Summary
Neste artigo, descrevemos uma forma típica para isolar e cultura miócitos adulto coração de rato. Colagenase e protease são usadas para digerir e isolar miócitos único. Miócitos cultivadas seguir este protocolo de responder às necessidades mais experiência.
Abstract
Cultura primária adulto células do coração de roedores são um sistema modelo importante para a pesquisa cardiovascular. No entanto, o estabelecimento de robusta, viável miócitos adulto culto pode ser um desafio técnico, passo limitante para muitos pesquisadores. Aqui nós descrevemos um protocolo para obter um alto rendimento de miócitos de ratos adultos coração que permanecem viáveis em cultura por vários dias. O coração é isolado e perfundido com colagenase e protease em Ca baixo
Protocol
Preparação para a cirurgia Parte I.
- O dia antes da cirurgia de ratos, a certeza de que todas as soluções são feitas, mas não adicione nenhum enzimas ainda. Buffers A, B e do tampão de lavagem deve ser filtrado para todas as esterilidade antes do armazenamento. Os buffers devem ser todos armazenados a 4 ° C.
- 6-bem placas de cultura de tecido deve ser revestida com 10-20 mcg / mL laminina em 2 mL 1XSFM no dia anterior, bem como, e deve ser armazenado a 37 ° C em uma incubadora de CO 2.
- No dia da cirurgia, preparar os instrumentos cirúrgicos com a esterilização do grampo, tesouras e pinças com etanol 70% e deixe-os secar em papel toalha.
- Uma seringa de 1 mL preenchidos com 0,5 mL da solução de heparina (90 U / ml) é preparado.
- Agora é uma boa prática de lavar o aparelho de perfusão executando através de etanol 70%, usando a bomba peristáltica em sentido inverso. Uma vez terminado lavagem com etanol, enxaguar o aparelho com água destilada duas vezes e, finalmente, enxaguar com tampão A. O fluxo é coletado através de um copo colocado em banho-maria a 37 ° C.
- Para preparar o aparelho de perfusão limpas, encher o tubo da seringa direita com 40 mL de tampão A e deixou o tubo da seringa com 40 mL de tampão B.
- Primeiro o tubo de perfusão para a ponta do cateter, permitindo tampão A para fluir através do aparelho. Refil para o buffer de uma seringa ao nível de 40 ml. Certifique-se que não há bolhas de ar aprisionadas na tubulação após esta etapa.
- Agora, feche o buffer Uma válvula torneira seringa e repita o processo com tampão B tal que o tubo de perfusão está agora preparado com tampão B.
- Finalmente, o aparelho de perfusão fica com a torneira B buffer válvula aberta, mas com o fluxo parou de usar o regulador na linha IV.
- Descartar o buffer de fluxo, embora no copo de coleta.
- A última coisa a fazer antes da cirurgia é adicionar as enzimas necessárias à sua solução estoque, e, em seguida, filtrar a solução enzimática, assim como as outras soluções foram filtradas no dia anterior. Uma vez filtrado, esta solução pode ser deixado à temperatura ambiente.
Parte II. A dissecção do coração de rato
- Protocolo padrão seguinte euthanize o rato com isoflurano em uma câmara de gás.
- Esterilizar a área da incisão no tórax com etanol 70%.
- Peito aberto com uma tesoura e expor o coração.
- Injetar ventrículo esquerdo com 0,5 mL de solução de heparina (90 U / mL).
- Remover coração com grande parcela de aorta lugar, intacto no gelo frio tampão B.
Parte III. Isolamento miócitos
- Um coração de rato típico deve render uma grande fracção de miócitos em forma de bastonete (ao contrário de células mortas arredondado) se o procedimento a seguir é devidamente respeitado.
- Para começar, clamp aorta ao cateter. A ponta do cateter não deve ser levada muito longe dentro do coração para garantir boa perfusão do coração pela artéria coronária.
- Uma vez preso, gravata da aorta para o cateter com uma sutura.
- Em seguida, abra o regulador da linha IV para permitir uma taxa de gotejamento rápido (~ 60 gotas / min) e permitirá B Buffer para lavar o coração.
- Durante tampão de lavagem B, use a tesoura pequena e uma pinça para remover os átrios e qualquer tecido adiposo ou pulmão apego ao coração.
- Depois de tampão B terminar, mude o fluxo de tampão A.
