Summary
In questo articolo, abbiamo descritto un modo tipico per isolare e cultura miociti adulti cuore di ratto. Collagenasi e proteasi sono utilizzati da digerire e isolare singoli miociti. Miociti colto seguire questo protocollo soddisfare le esigenze più sperimentare.
Abstract
Coltura primaria adulto cellule del cuore roditori sono un modello di sistema importante per la ricerca cardiovascolare. Tuttavia, la creazione di robusti, miociti vitali adulto colto può essere tecnicamente impegnativo, fattore limitante per molti ricercatori. Qui abbiamo descritto un protocollo per ottenere un elevato rendimento di miociti adulti cuore di ratto che rimangono vitali in coltura per diversi giorni. Il cuore è isolato e perfuso con collagenasi e proteasi in basso Ca
Protocol
Parte I. Preparazione per la chirurgia
- Il giorno prima della chirurgia ratto, accertarsi che tutte le soluzioni sono fatti, ma non aggiungere alcun enzimi ancora. Buffer A, B e il tampone di lavaggio dovrebbero essere filtrate per la sterilità prima di stoccaggio. I tamponi dovrebbero essere conservato a 4 ° C.
- 6-pozzetti colture di tessuti deve essere placcato con 10-20 mg / mL laminina in 2 ml 1XSFM il giorno prima come bene, e deve essere conservato a 37 ° C in un incubatore CO 2.
- Il giorno della chirurgia, preparare gli strumenti chirurgici mediante sterilizzazione la pinza, forbici, pinze e con il 70% di etanolo e lasciarle asciugare su carta assorbente.
- Una siringa da 1 ml riempita con 0,5 ml di soluzione di eparina (90 U / ml) è pronto.
- Ora è buona norma lavare l'apparato perfusione eseguendo attraverso 70% di etanolo, utilizzando la pompa peristaltica in senso inverso. Una volta finito il risciacquo con etanolo, sciacquare l'apparato con il doppio di acqua distillata, ed infine risciacquare con tampone A. Il flusso attraverso viene raccolta in un bicchiere posto in una vasca d'acqua a 37 ° C.
- Per preparare l'apparato perfusione puliti, riempire il tubo diritto siringa con 40 ml di tampone A e il tubo di sinistra siringa con 40 ml di tampone B.
- Primo il tubo perfusione alla punta del catetere, consentendo tampone A a fluire attraverso l'apparecchio. Ricarica al buffer una siringa al livello 40 ml. Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria intrappolate nel tubo dopo questo passaggio.
- Ora, chiudere il buffer di una valvola di rubinetto siringa e ripetere il processo con tampone B tale che il tubo di perfusione è ora vaccinati con tampone B.
- Infine, l'apparato di perfusione è lasciato con la B Buffer rubinetto valvola aperta, ma con il flusso smesso di utilizzare il regolatore sulla linea IV.
- Scartare il tampone di flusso, anche se nel bicchiere di raccolta.
- L'ultima cosa da fare prima della chirurgia è quello di aggiungere gli enzimi necessari per la soluzione stock, e quindi filtrare la soluzione enzimatica così come le altre soluzioni sono state filtrate il giorno prima. Una volta filtrata, questa soluzione può essere lasciato a temperatura ambiente.
Parte II. The Rat dissezione cuore
- A seguito di protocollo standard eutanasia il topo con isoflurano in una camera a gas.
- Sterilizzare l'area incisione sul torace con il 70% di etanolo.
- Torace aperto con le forbici e esporre il cuore.
- Iniettare ventricolo sinistro con 0,5 mL di soluzione di eparina (90 U / mL).
- Rimuovere il cuore con grande porzione di aorta intatto, posto a freddo Buffer ghiaccio B.
Parte III. Miociti isolamento
- Un cuore di ratto tipico dovrebbe produrre una frazione alta a forma di bastoncello miociti (al contrario di cellule morte arrotondate) se la seguente procedura è correttamente rispettato.
- Per iniziare, morsetto aorta al catetere. La punta del catetere non deve essere spinta troppo in là nel cuore di assicurare una buona perfusione del cuore attraverso l'arteria coronaria.
- Una volta bloccato, legare l'aorta al catetere con una sutura.
- Quindi, aprire il regolatore linea IV per consentire un ritmo veloce a goccia (~ 60 gocce / min) e permettere B tampone per lavare il cuore.
- Durante il lavaggio tampone B, utilizzare le forbici piccole e pinze per rimuovere gli atri e qualsiasi tessuto adiposo o del polmone aggrappati al cuore.
- Dopo tampone B è finito, passare il flusso di tampone A.
