성인 쥐 심장 Myocytes의 차 문화

Summary

본 논문에서 우리는 성인 쥐 심장 myocytes를 분리하고 문화에 전형 방법을 설명했다. Collagenase와 단백 분해 효소는 단일 myocytes을 소화하고 격리하는 데 사용됩니다. Myocytes는 대부분의 실험 요구 사항을 충족이 프로토콜을 따라 교양.

Abstract

교양 차 성인 쥐 심장 세포는 심장 혈관 연구에 중요한 모델 시스템입니다. 그럼에도 불구하고, 강력하고 실용적 교양 성인 myocytes의 설립은 많은 연구자에 대한 기술적 도전, 속도 - 제한 단계하실 수 있습니다. 여기 며칠 동안 문화에 가능한 남아 성인 쥐 심장 myocytes 높은 수율을 얻을 수있는 프로토콜을 설명했다. 마음은 낮은 칼슘 아래의 고립과 collagenase와 프로 테아제와 perfused입니다

Protocol

수술 부 I. 준비

1. 쥐의 수술 전날, 모든 솔루션 만들어진 특정하게하지만, 아직 효소를 추가하지 마십시오. 버퍼 A, B 및 세척 버퍼는 모든 저장하기 전에 불임에 대한 필터링해야합니다. 버퍼는 모든 4 ° C.에 보관해야
2. 6 - 잘 조직 문화 플레이트는 10-20 μg / 2 ML ML 1XSFM에서 laminin뿐만 아니라 전날과 도금해야합니다, 37 CO ₂ 배양기에서 ° C에서 저장해야합니다.
3. 수술 당일, 70 % 에탄올로 클램프, 가위, 그리고 집게를 살균하여 수술 악기를 준비하고 그들을 종이 타월에 말리면.
4. 0.5 ML의 헤파린 솔루션 (90 U / ML)로 가득 한 ML의 주사기는 준비가 이루어집니다.
5. 이제는 반대의 연동 펌프를 사용하여 70 % 에탄올을 통해 실행하여 재관류 장치를 세척하는 것이 좋습니다. 일단 에탄올과 rinsing 완료를 두 번 증류수로기구를 린스, 마침내 37 ° C 물에 목욕에 배치 비커에 수집을 통해 버퍼 A.와 흐름을 씻어.
6. 청소 재관류 장치를 준비하려면, 버퍼 B. 40 ML과 버퍼 및 왼쪽 주사기 튜브 40 ML과 오른쪽 주사기 튜브를 채울
7. 버퍼 장치를 통해 흐름을 허용하여 카테 테르의 끝에으로 국무 재관류 튜빙. 버퍼 40 ML 수준에 주사기로 리필. 이 단계 후 튜브에 갇혀 아무 공기 방울이 없습니다 있는지 확인합니다.
8. 자, 재관류 튜빙 이제 버퍼 B.와 함께 준비하는 것을 버퍼에게 주사기 꼭지 밸브를 닫고 같은 버퍼 B와 과정을 반복
9. 마지막으로, 재관류 장치는 버퍼 B 꼭지 밸브 개방과 왼쪽지만, 흐름과 IV 라인에있는 조절기를 사용하여 중지됩니다.
10. 수집 비커의 흐름 불구하고 버퍼를 폐기하십시오.
11. 수술하기 전에 할 마지막 것은 다른 솔루션은 전날 필터링 것처럼 효소 솔루션을 귀하의 재고 솔루션에 필요한 효소를 추가한 다음 필터를하는 것입니다. 일단 필터링이 솔루션은 실내 온도에서 남아있을 수 있습니다.

부 II. 랫 심장 해부

1. 다음과 같은 표준 프로토콜은 가스실에서 Isoflurane과 쥐를 안락사.
2. 70 % 에탄올로 흉부의 절개 영역을 소독.
3. 오픈 가슴은 가위를 사용하고 마음을 쉽게받을 수 있습니다.
4. 0.5 ML의 헤파린 솔루션 (90 U / ML)과 좌심실을 주사.
5. 얼음 차가운 버퍼 B.에서 대동맥 그대로, 장소의 많은 부분과 함께 마음을 제거

