Summary
本稿では、成体ラットの心筋細胞を分離、培養に一般的な方法を説明した。コラゲナーゼとプロテアーゼは、単一の心筋細胞を消化して単離するために使用されています。心筋細胞は、ほとんどの実験の要件を満たすこのプロトコルに従って培養した。
Abstract
培養一次成人の齧歯類の心臓の細胞は、心臓血管研究のための重要なモデル系である。それにもかかわらず、堅牢な、実行可能な培養成人心筋細胞の確立は、多くの研究者のための技術的に困難な、律速段階であることができる。ここでは、数日間培養中で実行可能なまま成体ラットの心筋細胞の高い収量を得るためのプロトコルを説明した。心臓は、低Caで単離され、コラゲナーゼやプロテアーゼで灌流され
Protocol
手術のためのパートI.準備
- ラットの手術の前日は、すべてのソリューションが行われていることを確認して、まだどの酵素を追加しないでください。バッファ、Bおよび洗浄緩衝液は、すべてのストレージの前に無菌のためにフィルタリングする必要があります。バッファはすべて4℃で保存してください。
- 6ウェル組織培養プレートを10〜20μgの/ 2mLの1XSFM mLのラミニンと同様前日でメッキされている必要がありますし、37 CO 2インキュベーター内で° Cで保存してください。
- 手術の日に、70％エタノールでクランプ、はさみ、そして鉗子を滅菌により、手術器具を準備し、それらをペーパータオルの上に乾燥させます。
- 0.5mLのヘパリン溶液（90 U / ml）で満たされた1 mLの注射器が準備されています。
- 今では逆に蠕動ポンプを用いて、70％エタノールを通して実行することにより、灌流装置を洗浄することをお勧めします。一度再蒸留水で装置を洗浄、エタノールで洗浄が終了し、最後に流れるが、37℃の水浴中に置かれたビーカーに収集される緩衝液Aですすいでください。
- 洗浄灌流装置を準備するには、緩衝液Bの40mLでバッファと左シリンジの管の40mLで右シリンジのチューブを埋める
- 首相装置を流れるようにバッファを許可することでカテーテルの先端に灌流チューブ。バッファーを40 mLのレベルの注射器に詰め替え。このステップの後にチューブの中に閉じ込めに気泡がないことを確認します。
- 今、バッファの注射器のコックのバルブを閉じ、灌流チューブが今緩衝液Bでプライミングされるように緩衝液Bで処理を繰り返します。
- 最後に、灌流装置は、緩衝液Bストップコックバルブを開いた状態で残っていますが、フローとIVラインにレギュレータを使用して停止されます。
- 収集ビーカー内の処理のフローもバッファーを捨てる。
- 手術前に行う最後のことは、他のソリューションは、前日フィルター処理されたのと同様に酵素溶液をお使い原液に必要な酵素を追加し、フィルタすることです。一度フィルタリング、この溶液を室温で放置することができます。
パートII。ラットの心臓の解剖
- 以下の標準プロトコルは、ガス室におけるイソフルランでラットを安楽死させる。
- 70％エタノールで胸部の切開の領域を滅菌する。
- はさみを使って胸を開いて、心臓を公開。
- 0.5mLのヘパリン溶液（90 U / mL）で左心室を注入する。
- 氷冷緩衝液Bで大動脈そのまま、場所の大部分で心を取り除く
パートIII。心筋細胞の分離
- 次の手順が適切に付着されている場合典型的なラットの心臓では、棒状の心筋細胞の高い割合を（デッド丸い細胞とは対照的に）生成する必要があります。
- 開始するには、カテーテルに大動脈をクランプ。カテーテルの先端は、冠状動脈を通って心臓の良好な血流を確保するために心臓に遠くプッシュされるべきではない。
- 一度クランプ、縫合糸でカテーテルに大動脈を結ぶ。
- 次に、高速の滴下速度を（〜60滴/分）を可能と心を洗い流すためにバッファーBを可能にするためにIVラインのレギュレータを開きます。
- バッファBの洗浄時には、心房と心にしがみついて、任意の脂肪や肺組織を除去するために小さなハサミとピンセットを使用してください。
- バッファBが終了した後、緩衝液Aに流れを切り替える
- バッファーを5分間流すことが許されている間、いくつかの小さなタスクを迅速に実行する必要があります。
- 最初に、37℃の水浴中で酵素液を温める。
- 最後に、バッファーをシリンジ（まだチューブ内に存在）から枯渇しているときに、注射器で酵素溶液50mlをロード灌流装置の
- それは、酵素溶液のperfusesの心までは、現在すべてのフロースルー水浴（ピペット）でコレクションのビーカーからを破棄する必要があります。
- とすぐに酵素液は心臓をperfusesとして、シリンジAを補給するために収集ビーカーから酵素溶液を転送するように設定されている蠕動ポンプを活性化する