- Enquanto tampão A é permitido fluir por 5 minutos, várias pequenas tarefas devem ser realizadas rapidamente.
- Primeiro, aquecer a solução enzimática em um banho de água 37 ° C.
- Finalmente, quando um buffer é esgotado da seringa (mas ainda presente no tubo), carga de 50 mL da solução enzimática em seringa do aparelho de perfusão
- Agora é necessário descartar todas as fluxo através do copo coleção em banho-maria (pipetando), até que o coração Enzyme perfunde Solution.
- Assim que a solução de enzima perfunde o coração, ative a bomba peristáltica que é configurado para transferir a solução enzimática do copo coleta para reabastecer seringa A.
- Permitir a solução de enzima a fluir através do coração por 10 min. Como o coração digere, ele começa a olhar inchado.
- Adicionar 37,5 mL de 0,1 M CaCl 2 para a solução de enzima em seringa A para dar uma concentração efetiva de 0,1 mM Ca 2 +.
- Após 10 minutos aumentar a concentração de cálcio para 0,2 mM adicionando um adicional de 50 mL de 0,1 M CaCl 2 a seringa A e deixe a perfusão continuar por mais 10 minutos.
- Cortar os ventrículos e transferir para um copo pequeno estéril contendo 20 mL da solução enzimática.
- No copo aumentar a concentração de cálcio para 0,4 mM, adicionando mais 40 mL de 0,1 M CaCl 2.
- Suavemente mince o coração em 10 ou mais peças com um par de pequenas tesouras esterilizadas.
- Incubar o copo por 5 minutos a 37 ° C com balanço delicado.
- Adicionar 40 mL de 0,1 M CaCl 2 adar concentração efetiva de 0,6 mM Ca 2 + e gentilmente triturar os pedaços do coração com uma pipeta de transferência de plástico 3-5 vezes.
- Após incubação por mais 5 minutos a 37 ° C, adicionar 40 mL de 0,1 M CaCl 2 e gentilmente triturar como antes.
- Separe digerida miócitos única de não-tecido conjuntivo digerido utilizando filtração através de uma malha mM estéril 500.
- Permitir que as células se estabelecer em um tubo de 50 ml por 10 minutos em temperatura ambiente.
- Elimine o sobrenadante com uma pipeta de transferência.
- Delicadamente ressuspender as células em tampão de lavagem # 1 e permitir que as células de se contentar com 10-20 min em temperatura ambiente.
- Enquanto as células estão se instalando, tomar uma alíquota pequena, e usar este tempo como uma oportunidade para avaliar a qualidade ea viabilidade das células em suspensão em um microscópio invertido. Uma boa preparação terá uma alta proporção (> 80%) da haste, como as células com estrias nítidas.
- Quando as células se instalaram, descarte as células sobrenadante e gentilmente ressuspender em tampão de lavagem 2. Vamos resolver as células à temperatura ambiente, que devem voltar a tirar 10-20 minutos, e desprezar o sobrenadante.
- Repita o processo de lavagem mais uma vez com tampão de lavagem # 3, e as células estarão prontos para a cultura.
Parte IV. Cultura de células miócitos
- Delicadamente ressuspender as células em 5% de soro de mídia. Antes de transferir as células a placas de cultura de tecidos, lavar os pratos com 1x SFM. Transferência das células com uma densidade desejada e incubar em um CO 2 de cultura de tecidos incubadora de 3-5 horas.
- Mudar a mídia para 1x SFM.
- As células podem ser cultivadas por até quatro dias e usado como necessária para os experimentos.
Parte V. Representante Resultados / Resultados
Deve haver mais de 70% miócitos cardíacos vivem sob microscópio invertido quando o protocolo é feito corretamente.
Tabela 1: Receita Solução para 1 L 10X Ca 2 + livre de buffer KH:
| massa | Concentração Final | |
| NaCl | 68,96 g | 1180 mM |
| KCl | 3,58 g | 48 mM |
| HEPES | 59,58 g | 250 mM |
| K 2 HPO 4 | 2,85 g | 12,5 mM |
| MgSO 4 | 3,08 g | 12,5 mM |
Tabela 2: Receita solução para um buffer L A:
Adicionar 1,98 g de glicose a 100 mL de tampão KH 10X e levar a um volume final de 1 L. Ajuste osmolaridade à condição de fisiologia próximo (~ 300) com a glicose. Trazer para pH 7,4 com NaOH.
