Summary
In diesem Papier haben wir beschrieben, eine typische Art und Weise zu isolieren und Kultur erwachsenen Ratte Herz Myozyten. Collagenase und Protease werden verwendet, um zu verdauen und zu isolieren einzelnen Myozyten. Myozyten kultivierten folgen Sie diesem Protokoll erfüllen die meisten Anforderungen Experiment.
Abstract
Cultured primäre erwachsenen Nagetieren Herzzellen sind ein wichtiges Modellsystem für Herz-Kreislauf-Forschung. Dennoch können Etablierung von robusten, tragfähigen kultivierten adulten Myozyten eine technisch anspruchsvolle, geschwindigkeitsbestimmenden Schritt für viele Forscher. Hier haben wir beschrieben, ein Protokoll zu einer hohen Ausbeute an erwachsenen Ratte Herz Myozyten, die lebensfähig bleiben in der Kultur für mehrere Tage zu erhalten. Das Herz ist isoliert und perfundiert mit Kollagenase und Protease unter niedrigen Ca
Protocol
Teil I. Vorbereitung für die Chirurgie
- Am Tag vor der Ratte Chirurgie, stellen Sie sicher, dass alle Lösungen hergestellt werden, aber fügen Sie keine Enzyme noch. Puffer A, B und der Waschpuffer sollten alle für die Sterilität gefiltert werden, bevor Lagerung. Die Puffer sollten alle bei 4 ° C gelagert werden
- 6-well-Zellkulturplatten muss mit 10-20 pg / mL Laminin in 2 mL 1XSFM am Vortag sowie beschichtet werden, und sollte bei 37 ° C in einem CO 2-Inkubator gelagert werden.
- Am Tag der Operation, bereiten die chirurgischen Instrumente durch Sterilisieren der Klemme, Schere, Pinzette und mit 70% Ethanol und lassen Sie sie auf Küchenpapier trocknen.
- Einer 1 ml Spritze mit 0,5 ml Heparin-Lösung (90 U / ml) gefüllt ist fertig.
- Nun ist es gute Praxis, die Perfusionsapparatur, indem Sie durch 70% Ethanol, mit der Schlauchpumpe in umgekehrter waschen. Sobald Sie fertig sind Spülen mit Ethanol, spülen Sie die Geräte mit doppelt destilliertem Wasser und schließlich mit Puffer A. spülen Der Durchfluss wird in einem Becherglas in einem 37 ° C Wasserbad gestellt gesammelt.
- Zur Vorbereitung der Reinigung Perfusionsapparatur, füllen Sie die richtige Spritze Rohr mit 40 ml Puffer A und die linke Spritze Rohr mit 40 ml Puffer B
- Prime der Infusionsschlauch an der Spitze des Katheters, indem Buffer A durch die Vorrichtung fließen. Refill, um den Puffer Eine Spritze, die 40 mL Ebene. Stellen Sie sicher, es gibt keine Luftblasen in den Schlauch nach diesem Schritt gefangen.
- Jetzt, in der Nähe des Puffers A Spritze Absperrhahnventil und wiederholen Sie den Vorgang mit Puffer B, so dass die Infusionsschlauch ist jetzt mit Puffer B grundiert
- Schließlich ist die Perfusionsapparatur mit dem Buffer B Absperrhahn offen gelassen, aber mit der Strömung gestoppt mit dem Regler auf der IV-Leitung.
- Entsorgen Sie die Puffer fließen, wenn auch in der Sammlung Becher.
- Das letzte, was vor der Operation besteht darin, die benötigten Enzyme zu Ihrem Stammlösung hinzufügen und dann filtern Sie die Enzymlösung ebenso wie die anderen Lösungen wurden filtriert am Vortag. Sobald gefiltert, kann diese Lösung bei Raumtemperatur stehen gelassen werden.
Part II. Der Rat Herzen Dissektion
- Nach Standardprotokoll euthanize der Ratte mit Isofluran in einer Gaskammer.
- Sterilisieren der Schnitt-Bereich auf den Brustkorb mit 70% Ethanol.
- Öffnen Brust mit einer Schere und setzen Herzen.
- Inject linken Ventrikel mit 0,5 mL Heparin-Lösung (90 U / mL).
- Nehmen Sie Herz mit großer Teil der Aorta intakt, in eiskaltem Puffer B
Teil III. Myozyten Isolation
- Eine typische Ratte Herz sollte einen hohen Anteil an stäbchenförmigen Myozyten (im Gegensatz zu toten Zellen abgerundet Gegensatz), wenn die folgende Prozedur ist korrekt eingehalten werden.
- Um zu beginnen, Klemme Aorta, um den Katheter. Die Spitze des Katheters sollte nicht zu weit in das Herz geschoben werden, um gute Durchblutung des Herzens durch die Herzkranzgefäße zu gewährleisten.
- Einmal eingespannt, binden die Aorta, den Katheter mit einer Naht.
- Dann öffnen Sie den IV-Leitung Regler, um eine schnelle Tropfgeschwindigkeit (~ 60 Tropfen / min) ermöglichen und damit Buffer B zum Auswaschen des Herzens.