- 10分間心臓を流れるように酵素溶液を許可。心臓ダイジェストとして、それは傲慢な表情を開始します。
- 0.1mMのCa 2 +の効果的な濃度になるように注射器で酵素溶液に0.1 M CaCl 2の37.5μLを加える。
- 後10分はシリンジに0.1 M CaCl 2をさらに50μLを添加することにより0.2mMのためにカルシウムの濃度を増加させ、血流がさらに10分間進行させる。
- 心室をカットオフし、20mLの酵素液を含む小さな滅菌ビーカーに移す。
- ビーカーに0.1 M CaCl 2をさらに40μLを添加することにより0.4mMのためにカルシウム濃度を増加させる。
- そっと小さな滅菌ハサミで10以上の作品に心を飾らない。
- 37℃で5分間ビーカーをインキュベート° C緩やかに振盪した。
- に0.1 M CaCl 2を40mLのを追加します。0.6mmのCa 2 +の有効濃度を与え、穏やかにプラスチック製のトランスファーピペット3〜5回でハートの部分を砕いて粉にする。
- 37℃でさらに5分間インキュベート° Cをした後、0.1 M CaCl 2の40 mLを加え、ゆっくりと前と同じように砕いて粉末にする。
- 滅菌500μmのメッシュで濾過を使用して、非消化結合組織から消化単一心筋細胞を分離する。
- 細胞は室温で10分間、50 mlチューブに定住することができます。
- 転送上清をピペットで捨てます。
- 優しく洗浄バッファー＃1で細胞を再懸濁し、細胞は、室温で10-20分のために解決することができます。
- 細胞がセトリングしている間、倒立顕微鏡下で懸濁液中の細胞の質と生存率を評価する機会として、この時間を小さなアリコートを取り、使用してください。良い準備が鮮明な縞を持つ細胞のような棒の割合が高い（> 80％）になります。
- 細胞が定着した後、洗浄バッファー＃2で上清と穏やかに懸濁し、細胞を捨てる。細胞は室温で沈殿させ、これは再び10〜20分かかりますし、上清を破棄すべきである。
- 第3洗浄バッファーで一回以上の洗浄工程を繰り返し、細胞は培養のための準備が整います。
パートIV。筋細胞の細胞培養
- 穏やかに5％血清培地で細胞を懸濁します。組織培養プレートに細胞を転送する前に、1 × SFMでプレートを洗浄。 3-5時間のためにCO 2組織培養インキュベーター内で所望の濃度とインキュベーションで細胞を移す。
- 1X SFMにメディアを切り替える。
- 細胞は4日間まで培養し、などの実験に必要な使用することができます。
パートV.代表的な結果/成果
プロトコルが正しく行われている倒立顕微鏡下で70％以上のライブ心筋細胞があるはずです。
表1：1 L 10倍のCa 2 + -フリーKHバッファのためのソリューションレシピ：
| 質量 | 最終濃度 | |
| NaClの | 68.96グラム | 1180 mMの |
| 塩化カリウム | 3.58グラム | 48 mmの |
| HEPES | 59.58グラム | 250mMの |
| K 2 HPO 4 | 2.85グラム | 12.5 mmを |
| MgSO 4を | 3.08グラム | 12.5 mmを |
表2：1 Lのバッファーのためのソリューションレシピ：
100 mLの10X KHのバッファーに1.98グラムのブドウ糖を追加し、1リットルの最終容量は、グルコースと近い生理学の条件（〜300）への浸透圧を調整するためにもたらす。 NaOHでpH7.4に持参。
| - | 質量 | 最終濃度 |
| 10X KHバッファー | 100mLの | 100ミリリットル |
| グルコース | 1.98グラム | 11 mmの |
| 1 Lへ移動 | ||
| NaOHでpH7.4に持参 | ||
| グルコースと近い生理的条件（〜300）への浸透圧を調整します。 | ||
表3：酵素のバッファのためのソリューションのレシピ
| 質量 | 最終濃度 | |
| コラゲナーゼタイプII | 25mgの | 0.05％（w / v）の |
| プロテアーゼXIV | 10 mgの | 0.02％（w / v）の |
| BDM | 0.025グラム | 5mMの |
| カルニチン | 0.020グラム | 2mMの |
| タウリン | 0.031グラム | 5mMの |
| グルタミン酸 | 0.020グラム | 2mMの |
| 0.1 M 塩化カルシウム | 12.5 uLを | 25μMの |
| バッファ | 50mlに埋める |
表4：25X BDM /タウリン/ BSA（B / T / B）のためのソリューションレシピ
| 質量 | 最終濃度 | |
| BDM | 0.076グラム | 125ミリメートル |
| タウリン | 0.094グラム | 125ミリメートル |
| BSA | 0.1％（w / v）の | |
