Summary
En este trabajo se describe la forma típica de aislar y cultivar el corazón de rata adulta miocitos. Colagenasa y la proteasa se utilizan para digerir y aislar a los miocitos individuales. Miocitos cultivadas seguir este protocolo cumplir con los requisitos de la mayoría de los experimentos.
Abstract
Cultivadas primaria para adultos células cardiacas de roedores son un importante sistema modelo para la investigación cardiovascular. Sin embargo, el establecimiento de los miocitos sólida, viable adultos cultivados puede ser un desafío técnico, la tasa de limitación de paso para muchos investigadores. Aquí se describe un protocolo para obtener un alto rendimiento de los miocitos adultos de corazón de rata que se mantienen viables en cultivo durante varios días. El corazón es aislado y perfundido con colagenasa y la proteasa en condiciones de poca Ca
Protocol
Parte I. Preparación para la cirugía
- El día antes de la cirugía de la rata, asegúrese de que todas las soluciones se hacen, pero no le agregue nada enzimas todavía. Buffers A, B, y el tampón de lavado a todos debe ser filtrada para la esterilidad antes de su almacenamiento. Los buffers de todos deben ser almacenados a 4 ° C.
- 6 y placas de cultivo de tejidos debe ser recubierto con 10-20 mg / ml de laminina en 2 ml 1XSFM el día anterior también, y deben ser almacenados a 37 º C en una incubadora de CO 2.
- En el día de la cirugía, preparar los instrumentos quirúrgicos de esterilización de la pinza, tijeras, pinzas y con el 70% de etanol y dejar secar sobre una toalla de papel.
- Una jeringa de 1 mL llena con 0,5 ml de solución de heparina (90 U / ml) se prepara.
- Ahora es una buena práctica para lavar el aparato de perfusión mediante la ejecución a través de etanol al 70%, utilizando la bomba peristáltica a la inversa. Una vez terminado el enjuague con etanol, enjuagar el aparato con agua doblemente destilada, y por último enjuague con tampón A. El flujo a través se recoge en un recipiente colocado en un baño de agua 37 ° C.
- Para preparar el aparato de perfusión limpiar, rellenar el tubo de la jeringa derecha con 40 ml de tampón A y el tubo de la jeringa izquierda con 40 ml de tampón B.
- El primer tubo de la perfusión a la punta del catéter, permitiendo un Buffer de flujo a través del aparato. Rellenar el búfer de una jeringa con el nivel de 40 ml. Asegúrese de que no haya burbujas de aire atrapado en el tubo después de este paso.
- Ahora, cierra el buffer de una válvula de llave de paso de la jeringa y repetir el proceso con Tampón B de tal manera que el tubo de perfusión está preparado con buffer B.
- Finalmente, el aparato de perfusión se queda con la llave de paso del buffer B válvula abierta, pero con la corriente dejó de usar el regulador en la línea IV.
- Deseche el tampón de flujo, aunque en el vaso de recolección.
- La última cosa que hacer antes de la cirugía consiste en añadir las enzimas necesarias para su solución de reserva, y después se filtra la solución de la enzima al igual que las otras soluciones se filtraron el día anterior. Una vez filtrada, esta solución se puede dejar a temperatura ambiente.
Parte II. La disección de corazón de rata
- Protocolo estándar después de la eutanasia a la rata con isoflurano en una cámara de gas.
- Esterilizar el área de la incisión en el tórax con un 70% de etanol.
- Pecho abierto con unas tijeras y exponer el corazón.
- Inyectar ventrículo izquierdo con solución 0,5 ml de heparina (90 U / mL).
- Quitar el corazón de gran parte de la aorta lugar intacto, en el hielo frío buffer B.
Parte III. Miocitos aislamiento
- Un corazón de rata típica debe producir una elevada fracción de la barra en forma de los miocitos (en comparación con las células muertas redondeadas) si el procedimiento que sigue es bien respetado.
- Para empezar, pinza la aorta con el catéter. La punta del catéter no debe ser llevado demasiado lejos en el corazón para garantizar una buena perfusión del corazón a través de la arteria coronaria.
- Una vez fijada, la corbata de la aorta con el catéter con una sutura.
- A continuación, abra el regulador de la línea IV para permitir una velocidad de goteo rápido (~ 60 gotas / min) y permitir que B Buffer para vaciar el corazón.
- Durante el tampón de lavado B, use las tijeras pequeñas y pinzas para quitar las aurículas y los tejidos grasos o de los pulmones se aferran al corazón.
- Después de Buffer B ha terminado, cambiar el flujo de tampón A.