- Während Buffer B waschen, verwenden Sie die kleine Schere und Pinzette, um den Vorhöfen und keine Fett-oder Lungengewebe Festhalten an dem Herzen zu entfernen.
- Nach Buffer B beendet ist, schalten Sie den Fluss, um Buffer A.
- Während Buffer A darf für 5 Minuten fließen, sollten mehrere kleine Aufgaben schnell durchgeführt werden.
- First, warm die Enzymlösung in einem 37 ° C Wasserbad.
- Schließlich, als Puffer A von der Spritze (aber immer noch im Schlauch) aufgebraucht ist, laden Sie 50 mL der Enzymlösung in Spritze A der Perfusionsapparatur
- Es ist nun notwendig, alle Flow-Through aus der Sammlung Becherglas im Wasserbad (mit einer Pipette) zu verwerfen, bis die Enzymlösung perfundiert Herzen.
- Sobald der Enzymlösung Herzen durchblutet, aktivieren Sie die Schlauchpumpe, die bis zum Enzymlösung aus dem Sammelbehälter Becher Transfer Spritze A. aufzufüllen eingestellt
- Lassen Sie die Enzymlösung durch das Herz für 10 min fließen. Als Herzstück verdaut, beginnt es zu sehen aufgedunsen.
- Add 37,5 &mgr; l 0,1 M CaCl 2 der Enzymlösung in Spritze A, um eine wirksame Konzentration von 0,1 mM Ca 2 + geben.
- Nach 10 Minuten erhöhen die Konzentration von Calcium bis 0,2 mM, indem eine zusätzliche 50 &mgr; l 0,1 M CaCl 2 bis Spritze A und lassen Sie die Perfusion für weitere 10 Minuten gehen.
- Schneiden Sie die Herzkammern und den Transfer zu einem kleinen sterilen Becherglas mit 20 mL Enzymlösung.
- In das Becherglas Erhöhung der Calcium-Konzentration auf 0,4 mM durch Zugabe von 40 mehr &mgr; l 0,1 M CaCl 2.
- Gently mince das Herz in 10 oder mehr Stücke mit ein Paar kleinen sterilen Schere.
- Inkubieren Sie die Becher für 5 Minuten bei 37 ° C unter leichtem Schütteln.
- 40 ml von 0,1 M CaCl 2 zugeben wirksame Konzentration von 0,6 mM Ca 2 + und sanft verreiben Herzen Stücke mit einer Kunststoff-Transfer-Pipette 3-5 mal.
- Nach Inkubation für weitere 5 Minuten bei 37 ° C, 40 ml von 0,1 M CaCl 2 und sanft wie zuvor verreiben.
- Separate verdaut einzelnen Myozyten aus nicht verdaut Bindegewebe mit Filtration durch einen sterilen 500 um Maschenweite.
- Lassen Sie die Zellen in einer 50 ml Tube für 10 Minuten bei Raumtemperatur zu regeln.
- Überstand mit einer Pipette übertragen.
- Vorsichtig die Zellen in Waschpuffer # 1 und damit die Zellen für 10-20 min bei Raumtemperatur zu regeln.
- Während die Zellen Abrechnung sind, nehmen Sie eine kleine Teilmenge, und diese Zeit nutzen, als Chance, die Qualität und die Lebensfähigkeit der Zellen in Suspension unter einem inversen Mikroskop zu beurteilen. Eine gute Vorbereitung haben einen hohen Anteil (> 80%) der Stange, wie Zellen mit knusprigen Streifen.
- Sobald die Zellen angesiedelt haben, den Überstand verwerfen und sanft die Zellen in Waschpuffer # 2. Lassen Sie die Zellen bei Raumtemperatur zu regeln, sollte die wiederum zu 10-20 Minuten, und den Überstand verwerfen.
- Wiederholen Sie den Waschvorgang noch einmal mit Waschpuffer # 3, und die Zellen werden bereit sein für die Kultur.
Teil IV. Myozyten Zellkultur
- Vorsichtig die Zellen in 5% Serum Media. Vor der Übertragung der Zellen auf Zellkulturplatten, waschen Sie die Platten mit 1x SFM. Übertragen Sie die Zellen in eine gewünschte Dichte und inkubieren in einer CO 2-Gewebekultur-Inkubator für 3-5 Stunden.
- Schalten Sie die Medien auf 1x SFM.
- Die Zellen können kultiviert werden für bis zu vier Tage und wird als für Experimente benötigt.
Teil V. repräsentative Ergebnisse / Outcome
Es sollten mehr als 70% leben Herzen Myozyten unter inversen Mikroskop, wenn das Protokoll korrekt durchgeführt werden.
