Summary
Dans ce papier, nous avons décrit d'une manière typique à isoler et cultiver les myocytes cardiaques de rat adulte. Collagénase et la protéase sont utilisés pour digérer et d'isoler les myocytes unique. Myocytes cultivés suivre ce protocole répondent aux exigences les plus expérimenter.
Abstract
Culture primaire de cellules adultes rongeurs cœur sont un système modèle important pour la recherche cardiovasculaire. Néanmoins, l'établissement de solides, viables myocytes adultes cultivés peut être un défi technique, étape limitante de nombreux chercheurs. Ici, nous avons décrit un protocole pour obtenir un rendement élevé d'adultes myocytes cardiaques de rat qui demeurent viables en culture pendant plusieurs jours. Le cœur est isolé et perfusé avec de la collagénase et la protéase sous faible teneur en Ca
Protocol
Préparation pour la chirurgie de la partie I.
- La veille de la chirurgie chez le rat, assurez-vous que toutes les solutions sont faites, mais n'ajoutez pas encore les enzymes. Tampons A, B et le tampon de lavage devraient tous être filtrée pour la stérilité avant le stockage. Les tampons devraient tous être conservés à 4 ° C.
- Plaques de 6 puits de culture de tissus doivent être plaqués avec 10-20 mg / ml de laminine dans 2 mL 1XSFM la veille aussi, et doivent être conservés à 37 ° C dans un incubateur à CO 2.
- Le jour de la chirurgie, la préparation des instruments chirurgicaux en stérilisant la pince, ciseaux, pinces et de l'éthanol à 70% et laissez-les sécher sur du papier absorbant.
- Une seringue de 1 ml remplie de 0,5 ml solution d'héparine (90 U / ml) est prêt.
- Maintenant, il est de bonne pratique pour laver l'appareil de perfusion en parcourant 70% d'éthanol, en utilisant la pompe péristaltique dans le sens inverse. Une fois terminé le rinçage avec de l'éthanol, rincer l'appareil avec de l'eau bidistillée, et enfin rincer avec le tampon A. Le débit à travers est recueillie dans un bêcher placé dans un bain à 37 ° C l'eau.
- Pour préparer l'appareil de perfusion nettoyer, remplir le tube droit avec une seringue de 40 ml de tampon A et le tube gauche avec une seringue de 40 ml de tampon B.
- Premier de la tubulure de perfusion à l'extrémité du cathéter, en permettant aux flux de tampon A travers l'appareil. Recharge de la mémoire tampon d'une seringue pour le niveau 40 ml. Assurez-vous qu'il n'ya pas de bulles d'air piégées dans la tubulure après cette étape.
- Maintenant, fermez le robinet vanne de tampon A seringue et répétez le processus avec tampon B de telle sorte que la tubulure de perfusion est maintenant amorcée avec le tampon B.
- Enfin, le dispositif de perfusion est laissé avec le tampon B robinet ouvert la vanne, mais avec l'écoulement a cessé d'utiliser le régulateur sur la ligne IV.
- Jeter le tampon accréditives dans le bécher de collecte.
- La dernière chose à faire avant la chirurgie est d'ajouter les enzymes nécessaires à votre solution de réserve, puis filtrer la solution enzymatique tout comme les autres solutions ont été filtrées de la veille. Une fois filtrée, cette solution peut être laissé à température ambiante.
Partie II. La dissection du cœur de rat
- Après le protocole standard euthanasier le rat avec de l'isoflurane dans une chambre à gaz.
- Stériliser la zone d'incision sur le thorax avec de l'éthanol à 70%.
- Ouvrez la poitrine à l'aide de ciseaux et d'exposer le cœur.
- Injecter ventricule gauche, avec la solution de 0,5 ml d'héparine (90 U / ml).
- Retirer le cœur avec grande portion de l'aorte intacte, le placer dans la glace froide B. Tampon
Partie III. L'isolement des myocytes
- Un cœur de rat typique devrait donner une fraction élevée de la tige en forme de myocytes (par opposition aux cellules mortes arrondi) si la procédure suivante est correctement respectée.
- Pour commencer, pince aorte pour le cathéter. L'extrémité du cathéter ne doit pas être poussée trop loin dans le coeur afin d'assurer une bonne perfusion du cœur par l'artère coronaire.
- Une fois serré, la cravate de l'aorte au cathéter avec une suture.
- Ensuite, ouvrez le régulateur ligne IV pour permettre à un taux d'égouttement rapide (~ 60 gouttes / min) et permettre tampon B pour laver le cœur.
- Pendant Tampon B laver, utiliser les petits ciseaux et des pinces pour enlever les oreillettes et les tissus adipeux ou des poumons s'accrochant au cœur.