- Mentre tampone A è permesso flusso per 5 minuti, alcuni piccoli compiti dovrebbero essere rapidamente eseguita.
- In primo luogo, scaldare la soluzione enzimatica in un bagno d'acqua a 37 ° C.
- Infine, quando tampone A è esaurita dalla siringa (ma ancora presente nel tubo), carico di 50 ml di soluzione enzimatica in siringa Un dell'apparato perfusione
- Ora è necessario eliminare tutti i flow-through dal bicchiere raccolta nel bagno d'acqua (pipettando), fino a quando la soluzione enzimatica cuore perfusione.
- Non appena la soluzione enzimatica perfusione del cuore, attivare la pompa peristaltica che è impostato per trasferire la soluzione enzimatica dal bicchiere di raccolta per reintegrare siringa A.
- Lasciare che la soluzione enzimatica a fluire attraverso il cuore per 10 min. Come il cuore digerisce, comincia a guardare gonfio.
- Aggiungere 37,5 ml di 0,1 M CaCl 2 alla soluzione enzimatica in una siringa per dare un'efficace concentrazione di 0,1 mM Ca 2 +.
- Dopo 10 minuti aumentare la concentrazione di calcio a 0,2 mm con l'aggiunta di un ulteriore 50 ml di 0,1 M CaCl 2 a siringa A e lasciare che la perfusione proseguire per altri 10 minuti.
- Tagliare i ventricoli e trasferimento in un piccolo becher sterile contenente 20 ml di soluzione enzimatica.
- Nel becher aumentare la concentrazione di calcio a 0,4 mm con l'aggiunta di 40 microlitri di più di 0,1 M CaCl 2.
- Tritate dolcemente il cuore in 10 o più pezzi con un paio di piccole forbici sterili.
- Incubare il bicchiere per 5 minuti a 37 ° C con dolce dondolio.
- Aggiungere 40 ml di 0,1 M CaCl 2 adare effettiva concentrazione di 0,6 mM Ca 2 + e delicatamente triturare i pezzi del cuore con una pipetta di plastica trasferimento 3-5 volte.
- Dopo l'incubazione per altri 5 minuti a 37 ° C, aggiungere 40 ml di 0,1 M CaCl 2 e delicatamente triturare come prima.
- Separare miociti digerito singolo non digerito tessuto connettivo con filtrazione attraverso una sterile 500 mesh micron.
- Permettono alle cellule di stabilirsi in un tubo da 50 ml per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Gettare il surnatante con una pipetta di trasferimento.
- Risospendere delicatamente le cellule in soluzione di lavaggio # 1 e permettono alle cellule di accontentarsi di 10-20 minuti a temperatura ambiente.
- Mentre le cellule si stanno stabilendo, prendere una piccola aliquota, e utilizzare questo tempo come occasione per valutare la qualità e la vitalità delle cellule in sospensione sotto un microscopio invertito. Una buona preparazione avrà una percentuale elevata (> 80%) di asta come le cellule con striature croccante.
- Una volta che le cellule si sono stabiliti, eliminare le cellule surnatante e risospendere delicatamente in soluzione di lavaggio # 2. Lasciate che le cellule stabilirsi a temperatura ambiente, che deve ancora prendere 10-20 minuti, e scartare il surnatante.
- Ripetere il processo di lavaggio ancora una volta con tampone di lavaggio # 3, e le celle saranno pronti per la cultura.
Parte IV. Coltura cellulare miociti
- Risospendere delicatamente le cellule in media il 5% del siero. Prima di trasferire le cellule a piastre di coltura di tessuto, lavare i piatti con 1x SFM. Trasferire le cellule ad una densità desiderata e incubare in un CO 2 di coltura tissutale incubatore per 3-5 ore.
- Passa i media a 1x SFM.
- Cellule possono essere coltivate per un massimo di quattro giorni e utilizzati come richiesto per gli esperimenti.
Parte V. Rappresentante Risultati / Esito
Ci dovrebbe essere oltre il 70% miociti cuore vivono sotto microscopio invertito quando il protocollo è fatto correttamente.