| バッファ | 6 mLのに埋める |
表5：バッファBとウォッシュのバッファのためのソリューションのレシピ
| バッファ： | B | 第1位 | ＃2 | 第3位 |
| 追加： | ||||
| 0.5 M 塩化カルシウム | 0.4 mLの | 0.1 mLの | 0.125 mLの | 0.15 mLの |
| CaCl 2の終濃度 | 1mMの | 1mMの | 1.25 mMの | 1.5mMの |
| 25X B / T / B | --- | 2 mLの | 2 mLの | 2 mLの |
| 最終容量にバッファ | 200 mLの | 50 mLの | 50 mLの | 50 mLの |
表6：培養のメディアのためのソリューションのレシピ
| 2X無血清培地（SFM） | ||
| 最終濃度 | ||
| （希釈後） | ||
| カルニチン | 0.099グラム | 10mMの（5mM）の |
| タウリン | 0.063グラム | 10mMの（5mM）の |
| クレアチン | 0.075グラム | 10mMの（5mM）の |
| 抗生物質/抗真菌剤 | 0.5ミリリットル | 1％（0.5％）（V / V） |
| メディア199 | 45mlの | 50 mLに埋める |
| 1X SFM | ||
| 最終濃度 | ||
| 2X SFM | 25 mLの | 1X |
| メディア199 | 50 mLに埋める | |
| 1X 5パーセント血清メディア | ||
| 最終濃度 | ||
| 2X SFM | 25 mLの | 1X |
| FBS | 2.5mLの | 5％（v / v）の |
| メディア199 | 50 mLに埋める |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
重要なステップは、単離心臓を灌流システム上でハングアップされる速度です。酵素消化の期間の長さは、各ラットのために少し異なる場合があります。調整は、心臓、消化の定期的な期間の後になるとどのようにソフトに依存します。酵素消化後のCa 2徐々に回復+は、Ca 2 +トレラント健康な細胞を得るために不可欠です。
モルモットの場合、プロトコルは、ヒアルロニダーゼ、プロテアーゼXIVの代わりに使用されることを除いて同じです。一般的に、我々は、彼らが文化の中でだけの時間が残る中、生きた細胞の初期の割合は、ラットに比べてモルモットのためのより低いことがわかります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P9666 | |
| MgSO4 | Fluka | 63068 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Carnitine | Sigma-Aldrich | C9500 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Creatine | Sigma-Aldrich | C3630 | |
| Antibiotic | Cellgro | 30-009-CI | |
| Media 199 | GIBCO, by Life Technologies | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Laminin | BD Biosciences | 354232 | |
| water bath | Fisher Scientific | 15-462-5 | |
| variable flow chemical pump | Fisher Scientific | 15-077-67 | |
| 6-well culture plate | Corning | 3516 |
References
- Miriyala, J., Nguyen, T., Yue, D. T., Colecraft, H. M. Role of CaVbeta subunits, and lack of functional reserve, in protein kinase A modulation of cardiac CaV1.2 channels. Circ Res. 102 (7), e54-e64 (2008).
- SX, T. akahashi, Mittman, S., Colecraft, H. M. Distinctive modulatory effects of five human auxiliary beta2 subunit splice variants on L-type calcium channel gating. Biophys. , 84-845 (2003).