Tabelle 1: Lösung Rezept für 1 L 10x Ca 2 +-freien KH Buffer:
| Masse | Endkonzentration | |
| NaCl | 68,96 g | 1180 mm |
| KCl | 3,58 g | 48 mm |
| HEPES | 59,58 g | 250 mM |
| K 2 HPO 4 | 2,85 g | 12,5 mM |
| MgSO 4 | 3,08 g | 12,5 mM |
Tabelle 2: Lösung Rezept für 1 L Puffer A:
Add 1,98 g Glucose in 100 ml 10x KH Buffer und bringen bis zu einem Endvolumen von 1 L. Adjust Osmolarität in der Nähe Physiologie Bedingung (~ 300) mit Glucose. Bringen Sie auf pH 7,4 mit NaOH.
| - | Masse | Endkonzentration |
| 10X KH Buffer | 100 mL | 100 ml |
| Glucose | 1,98 g | 11 mM |
| Bring to 1 L | ||
| Bringen Sie auf pH 7,4 mit NaOH | ||
| Passen Osmolarität in der Nähe physiologischen Zustand (~ 300) mit Glucose. | ||
Tabelle 3: Lösung Rezept für Enzyme Buffers
| Masse | Endkonzentration | |
| Collagenase Typ II | 25 mg | 0,05% (w / v) |
| Protease XIV | 10 mg | 0,02% (w / v) |
| BDM | 0,025 g | 5 mM |
| Carnitine | 0,020 g | 2 mM |
| Taurin | 0,031 g | 5 mM |
| Glutaminsäure | 0,020 g | 2 mM |
| 0,1 M CaCl 2 | 12,5 uL | 25 um |
| Puffer A | Füllen Sie zu 50 ml |
Tabelle 4: Lösung Rezept für 25X BDM / Taurin / BSA (B / T / B)
| Masse | Endkonzentration | |
| BDM | 0,076 g | 125 mM |
| Taurin | 0,094 g | 125 mM |
| BSA | 0,1% (w / v) | |
| Puffer A | Füllen Sie bis 6 ml |
Tabelle 5: Lösung Rezept für Buffer B und Waschpuffer
| Buffer: | B | # 1 | # 2 | # 3 |
| Add: | ||||
| 0,5 M CaCl 2 | 0,4 ml | 0,1 mL | 0,125 ml | 0,15 ml |
| Endkonzentration von CaCl 2 | 1 mM | 1 mM | 1,25 mM | 1,5 mM |
| 25X B / T / B | --- | 2 mL | 2 mL | 2 mL |
| Buffer A auf Endvolumen | 200 mL | 50 mL | 50 mL | 50 mL |
Tabelle 6: Lösung Rezept für Kulturmedien
| 2X Serum-freien Medien (SFM) | ||
| Endkonzentration | ||
| (Nach Verdünnung) | ||
| Carnitine | 0,099 g | 10 mM (5 mM) |
| Taurin | 0,063 g | 10 mM (5 mM) |
| Creatine | 0,075 g | 10 mM (5 mM) |
| Antibiotikum / Antimykotikum | 0,5 ml | 1% (0,5%) (v / v) |
| Medien 199 | 45 mL | Fill zu 50 mL |
| 1X SFM | ||
| Endkonzentration | ||
| 2X SFM | 25 mL | 1X |
| Medien 199 | Fill zu 50 mL | |
| 1x 5% Serum Medien | ||
| Endkonzentration | ||
| 2X SFM | 25 mL | 1X |
| FBS | 2,5 ml | 5% (v / v) |
| Medien 199 | Fill zu 50 mL |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ein entscheidender Schritt ist die Geschwindigkeit, mit der das isolierte Herz auf der Perfusion System eingehängt ist. Die Länge der enzymatische Verdauung Zeitraum kann ein wenig anders für jede Ratte. Die Einstellung hängt davon ab, wie weich das Herz wird nach der regulären Zeit der Verdauung. Die langsam Erholung der Ca 2 + nach Enzymverdau unerlässlich für den Erhalt von Ca 2 +-tolerant gesunden Zellen ist.
Für Meerschweinchen, ist das Protokoll, das gleiche, außer Hyaluronidase wird anstelle von Protease XIV verwendet. In der Regel finden wir die ersten, die Anteil an lebenden Zellen ist geringer für Meerschweinchen im Vergleich zu Ratten, obwohl sie nur so lange in Kultur überleben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P9666 | |
| MgSO4 | Fluka | 63068 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Carnitine | Sigma-Aldrich | C9500 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Creatine | Sigma-Aldrich | C3630 | |
| Antibiotic | Cellgro | 30-009-CI | |
| Media 199 | GIBCO, by Life Technologies | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Laminin | BD Biosciences | 354232 | |
| water bath | Fisher Scientific | 15-462-5 | |
| variable flow chemical pump | Fisher Scientific | 15-077-67 | |
| 6-well culture plate | Corning | 3516 |
References
- Miriyala, J., Nguyen, T., Yue, D. T., Colecraft, H. M. Role of CaVbeta subunits, and lack of functional reserve, in protein kinase A modulation of cardiac CaV1.2 channels. Circ Res. 102 (7), e54-e64 (2008).
- SX, T. akahashi, Mittman, S., Colecraft, H. M. Distinctive modulatory effects of five human auxiliary beta2 subunit splice variants on L-type calcium channel gating. Biophys. , 84-845 (2003).
