Summary
在本文中，我们描述了一个典型的成年大鼠心脏心肌细胞分离和培养。胶原酶和蛋白酶消化，分离单个心肌细胞。心肌细胞培养遵守此协议满足大多数实验要求。
Abstract
原代培养成年啮齿类动物的心脏细胞，心血管研究的一个重要的模型系统。不过，建立强大的，可行的的培养成人心肌细胞可以在技术上具有挑战性的，速率限制，许多研究者的一步。在这里，我们描述了一个协议，以获得一个可行的几天停留在文化的成年大鼠心脏心肌细胞的高产。心是孤立的，与胶原酶和蛋白酶灌注下低钙
Protocol
部分一，准备进行手术
- 大鼠手术的前一天，确信所有的解决方案，但不添加任何酶。缓冲器A，B和洗涤缓冲液都应该被过滤为不育之前存储。缓冲区都应该保存在4 ° C
- 10-20微克/毫升层粘连蛋白在2 mL 1XSFM以及前一天必须镀有6孔组织培养板，并应存放在37 ° C中的CO 2培养箱。
- 在手术当天，准备用70％乙醇消毒钳，剪刀，镊子，手术器械，并让他们干纸巾。
- 充满0.5 ml肝素溶液（90 U / ml）的1 mL注射器准备。
- 现在是很好的做法，灌注设备的运行，通过70％的乙醇，使用逆蠕动泵洗。完成后用乙醇冲洗，用双蒸水冲洗设备，最后再冲洗干净用缓冲液A的流量，通过在37℃水浴中放置了一个烧杯收集。
- 要准备清洗的灌注设备，填补40毫升缓冲液A和左边的注射器管40毫升的缓冲B.正确的注射器管
- 总理灌注管的导管，使缓冲液A流经仪器提示。填充到缓冲区的40毫升的注射器。确保没有空气气泡被困在管这一步后。
- 现在，关闭缓冲区注射器活塞阀，并用缓冲液B等重复的过程，灌注管现在准备用缓冲液B。
- 最后，灌注设备是用缓冲液B活塞阀打开，但流停止使用稳压器，四线。
- 丢弃在收集烧杯的缓冲流虽然。
- 手术前做的最后一件事情是添加所需的酶原液，然后过滤酶液，就像其他的解决方案筛选的前一天。过滤后，该解决方案可以在室温下。
第二部分。大鼠心脏解剖
- 下列标准协议安乐死与异氟醚对大鼠在毒气室。
- 消毒用70％乙醇的胸部切口的面积。
- 用剪刀开胸，暴露心脏。
- 注入0.5 ml肝素溶液（90 U / mL）的左心室。
- 取出心脏主动脉完好无损，地方大部份在冰冷的缓冲B.
第三部分。心肌细胞隔离
- 如果下面的过程是正确地坚持一个典型的大鼠心脏应该产生一个杆状的心肌细胞的高分数（而不是死四舍五入细胞）。
- 首先，钳主动脉导管。推入心导管尖端不应太远，以确保通过冠状动脉灌注对心脏有好处。
- 一旦夹住，领带主动脉导管一期缝合。
- 接下来，打开四线调节器，允许快速滴速（〜60滴/ min），并允许缓冲液B洗心。
- 在缓冲液B洗，用小剪刀和镊子去除心房和执着心的任何脂肪或肺组织。
- 缓冲液B完成后，切换流缓冲液A
- 虽然缓冲区，一个是允许流量为5分钟，几个小任务，应迅速执行。
- 首先，温暖的酶液在37℃水浴。
- 最后，当一个缓冲区是从注射器（但目前仍然在管）耗尽，负载在注射器50毫升酶液的灌注设备
- 现在有必要放弃所有的流量通过从收集烧杯中，水浴（吹打），直到酶液perfuses心。
- 只要酶液perfuses心，激活设置从收集烧杯转移酶液，以补充注射器答：蠕动泵
- 允许的酶液，通过心脏的流量为10分钟。心消化，它开始显得臃肿。
- 添加37.5μL0.1 M的氯化钙2酶液在注射器一个有效浓度为0.1毫米的Ca 2 +。
- 10分钟后，钙离子浓度增加至0.2毫米，通过增加一个额外的50μL0.1 M的氯化钙 2注射器，让灌注为10分钟出发。
- 切断心室，并转移到一个小的无菌烧杯中含有20毫升酶液。
- 在烧杯中的钙离子浓度增加至0.4毫米，加入40μL0.1 M的氯化钙 2 。
- 轻轻剁碎成10个或更多件的心，一双小无菌剪刀。
- 5分钟的烧杯在37℃，温和的摇摆。
- 加入40毫升0.1 M的氯化钙2有效浓度为0.6毫米的Ca 2 +和心片轻轻磨碎，用塑料转移吸管3-5倍。
- 一个额外的5分钟的孵化后，在37 ° C，加入40毫升0.1 M 的氯化钙2，轻轻磨碎像以前那样。
- 单独的消化，从单一的心肌细胞非消化结缔组织，通过无菌500微米网使用的过滤。
- 允许细胞在室温下10分钟在50毫升管定居。
- 倒掉上清转移吸管。
- 轻轻重悬在洗涤缓冲液＃1中的细胞，让细胞在室温为10-20分钟解决。
- 虽然细胞沉淀，取一小等份，并使用这个时候，作为一个机会来评估一个倒置显微镜下，悬浮液中的细胞的质量和可行性。一个很好的准备，将有一个高杆像清脆的条纹细胞的比例（> 80％）。
- 一旦细胞相继落户，弃上清，轻轻悬浮细胞洗涤缓冲液＃2。让细胞在室温下解决，这应该再次需要10-20分钟，并弃去上清液。
- 再次重复洗涤过程中洗涤缓冲液＃3，细胞将文化准备。
第四部分。心肌细胞培养
- 轻轻重悬细胞在5％的血清媒体。在转让细胞组织培养板之前，用1X可持续森林管理的板块。转移细胞所需的密度和中的CO 2组织培养孵化器的孵化，为3-5小时。
- 媒体切换到1X可持续森林管理。
- 细胞可培养四天，用来作为实验的要求。
第五部分代表性的结果/成果
应该有70％以上，在倒置显微镜下活的心时，该协议是正确的心肌细胞。
表1：溶液配方为1升10倍的Ca 2 +无KH缓冲液 ：
| 质量 | 终浓度 | |
| 氯化钠 | 68.96摹 | 1180 mM的 |
| 氯化钾 | 3.58摹 | 48毫米 |
| HEPES | 59.58摹 | 250毫米 |
| K 2 HPO 4 | 2.85摹 | 12.5毫米 |
| 硫酸镁 | 3.08摹 | 12.5毫米 |
表2：1升缓冲液A的溶液配方 ：
添加1.98克葡萄糖100毫升10X锦缓冲区，并携带一个1升的最后体积与葡萄糖的渗透压调节到接近生理条件下（〜300）。带来的pH值用NaOH 7.4。