- Mientras que el tampón A se le permite fluir durante 5 minutos, varias tareas pequeñas deben realizarse rápidamente.
- En primer lugar, calentar la solución de la enzima en un baño de agua a 37 ° C.
- Finalmente, cuando se agota un Buffer de la jeringa (pero aún presente en el tubo), carga de 50 ml de la solución de la enzima en la jeringa del aparato de perfusión
- Ahora es necesario desechar todo el flujo a través del vaso de recogida en el baño de agua (con pipeta), hasta que la solución de la enzima perfunde el corazón.
- Tan pronto como la solución de la enzima perfunde el corazón, activar la bomba peristáltica que está configurado para transferir la solución de la enzima de la copa de recolección para llenar la jeringa A.
- Deje que la solución de la enzima al flujo a través del corazón durante 10 minutos. Cuando el corazón se digiere, comienza a verse hinchada.
- Añadir 37,5 l de 0,1 M CaCl 2 a la solución de la enzima en una jeringa para administrar una concentración efectiva de 0,1 mM Ca 2 +.
- Después de 10 minutos aumenta la concentración de calcio de 0,2 mm mediante la adición de un adicional de 50 l de 0,1 M CaCl 2 a la jeringa A y dejar que la perfusión continuar durante otros 10 minutos.
- Cortar los ventrículos y la transferencia de un pequeño vaso estéril que contiene 20 ml de solución de la enzima.
- En el vaso de aumentar la concentración de calcio de 0,4 mm mediante la adición de 40 l más de 0,1 M CaCl 2.
- Suavemente pelos en el corazón en 10 o más piezas con un par de pequeñas tijeras estériles.
- Incubar el vaso durante 5 minutos a 37 ° C con suave balanceo.
- Añadir 40 ml de 0,1 M CaCl 2 aobtener una concentración efectiva de 0,6 mM Ca 2 + y con cuidado triturar los pedazos del corazón con una pipeta de plástico de 5.3 veces.
- Después de incubar durante 5 minutos a 37 ° C, añadir 40 ml de 0,1 M CaCl 2 y triturar suavemente como antes.
- Separados digerido sola miocitos de no digerido del tejido conectivo mediante la filtración a través de una malla estéril micras 500.
- Permitir que las células se asientan en un tubo de 50 ml durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Desechar el sobrenadante con una pipeta.
- Resuspender suavemente las células en tampón de lavado # 1 y permitir que las células que conformarse con 10-20 minutos a temperatura ambiente.
- Mientras que las células se están estableciendo, tome una pequeña alícuota, y utilizar este tiempo como una oportunidad para evaluar la calidad y viabilidad de las células en suspensión bajo un microscopio invertido. Una buena preparación que tienen una alta proporción (> 80%) de la varilla, como las células con estrías claras.
- Una vez que las células se han asentado, desechar el sobrenadante y resuspender las células suavemente en tampón de lavado # 2. Vamos a colocar las células a temperatura ambiente, que a su vez debe tomar 10-20 minutos, y descartar el sobrenadante.
- Repita el proceso de lavado, una vez más con el tampón de lavado # 3, y las células estarán listos para la cultura.
Parte IV. Cultivos celulares de miocitos
- Resuspender suavemente las células en los medios de comunicación el 5% de suero. Antes de transferir las células a las placas de cultivo de tejidos, lavar los platos con 1x SFM. Transferencia de las células a una densidad deseada y se incuba en una CO 2 incubadora de cultivo de tejidos durante 3-5 horas.
- Interruptor de los medios de comunicación a 1x SFM.
- Las células pueden ser cultivadas hasta por cuatro días y usados cuando sea requerido para realizar experimentos.
Parte V. Representante Resultados / Resultados
No debe haber más de un 70% los miocitos del corazón viven bajo microscopio invertido cuando el protocolo se hace correctamente.
Tabla 1: Solución para la receta de una L 10 veces más Ca 2 + sin buffer KH:
| masa | La concentración final | |
| NaCl | 68,96 g | 1180 mm |
| KCl | 3,58 g | 48 mM |
| HEPES | 59,58 g | 250 mM |
| K 2 HPO 4 | 2,85 g | 12,5 mM |
| MgSO4 | 3,08 g | 12,5 mM |
Tabla 2: Solución receta para el Buffer L 1 A:
Añadir 1,98 g de glucosa a 100 ml de tampón 10X KH y llevar a un volumen final de 1 L. ajustar la osmolaridad a la condición de la fisiología cerca (~ 300) con glucosa. Llevar a pH 7,4 con NaOH.