Tabella 1: Ricetta Soluzione per 1 L 10X Ca 2 + senza Buffer KH:
| massa | Concentrazione finale | |
| NaCl | 68,96 g | 1180 mm |
| KCl | 3,58 g | 48 mm |
| HEPES | 59,58 g | 250 mm |
| K 2 HPO 4 | 2,85 g | 12,5 mm |
| MgSO 4 | 3,08 g | 12,5 mm |
Tabella 2: Ricetta Soluzione tampone per 1 L A:
Aggiungere 1,98 g di glucosio a 100 ml di buffer 10X KH e portare a volume finale di 1 L. Regolare osmolarità a condizione fisiologia vicino (~ 300) con glucosio. Portare a pH 7,4 con NaOH.
| - | Massa | Concentrazione finale |
| KH Buffer 10X | 100 ml | 100 ml |
| Glucosio | 1,98 g | 11 mm |
| Portare a 1 L | ||
| Portare a pH 7,4 con NaOH | ||
| Regolare osmolarità quasi a condizione fisiologica (~ 300) con glucosio. | ||
Tabella 3: Ricetta Soluzione tampone enzimatico
| massa | Concentrazione finale | |
| Collagenasi di tipo II | 25 mg | 0,05% (w / v) |
| Proteasi XIV | 10 mg | 0,02% (w / v) |
| BDM | 0,025 g | 5 mM |
| Carnitina | 0,020 g | 2 mM |
| La taurina | 0,031 g | 5 mM |
| Acido glutammico | 0,020 g | 2 mM |
| 0,1 M CaCl 2 | 12,5 uL | 25 uM |
| Tampone A | Riempire a 50 ml |
Tabella 4: Ricetta soluzione per 25X BDM / Taurina / BSA (B / T / B)
| massa | Concentrazione finale | |
| BDM | 0,076 g | 125 mM |
| La taurina | 0,094 g | 125 mM |
| BSA | 0,1% (w / v) | |
| Tampone A | Riempire a 6 ml |
Tabella 5: ricetta per la soluzione tampone B e tamponi di lavaggio
| Buffer: | B | # 1 | # 2 | # 3 |
| Aggiungere: | ||||
| 0,5 M CaCl 2 | 0,4 mL | 0,1 mL | 0,125 ml | 0,15 ml |
| Concentrazione finale di CaCl 2 | 1 mM | 1 mM | 1,25 mm | 1,5 mM |
| 25X B / T / B | --- | 2 ml | 2 ml | 2 ml |
| Buffer Un volume di finale | 200 mL | 50 mL | 50 mL | 50 mL |
Tabella 6: Ricetta soluzione per Media Culturing
| 2X siero senza Media (SFM) | ||
| Concentrazione finale | ||
| (Dopo diluizione) | ||
| Carnitina | 0,099 g | 10 mM (5 mm) |
| La taurina | 0,063 g | 10 mM (5 mm) |
| Creatina | 0,075 g | 10 mM (5 mm) |
| Antibiotica / antimicotica | 0,5 ml | 1% (0,5%) (v / v) |
| 199 mezzi di comunicazione | 45 ml | Riempire a 50 mL |
| 1X SFM | ||
| Concentrazione finale | ||
| 2X SFM | 25 mL | 1X |
| 199 mezzi di comunicazione | Riempire a 50 mL | |
| 1X media del 5% Siero | ||
| Concentrazione finale | ||
| 2X SFM | 25 mL | 1X |
| FBS | 2,5 ml | 5% (v / v) |
| 199 mezzi di comunicazione | Riempire a 50 mL |
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Discussion
Un passo fondamentale è la velocità con cui è appeso il cuore isolato sul sistema di perfusione. La durata del periodo di digestione enzimatica può essere un po 'diverso per ogni ratto. La regolazione dipende da come il cuore diventa morbida dopo il periodo normale di digestione. Il piano di recupero di Ca 2 + dopo la digestione enzima è essenziale per ottenere le cellule sane Ca 2 +-tollerante.
Per la cavia, il protocollo è lo stesso, tranne ialuronidasi viene usato al posto di proteasi XIV. Tipicamente, troviamo che la percentuale iniziale di cellule viventi è più bassa per la cavia rispetto al topo, anche se sopravvivono solo più a lungo in coltura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P9666 | |
| MgSO4 | Fluka | 63068 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Carnitine | Sigma-Aldrich | C9500 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Creatine | Sigma-Aldrich | C3630 | |
| Antibiotic | Cellgro | 30-009-CI | |
| Media 199 | GIBCO, by Life Technologies | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Laminin | BD Biosciences | 354232 | |
| water bath | Fisher Scientific | 15-462-5 | |
| variable flow chemical pump | Fisher Scientific | 15-077-67 | |
| 6-well culture plate | Corning | 3516 |
References
- Miriyala, J., Nguyen, T., Yue, D. T., Colecraft, H. M. Role of CaVbeta subunits, and lack of functional reserve, in protein kinase A modulation of cardiac CaV1.2 channels. Circ Res. 102 (7), e54-e64 (2008).
- SX, T. akahashi, Mittman, S., Colecraft, H. M. Distinctive modulatory effects of five human auxiliary beta2 subunit splice variants on L-type calcium channel gating. Biophys. , 84-845 (2003).