부 III. Myocytes 절연

1. 다음 절차가 제대로 붙어있다면 일반적인 쥐의 심장은 막대 모양 myocytes 높은 분수를 (같은 죽은 둥근 세포의 반대 의미) 양보해야합니다.
2. 시작하려면, 카테터에 대동맥을 겸자. 카테 테르의 끝에은 관상 동맥을 통해 심장의 좋은 재관류을 보장하기 위해 심장에 너무 많이 강요해서는 안됩니다.
3. 일단 채워, 봉합으로 카테 테르에 대동맥을 묶는.
4. 다음, 빠른 드립 속도 (~ 60 방울 / 분) 허용하고 마음을 씻어 버퍼 B을 허용하도록 IV 라인 조절기를 엽니다.
5. 버퍼 B 세척 동안 심방과 마음 기대며 어떤 지방이나 폐 조직을 제거하는 작은 가위와 집게를 사용합니다.
6. 버퍼 B가 완료되면, 버퍼 A.으로 흐름을 전환
7. 버퍼가 5 분 유량 수 있지만, 여러 작은 작업을 신속하게 수행하여야한다.
8. 첫째, 37 ° C의 물을 욕조에있는 효소 솔루션을 따뜻하게.
9. 마지막으로, 버퍼는 주사기 (하지만 튜브에있는 사람들)에서 소진되었을 때, 주사기의 효소 솔루션의 50 ML을 로드할 재관류 장치의
10. 이것은 효소 솔루션 perfuses 마음까지, 지금 모든 물 목욕 (pipetting)에서 회수 비커의 흐름을 통해 삭제하는 것이 필요합니다.
11. 즉시 효소 솔루션 마음을 perfuses로 주사기 A를 보충하기 위해 수집하는 비커에서 효소 솔루션을 전송하도록 설정됩니다 연동 펌프를 활성화
12. 10 분 대한 마음을 통해 흐름에 효소 솔루션을 허용합니다. 심장이 소화되면서, 그일은 부풀어보고 시작합니다.
13. 주사기에있는 효소 솔루션에 0.1 M CaCl ₂ 37.5 μL를 추가 0.1 MM 칼슘 ² 효과적인 농도를 제공 ^+.
14. 10 분 주사기에 0.1 M CaCl ₂ 추가 50 μL를 추가하여 0.2 mm까지 칼슘의 농도를 증가하고 재관류가 추가로 10 분 정도 진행하게되면.
15. 심실을 잘라 20 ML 효소 솔루션을 포함하는 작은 살균 비커로 전송할 수 있습니다.
16. 비커에 0.1 M CaCl ₂ 40보다 μL를 추가하여 0.4 mm까지 칼슘 농도를 높일 수 있습니다.
17. 부드럽게 작은 멸균 가위 10 개 이상의 조각으로 마음을 말하다.
18. 37 5 분 비커를 품어 ° C 부드러운 락을 함께.
19. 0.1 M CaCl ₂ 40 ML 추가0.6 MM 칼슘 ^{2 +의} 효과적인 농도를주고 부드럽게 플라스틱 전송 pipet 3-5 시간으로 심장 조각을 씹다.
20. 37 추가 5 분 잠복기 후에 ° C가 0.1 M CaCl ₂ 40 ML을 추가하고 부드럽게으로 이전 씹다.
21. 에서 별도의 소화 단일 myocytes 아닌 소화 멸균 500 μm의 메쉬를 통해 여과를 사용하여 결합 조직합니다.
22. 세포가 실온에서 10 분 동안 50 ML 튜브에 정착하도록 허용합니다.
23. 이전 pipet과 함께 뜨는 폐기하십시오.
24. 부드럽게 씻어 버퍼 # 1 세포를 resuspend하고 세포가 실온에서 10-20 분 정착하실 수 있습니다.
25. 세포가 적응하는 동안, 거꾸로 현미경 정지 세포의 품질과 경쟁력을 평가할 수있는 기회로 이번 작은 나누어지는을하고 사용합니다. 좋은 준비가 선명 강선과 같은 막대 세포의 높은 비율 (> 80 %)이 포함됩니다.
26. 세포가 정착되면, 워시 버퍼 # 2에 뜨는 부드럽게 resuspend 세포를 폐기하십시오. 세포가 상온에서 해결하자, 이것은 다시 10-20분을하고 뜨는을 폐기해야합니다.
27. 세탁 과정을 반복 한 번 씻으 버퍼 # 3, 그리고 세포로 더 많은 문화를 준비합니다.

부 IV. Myocyte 세포 배양

1. 부드럽게 5% 세럼 미디어 세포를 resuspend. 조직 배양 플레이트에 세포를 전송하기 전에, 1X SFM과 접시를 씻으십시오. 3-5시간에 대한 CO ₂ 조직 문화 인큐베이터에서 원하는 밀도와 부화에있는 세포를 전송합니다.
2. 1X SFM에 미디어를 전환합니다.
3. 셀은 4 일까지에 교양과 같은 실험에 필요한 사용할 수 있습니다.

부품 V. 대표 결과 / 성과

프로토콜이 올바르게 이루어집니다 거꾸로 현미경보다 70 % 라이브 심장 myocytes이 있어야합니다.