| - | Masa | La concentración final |
| 10X Buffer KH | 100 ml | 100 ml |
| Glucosa | 1,98 g | 11 mM |
| Llevar a 1 L | ||
| Llevar a pH 7,4 con NaOH | ||
| Ajustar la osmolaridad a la condición fisiológica cerca (~ 300) con glucosa. | ||
Tabla 3: Solución receta para Buffers enzima
| masa | La concentración final | |
| Colagenasa tipo II | 25 mg | 0,05% (w / v) |
| Proteasa XIV | 10 mg | 0,02% (w / v) |
| BDM | 0,025 g | 5 mM |
| Carnitina | 0,020 g | 2 mM |
| Taurina | 0,031 g | 5 mM |
| Ácido glutámico | 0,020 g | 2 mM |
| 0,1 M CaCl 2 | 12.5 uL | 25 uM |
| Tampón A | Llene hasta 50 ml |
Tabla 4: Solución receta para 25X BDM / Taurina / BSA (B / T / B)
| masa | La concentración final | |
| BDM | 0,076 g | 125 mM |
| Taurina | 0,094 g | 125 mM |
| BSA | 0,1% (w / v) | |
| Tampón A | Relleno a 6 mL |
Tabla 5: Solución receta para el Tampón B y tampones de lavado
| Buffer: | B | # 1 | # 2 | # 3 |
| Añadir: | ||||
| 0,5 M CaCl 2 | 0,4 ml | 0,1 ml | 0.125 ml | 0,15 ml |
| La concentración final de CaCl2 | 1 mM | 1 mM | 1,25 mM | 1,5 mM |
| 25X B / T / B | --- | 2 mL | 2 mL | 2 mL |
| Buffer un volumen final de | 200 ml | 50 ml | 50 ml | 50 ml |
Tabla 6: Solución Receta para los medios de comunicación cultivo
| 2X medio libre de suero (SFM) | ||
| La concentración final | ||
| (Después de la dilución) | ||
| Carnitina | 0,099 g | 10 mM (5 mM) |
| Taurina | 0,063 g | 10 mM (5 mM) |
| La creatina | 0,075 g | 10 mM (5 mM) |
| Antibiótico / antimicótico | 0,5 ml | 1% (0,5%) (v / v) |
| Los medios de comunicación 199 | 45 ml | Llene hasta 50 ml |
| 1X SFM | ||
| La concentración final | ||
| 2X SFM | 25 ml | 1X |
| Los medios de comunicación 199 | Llene hasta 50 ml | |
| 1X 5% de los medios de comunicación en suero | ||
| La concentración final | ||
| 2X SFM | 25 ml | 1X |
| FBS | 2,5 ml | 5% (v / v) |
| Los medios de comunicación 199 | Llene hasta 50 ml |
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Discussion
Un paso fundamental es la velocidad con la que se cuelga el corazón aislado hasta en el sistema de perfusión. La duración del período de digestión enzimática puede ser un poco diferente para cada rata. El ajuste depende de lo suave que el corazón se vuelve después del período normal de la digestión. La recuperación lenta de Ca 2 + después de la digestión de la enzima es esencial para la obtención de Ca 2 +-tolerantes las células sanas.
De conejillo de indias, el protocolo es el mismo salvo la hialuronidasa se utiliza en lugar de la proteasa XIV. Por lo general, nos encontramos con que el porcentaje inicial de las células vivas es menor de conejillo de indias en comparación con ratas, a pesar de que con tal de sobrevivir en la cultura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P9666 | |
| MgSO4 | Fluka | 63068 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Carnitine | Sigma-Aldrich | C9500 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Creatine | Sigma-Aldrich | C3630 | |
| Antibiotic | Cellgro | 30-009-CI | |
| Media 199 | GIBCO, by Life Technologies | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Laminin | BD Biosciences | 354232 | |
| water bath | Fisher Scientific | 15-462-5 | |
| variable flow chemical pump | Fisher Scientific | 15-077-67 | |
| 6-well culture plate | Corning | 3516 |
References
- Miriyala, J., Nguyen, T., Yue, D. T., Colecraft, H. M. Role of CaVbeta subunits, and lack of functional reserve, in protein kinase A modulation of cardiac CaV1.2 channels. Circ Res. 102 (7), e54-e64 (2008).
- SX, T. akahashi, Mittman, S., Colecraft, H. M. Distinctive modulatory effects of five human auxiliary beta2 subunit splice variants on L-type calcium channel gating. Biophys. , 84-845 (2003).
