התאים להתיישב שפופרת 50 מ"ל במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
23. בטל supernatant עם pipet העברה.
24. בעדינות resuspend תאים הצפת לשטוף # 1 ולאפשר לתאים להסתפק 10-20 דקות בטמפרטורת החדר.
25. בעוד התאים ליישוב, לקחת aliquot קטן, ולהשתמש הפעם הזדמנות להעריך את האיכות ואת יכולת הקיום של התאים בתרחיף תחת מיקרוסקופ הפוכה. הכנה טובה יהיה אחוז גבוה (> 80%) של מוט כמו תאים עם פסי פריך.
26. ברגע שהתאים התיישבו, להשליך את התאים supernatant ו resuspend בעדינות הצפת לשטוף # 2. בואו התאים להסתפק בטמפרטורת החדר, שאמור שוב לקחת 10-20 דקות, לבטל את supernatant.
27. חזור על תהליך הכביסה שוב עם הצפת לשטוף # 3, התאים יהיה מוכן תרבות.

חלק ד '. תא Myocyte תרבות

1. בעדינות resuspend תאים מדיה סרום 5%. לפני העברת תאים בתרבית רקמה צלחות, לשטוף את הצלחות עם SFM 1x. העברת התאים בצפיפות הרצויה דגירה של CO ₂ רקמה תרבות חממה 3-5 שעות.
2. החלף את התקשורת 1x SFM.
3. תאים יכול להיות מתורבת עבור עד ארבעה ימים ומשומשים, כנדרש על ניסויים.

חלק ו 'תוצאות נציג / תוצאה

לא צריך להיות יותר מ 70% myocytes לב לחיות תחת מיקרוסקופ הפוכה כאשר הפרוטוקול הוא נעשה בצורה נכונה.

טבלה 1: מתכון פתרון עבור L 1 10X Ca ^{2 +} ללא הצפת KH:

	מסה	הריכוז הסופי
NaCl	68.96 גרם	1180 mM
KCl	3.58 גר '	48 mM
HEPES	59.58 גרם	250 מ"מ
K 2 HPO 4	2.85 גר '	12.5 מ"מ
MgSO 4	3.08 גר '	12.5 מ"מ

טבלה 2: פתרון מתכון הצפת 1 L:

מוסיפים 1.98 גרם גלוקוז ל -100 מ"ל חיץ 10X KH ומביאים נפח סופי של 1 ל התאם osmolarity למצב הפיזיולוגיה ליד (~ 300) עם גלוקוז. מביאים pH 7.4 עם NaOH.

-	מסה	הריכוז הסופי
מאגר 10X KH	100 מ"ל	100 מ"ל
גלוקוז	1.98 גר '	11 mM
מביאים L 1
מביאים pH 7.4 עם NaOH
התאם osmolarity מצב פיזיולוגי קרוב (~ 300) עם גלוקוז.

לוח 3: פתרון מתכון Buffers אנזימים

	מסה	הריכוז הסופי
Collagenase Type II	25 מ"ג	0.05% (w / v)
פרוטאז XIV	10 מ"ג	0.02% (w / v)
^ נם	0.025 גרם	5 מ"מ
קרניטין	0.020 גרם	2 מ"מ
טאורין	0.031 גרם	5 מ"מ
חומצה גלוטמית	0.020 גרם	2 מ"מ
0.1 מ 'CaCl 2	12.5 UL	25 אממ
הצפת		מילוי 50 מ"ל

טבלה 4: פתרון מתכון ^ נם 25X / טאורין / BSA (B / T / B)

	מסה	הריכוז הסופי
^ נם	0.076 גרם	125 mM
טאורין	0.094 גרם	125 mM
BSA		0.1% (w / v)
הצפת		מלא עד 6 מ"ל

טבלה 5: פתרון מתכון B הצפת ו Buffers שטפי

מאגר:	ב	# 1	# 2	# 3
הוסף:
0.5 מ 'CaCl 2	0.4 מ"ל	0.1 מ"ל	.125 מ"ל	0.15 מ"ל
הריכוז הסופי של CaCl 2	1 mM	1 mM	1.25 mM	1.5 מ"מ
25X B / T / B	---	2 מ"ל	2 מ"ל	2 מ"ל
מאגר בנפח הסופי	200 מ"ל	50 מ"ל	50 מ"ל	50 מ"ל

לוח 6: פתרון מתכון מדיה culturing

2X סרום ללא מדיה (SFM)
		הריכוז הסופי
		(לאחר דילול)
קרניטין	0.099 גרם	10 מ"מ (5 מ"מ)
טאורין	0.063 גרם	10 מ"מ (5 מ"מ)
קריאטין	0.075 גרם	10 מ"מ (5 מ"מ)
אנטיביוטי / Antimycotic	0.5 מ"ל	1% (0.5%) (v / v)
Media 199	45 מ"ל	מילוי 50 מ"ל
1X SFM
		הריכוז הסופי
2X SFM	25 מ"ל	1X
Media 199		מילוי 50 מ"ל
1X מדיה סרום 5%
		הריכוז הסופי
2X SFM	25 מ"ל	1X
FBS	2.5 מ"ל	5% (V / V)
Media 199		מילוי 50 מ"ל

Discussion

הצעד הקריטי הוא המהירות שבה את הלב מבודד הוא תלה על מערכת זלוף. אורך תקופת עיכול אנזימטי עשוי להיות קצת שונה עבור כל חולדה. ההתאמה תלוי כמה רך הלב הופך לאחר תקופת סדירה של מערכת העיכול. ההתאוששות באיטיות של Ca ^{2 +} לאחר עיכול אנזים חיוני להשגת Ca ^{2 +-סובלנית} תאים בריאים.

עבור שפן ניסיונות, הפרוטוקול הוא זהה, למעט hyaluronidase משמש במקום פרוטאז XIV. בדרך כלל, אנו מוצאים את אחוז הראשונית של התאים החיים נמוכה עבור שפן ניסיונות לעומת חולדה, למרות שהם לשרוד רק עוד בתרבות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma-Aldrich	S6191
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P9666
MgSO4	Fluka	63068
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
CaCl2	Sigma-Aldrich	C7902
Heparin Sodium Salt	Sigma-Aldrich	H4784
Collagenase Type II	Worthington Biochemical	LS004176
Protease XIV	Sigma-Aldrich	P5147
2,3-Butanedione Monoxime (BDM)	Sigma-Aldrich	B0753
Carnitine	Sigma-Aldrich	C9500
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Glutamic Acid	Sigma-Aldrich	G1501
BSA	Sigma-Aldrich	A3294
Creatine	Sigma-Aldrich	C3630
Antibiotic	Cellgro	30-009-CI
Media 199	GIBCO, by Life Technologies	11150
FBS	Hyclone	SH30071.03
Laminin	BD Biosciences	354232
water bath	Fisher Scientific	15-462-5
variable flow chemical pump	Fisher Scientific	15-077-67
6-well culture plate	Corning	3516