- Après tampon B est fini, passer le flux au tampon A.
- Alors que le tampon A est autorisé à circuler pendant 5 minutes, plusieurs petites tâches doivent être réalisées très rapidement.
- Tout d'abord, chauffer la solution enzymatique dans un bain d'eau à 37 ° C.
- Enfin, lorsque le tampon A est épuisée de la seringue (mais toujours présents dans le tube), une charge de 50 ml de la solution enzymatique dans la seringue A de l'appareil de perfusion
- Il est maintenant nécessaire de jeter tous les flux à travers le gobelet dans le bain d'eau (par pipetage), jusqu'à ce que le coeur perfuse Solution enzymatique.
- Dès que la solution enzymatique perfuse le cœur, d'activer la pompe péristaltique qui est mis en place pour transférer la solution enzymatique du bécher collecte pour reconstituer la seringue A.
- Laisser la solution enzymatique de circuler à travers le coeur pendant 10 min. Comme le cœur digère, elle commence à regarder de ballonnement.
- Ajouter 37,5 ul de 0,1 M CaCl 2 à la solution enzymatique dans la seringue A pour donner une concentration effective de 0,1 mM de Ca 2 +.
- Après 10 minutes d'augmenter la concentration de calcium à 0,2 mM en ajoutant un supplément de 50 ul de 0,1 M CaCl 2 à la seringue A et laissez-la perfusion procéder pour encore 10 minutes.
- Coupez les ventricules et les transférer à un petit bécher stérile contenant 20 ml de solution enzymatique.
- Dans le bécher augmenter la concentration de calcium à 0,4 mm par ajout de 40 uL plus de 0,1 M CaCl 2.
- Doucement mâche le cœur en 10 pièces ou plus avec une paire de petits ciseaux stériles.
- Incuber le bécher pendant 5 minutes à 37 ° C avec doux balancement.
- Ajouter 40 ml de 0,1 M CaCl 2 àdonner à la concentration effective de 0,6 mM de Ca 2 + et doucement triturer les morceaux du cœur avec une pipette de transfert en plastique 3-5 fois.
- Après une incubation de 5 minutes supplémentaires à 37 ° C, ajouter 40 ml de 0,1 M CaCl 2 et doucement triturer comme avant.
- Séparée digérés myocytes unique à partir de non-digérée en utilisant des tissus conjonctifs filtration à travers un grillage stériles 500 um.
- Laisser les cellules sédimenter dans un tube de 50 ml pendant 10 minutes à température ambiante.
- Rejeter le surnageant avec une pipette de transfert.
- Resuspendre délicatement les cellules dans le tampon de lavage n ° 1 et permettre aux cellules de se contenter de 10-20 min à température ambiante.
- Alors que les cellules sont de décantation, de prendre une petite aliquote, et utiliser ce temps comme une occasion d'évaluer la qualité et la viabilité des cellules en suspension sous un microscope inversé. Une bonne préparation aura une proportion élevée (> 80%) de la tige comme des cellules avec des stries nettes.
- Une fois que les cellules se sont installés, jeter le surnageant des cellules et doucement remettre en suspension dans le tampon de lavage n ° 2. Laissez-les cellules de régler à la température ambiante, ce qui devrait à nouveau prendre 10-20 minutes, et jeter le surnageant.
- Répétez le processus de lavage une fois de plus avec le tampon de lavage n ° 3, et les cellules seront prêtes pour la culture.
Partie IV. Culture cellulaire des myocytes
- Resuspendre délicatement les cellules dans 5% des médias du sérum. Avant de transférer les cellules à plaques de culture tissulaire, se laver les plaques avec 1x GDF. Transférer les cellules à une densité désirée et incuber dans un CO 2 de culture de tissu incubateur pour 3-5 heures.
- Commutateur les médias à 1x GDF.
- Les cellules peuvent être cultivées pour un maximum de quatre jours et utilisés au besoin pour les expériences.
Partie V. Représentant Résultats / Résultats
Il devrait y avoir plus de 70% des myocytes cardiaques vivent sous microscope inversé lorsque le protocole est fait correctement.