표 1 : 1 L에 대한 솔루션 요리법 10X 칼슘 ^{2 +} 무료 KH 버퍼 :

	질량	최종 농도
NaCl	68.96 g	1,180 MM
KCl	3.58 g	48 MM
HEPES	59.58 g	250 MM
K 2 HPO 4	2.85 g	12.5 MM
MgSO 4	3.08 g	12.5 MM

표 2 : 1 L 버퍼에 대한 솔루션 요리법 :

100 ML 10X KH 버퍼에 1.98 g의 포도당을 추가하고 포도당과 함께 근처 생리 상태 (~ 300)에 osmolarity를​​ 조정 한 L.의 최종 볼륨을 가져. NaOH와 산도 7.4을 가져와.

-	질량	최종 농도
10X KH 버퍼	100 ML	100 ML
포도당	1.98 g	11 MM
1 L 가져오기
NaOH와 산도 7.4 가져오기
포도당과 함께 근처의 생리적 조건 (~ 300)에 osmolarity를​​ 조정합니다.

표 3 : 효소 버퍼에 대한 솔루션 요리법

	질량	최종 농도
Collagenase 유형 II	25 MG	0.05 % (W / V)
프로 테아제 XIV	10 MG	0.02 % (W / V)
BDM	0.025 g	5 MM
Carnitine	0.020 g	2 MM
타우린	0.031 g	5 MM
글루탐산	0.020 g	2 MM
0.1 M CaCl 2	12.5 UL	25 UM
버퍼		50 ML에 작성

표 4 : 25X BDM / 타우린 / BSA (B / T / B)를위한 솔루션 요리법

	질량	최종 농도
BDM	0.076 g	125 MM
타우린	0.094 g	125 MM
BSA		0.1 % (W / V)
버퍼		6 ML에 작성

표 5 : 버퍼 B 및 씻으 버퍼에 대한 솔루션 요리법

버퍼 :	B	# 1	# 2	# 3
주소 :
0.5 M CaCl 2	0.4 ML	0.1 ML	0.125 ML	0.15 ML
CaCl 2 농도 최종	1 ㎜	1 ㎜	1.25 MM	1.5 MM
25X B / T / B	---	2 ML	2 ML	2 ML
로 최종 볼륨을 버퍼	200 ML	50 ML	50 ML	50 ML

표 6 : Culturing 미디어를위한 솔루션 레시피

2X 세럼 - 무료 미디어 (SFM)
		최종 농도
		(희석 이후)
Carnitine	0.099 g	10 MM (5 ㎜)
타우린	0.063 g	10 MM (5 ㎜)
크레아틴	0.075 g	10 MM (5 ㎜)
Antimycotic / 항생제	0.5 ML	1퍼센트 (0.5 %) (V / V)
미디어 199	45 ML	50 ML에 작성
1X SFM
		최종 농도
2X SFM	25 ML	1X
미디어 199		50 ML에 작성
1X 5% 세럼 미디어
		최종 농도
2X SFM	25 ML	1X
FBS	2.5 ML	5 % (V / V)
미디어 199		50 ML에 작성

Discussion

중요한 단계는 고립된 마음이 재관류 시스템에 걸려있는 속도입니다. 효소 소화 기간의 길이는 각 쥐에 대해 약간 다를 수 있습니다. 조정은 마음이 소화의 일반 기간이 지난 후된다 얼마나 부드러 운지에 따라 달라집니다. 천천히 소화 효소가 ⁺ - 관용 건강한 세포 ^{칼슘이를위한} 필수 ⁺ 후 칼슘 ² 복구.

hyaluronidase는 단백 분해 효소 XIV 대신 사용 제외 기니 돼지의 경우, 프로토콜은 동일합니다. 그들은 단지 한 문화에서 살아남기 있지만 일반적으로, 우리는 살아있는 세포의 그 초기 비율 쥐에 비해 실험용 돼지에 대한 낮은 찾습니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma-Aldrich	S6191
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P9666
MgSO4	Fluka	63068
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
CaCl2	Sigma-Aldrich	C7902
Heparin Sodium Salt	Sigma-Aldrich	H4784
Collagenase Type II	Worthington Biochemical	LS004176
Protease XIV	Sigma-Aldrich	P5147
2,3-Butanedione Monoxime (BDM)	Sigma-Aldrich	B0753
Carnitine	Sigma-Aldrich	C9500
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Glutamic Acid	Sigma-Aldrich	G1501
BSA	Sigma-Aldrich	A3294
Creatine	Sigma-Aldrich	C3630
Antibiotic	Cellgro	30-009-CI
Media 199	GIBCO, by Life Technologies	11150
FBS	Hyclone	SH30071.03
Laminin	BD Biosciences	354232
water bath	Fisher Scientific	15-462-5
variable flow chemical pump	Fisher Scientific	15-077-67
6-well culture plate	Corning	3516