| - | 地下 | 终浓度 |
| 10X KH缓冲 | 100毫升 | 100毫升 |
| 血糖 | 1.98摹 | 11毫米 |
| 置于1升 | ||
| 置于pH值用NaOH 7.4 | ||
| 调整渗透压接近生理条件下与葡萄糖（〜300）。 | ||
表3：酶缓冲液的解决方案处方
| 质量 | 终浓度 | |
| 二型胶原酶 | 25毫克 | 0.05％（W / V） |
| 蛋白酶第十四 | 10毫克 | 0.02％（W / V） |
| BDM | 0.025摹 | 5毫米 |
| 肉碱 | 0.020摹 | 2毫米 |
| 牛磺酸 | 0.031摹 | 5毫米 |
| 谷氨酸 | 0.020摹 | 2毫米 |
| 0.1 M的氯化钙2 | 12.5微升 | 25 UM |
| 缓冲液A | 填充至50 ml |
表四：解决方案处方25X BDM /牛磺酸/ BSA（B / T / B）
| 质量 | 终浓度 | |
| BDM | 0.076摹 | 125毫米 |
| 牛磺酸 | 0.094摹 | 125毫米 |
| 牛血清白蛋白 | 0.1％（W / V） | |
| 缓冲液A | 填充至6 ml |
表5：缓冲区B和清洗缓冲的解决方案处方
| 缓冲液： | 乙 | ＃1 | ＃2 | ＃3 |
| 地址： | ||||
| 0.5 M的氯化钙2 | 0.4毫升 | 0.1毫升 | 0.125毫升 | 0.15毫升 |
| 氯化钙终浓度为2 | 1毫米 | 1毫米 | 1.25毫米 | 1.5毫米 |
| 25X B / T / B | --- | 2毫升 | 2毫升 | 2毫升 |
| 缓冲到最终卷 | 200毫升 | 50毫升 | 50毫升 | 50毫升 |
表6：培养媒体的解决方案处方
| 2X无血清培养基（SFM）， | ||
| 终浓度 | ||
| （稀释后） | ||
| 肉碱 | 0.099摹 | 10毫米（5毫米） |
| 牛磺酸 | 0.063摹 | 10毫米（5毫米） |
| 肌酸 | 0.075摹 | 10毫米（5毫米） |
| 抗生素/ Antimycotic | 0.5毫升 | 1％（0.5％）（V / V） |
| 媒体199 | 45毫升 | 填充至50 mL |
| 1X可持续森林管理 | ||
| 终浓度 | ||
| 2X可持续森林管理 | 25毫升 | 1X |
| 媒体199 | 填充至50 mL | |
| 1X血清媒体5％ | ||
| 终浓度 | ||
| 2X可持续森林管理 | 25毫升 | 1X |
| 胎牛血清 | 2.5毫升 | 5％（V / V） |
| 媒体199 | 填充至50 mL |
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Discussion
关键的一步，这是挂在离体心脏灌注系统的速度。酶消化期的长短可能会有点不同的各组大鼠。调整取决于软心定期的消化期后成为。 “缓慢复苏的Ca 2 +内切酶消化后获得的Ca 2 +宽容健康的细胞至关重要。
豚鼠，该协议是相同的，除了透明质酸是第十四蛋白酶，而不是使用。通常情况下，我们发现，最初的活细胞百分比是豚鼠至大鼠相比，虽然他们生存，仅仅只要在文化。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P9666 | |
| MgSO4 | Fluka | 63068 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Carnitine | Sigma-Aldrich | C9500 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Creatine | Sigma-Aldrich | C3630 | |
| Antibiotic | Cellgro | 30-009-CI | |
| Media 199 | GIBCO, by Life Technologies | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Laminin | BD Biosciences | 354232 | |
| water bath | Fisher Scientific | 15-462-5 | |
| variable flow chemical pump | Fisher Scientific | 15-077-67 | |
| 6-well culture plate | Corning | 3516 |
References
- Miriyala, J., Nguyen, T., Yue, D. T., Colecraft, H. M. Role of CaVbeta subunits, and lack of functional reserve, in protein kinase A modulation of cardiac CaV1.2 channels. Circ Res. 102 (7), e54-e64 (2008).
- SX, T. akahashi, Mittman, S., Colecraft, H. M. Distinctive modulatory effects of five human auxiliary beta2 subunit splice variants on L-type calcium channel gating. Biophys. , 84-845 (2003).