Tableau 1: Recette de solution pour 1 L 10X Ca 2 + sans tampon KH:
| de masse | Concentration finale | |
| NaCl | 68,96 g | 1180 mm |
| KCl | 3,58 g | 48 mM |
| HEPES | 59,58 g | 250 mM |
| K 2 HPO 4 | 2,85 g | 12,5 mM |
| MgSO 4 | 3,08 g | 12,5 mM |
Tableau 2: Recette de solution pour une mémoire tampon L A:
Ajouter 1,98 g de glucose à 100 mL de tampon KH 10X et porter à un volume final de 1 L. Ajuster osmolarité à l'état de la physiologie proche (~ 300) avec du glucose. Amener à pH 7,4 avec NaOH.
| - | Masse | Concentration finale |
| Tampon 10X KH | 100 ml | 100 ml |
| Le glucose | 1,98 g | 11 mM |
| Porter à 1 L | ||
| Amener à pH 7,4 avec NaOH | ||
| Ajustez osmolarité à l'état physiologique proche (~ 300) avec du glucose. | ||
Tableau 3: Recette Solution pour tampons enzymatiques
| de masse | Concentration finale | |
| Collagénase de type II | 25 mg | 0,05% (p / v) |
| Protéase XIV | 10 mg | 0,02% (p / v) |
| BDM | 0,025 g | 5 mM |
| Carnitine | 0,020 g | 2 mM |
| Taurine | 0,031 g | 5 mM |
| L'acide glutamique | 0,020 g | 2 mM |
| 0,1 M CaCl 2 | 12,5 uL | 25 uM |
| Tampon A | Remplissez à 50 ml |
Tableau 4: Recette Solution pour 25X BDM / taurine / BSA (B / T / B)
| de masse | Concentration finale | |
| BDM | 0,076 g | 125 mM |
| Taurine | 0,094 g | 125 mM |
| BSA | 0,1% (p / v) | |
| Tampon A | Remplissez à 6 mL |
Tableau 5: Recette Solution B Tampon et tampons de lavage
| Tampon: | B | # 1 | # 2 | # 3 |
| Ajouter: | ||||
| 0,5 M CaCl 2 | 0,4 ml | 0,1 ml | 0,125 ml | 0,15 mL |
| La concentration finale de CaCl 2 | 1 mM | 1 mM | 1,25 mM | 1,5 mM |
| 25X B / T / B | --- | 2 ml | 2 ml | 2 ml |
| Un volume tampon pour la finale | 200 ml | 50 ml | 50 ml | 50 ml |
Tableau 6: Recette Solution for Media Culture
| 2X milieu sans sérum (SFM) | ||
| Concentration finale | ||
| (Après dilution) | ||
| Carnitine | 0,099 g | 10 mM (5 mM) |
| Taurine | 0,063 g | 10 mM (5 mM) |
| Créatine | 0,075 g | 10 mM (5 mM) |
| Antibiotique / antimycotique | 0,5 ml | 1% (0,5%) (v / v) |
| Media 199 | 45 ml | Remplissez à 50 mL |
| 1X GDF | ||
| Concentration finale | ||
| 2X GDF | 25 ml | 1X |
| Media 199 | Remplissez à 50 mL | |
| 1X 5% de sérum médias | ||
| Concentration finale | ||
| 2X GDF | 25 ml | 1X |
| FBS | 2,5 ml | 5% (v / v) |
| Media 199 | Remplissez à 50 mL |
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Discussion
Une étape essentielle est la vitesse avec laquelle le cœur isolé est accroché sur le système de perfusion. La longueur de la période de digestion enzymatique peut être un peu différent pour chaque rat. L'ajustement dépend de la manière douce le cœur devient après la période régulière de la digestion. La reprise lente de Ca 2 + après digestion enzymatique est essentielle pour l'obtention de Ca 2 +-tolérants aux cellules saines.
Pour cochon de Guinée, le protocole est le même sauf hyaluronidase est utilisé au lieu de la protéase XIV. Typiquement, on trouve le pourcentage initial de cellules vivantes est faible pour les porcs Guinée par rapport à rat, bien qu'ils survivent aussi longtemps dans la culture.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P9666 | |
| MgSO4 | Fluka | 63068 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Carnitine | Sigma-Aldrich | C9500 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Creatine | Sigma-Aldrich | C3630 | |
| Antibiotic | Cellgro | 30-009-CI | |
| Media 199 | GIBCO, by Life Technologies | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Laminin | BD Biosciences | 354232 | |
| water bath | Fisher Scientific | 15-462-5 | |
| variable flow chemical pump | Fisher Scientific | 15-077-67 | |
| 6-well culture plate | Corning | 3516 |
References
- Miriyala, J., Nguyen, T., Yue, D. T., Colecraft, H. M. Role of CaVbeta subunits, and lack of functional reserve, in protein kinase A modulation of cardiac CaV1.2 channels. Circ Res. 102 (7), e54-e64 (2008).
- SX, T. akahashi, Mittman, S., Colecraft, H. M. Distinctive modulatory effects of five human auxiliary beta2 subunit splice variants on L-type calcium channel gating. Biophys. , 84-845 (2003).