| - | Massa | Concentração Final |
| Tampão KH 10X | 100 mL | 100 ml |
| Glicose | 1,98 g | 11 mM |
| Trazer para 1 L | ||
| Trazer para pH 7,4 com NaOH | ||
| Ajuste osmolaridade à condição fisiológica próximo (~ 300) com a glicose. | ||
Tabela 3: Receita Solução para Buffers Enzyme
| massa | Concentração Final | |
| Colagenase tipo II | 25 mg | 0,05% (w / v) |
| Protease XIV | 10 mg | 0,02% (w / v) |
| BDM | 0,025 g | 5 mM |
| Carnitina | 0,020 g | 2 mM |
| Taurina | 0,031 g | 5 mM |
| Ácido glutâmico | 0,020 g | 2 mM |
| 0,1 M CaCl 2 | 12,5 uL | 25 uM |
| Um buffer | Preencha a 50 ml |
Tabela 4: Receita Solução para BDM 25X / Taurina / BSA (B / T / B)
| massa | Concentração Final | |
| BDM | 0,076 g | 125 mM |
| Taurina | 0,094 g | 125 mM |
| BSA | 0,1% (w / v) | |
| Um buffer | Preencha a 6 mL |
Tabela 5: Receita Solução B Buffer e Buffers Wash
| Buffer: | B | # 1 | # 2 | # 3 |
| Adicionar: | ||||
| 0,5 M CaCl 2 | 0,4 mL | 0,1 mL | 0,125 mL | 0,15 mL |
| Concentração final de CaCl 2 | 1 mM | 1 mM | 1,25 mM | 1,5 mM |
| 25X B / T / B | --- | 2 mL | 2 mL | 2 mL |
| Um buffer de volume para a final | 200 mL | 50 mL | 50 mL | 50 mL |
Tabela 6: Receita Solução para meios de cultura
| 2X sem soro Media (SFM) | ||
| Concentração Final | ||
| (Após a diluição) | ||
| Carnitina | 0,099 g | 10 mM (5 mM) |
| Taurina | 0,063 g | 10 mM (5 mM) |
| Creatina | 0,075 g | 10 mM (5 mM) |
| Antibiótico / antimicótico | 0,5 ml | 1% (0,5%) (v / v) |
| Mídia 199 | 45 mL | Preencha a 50 mL |
| 1X SFM | ||
| Concentração Final | ||
| 2X SFM | 25 mL | 1X |
| Mídia 199 | Preencha a 50 mL | |
| 1X de 5% de soro de mídia | ||
| Concentração Final | ||
| 2X SFM | 25 mL | 1X |
| FBS | 2,5 mL | 5% (v / v) |
| Mídia 199 | Preencha a 50 mL |
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Discussion
Um passo crítico é a velocidade com que o coração isolado é preso no sistema de perfusão. A duração do período de digestão enzimática pode ser um pouco diferente para cada rato. O ajuste depende de como o coração se torna macia após o período regular de digestão. A recuperação lenta de Ca 2 + após digestão enzimática é essencial para a obtenção de Ca 2 + tolerante células saudáveis.
Para cobaia, o protocolo é o mesmo, exceto hialuronidase é usado em vez de Protease XIV. Normalmente, encontramos o percentual inicial de que as células vivas é menor para cobaia em relação ao rato, mas eles sobrevivem apenas o tempo em cultura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P9666 | |
| MgSO4 | Fluka | 63068 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Carnitine | Sigma-Aldrich | C9500 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Creatine | Sigma-Aldrich | C3630 | |
| Antibiotic | Cellgro | 30-009-CI | |
| Media 199 | GIBCO, by Life Technologies | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Laminin | BD Biosciences | 354232 | |
| water bath | Fisher Scientific | 15-462-5 | |
| variable flow chemical pump | Fisher Scientific | 15-077-67 | |
| 6-well culture plate | Corning | 3516 |
References
- Miriyala, J., Nguyen, T., Yue, D. T., Colecraft, H. M. Role of CaVbeta subunits, and lack of functional reserve, in protein kinase A modulation of cardiac CaV1.2 channels. Circ Res. 102 (7), e54-e64 (2008).
- SX, T. akahashi, Mittman, S., Colecraft, H. M. Distinctive modulatory effects of five human auxiliary beta2 subunit splice variants on L-type calcium channel gating. Biophys. , 84-845 (2003).
