Summary
I denna uppsats beskrev vi ett typiskt sätt att isolera och kultur vuxna myocyter råtta hjärta. Kollagenas och proteas används för att smälta och isolera enstaka myocyter. Myocyter odlade följa detta protokoll uppfyller de flesta experiment krav.
Abstract
Odlade primära vuxna gnagare hjärtceller är en viktig modell för kardiovaskulär forskning. Icke desto mindre kan inrättandet av robusta, hållbara odlade vuxen myocyter vara en tekniskt utmanande, hastighetsbegränsande steget för många forskare. Här har vi beskrivit ett protokoll för att få en hög avkastning av vuxna myocyter råtta hjärta som förblir livskraftiga kulturen i flera dagar. Hjärtat är isolerade och perfusion med kollagenas och proteas vid låga Ca
Protocol
Del I. Förberedelse för operation
- Dagen före råtta operationen, se till att alla lösningar är gjorda, men inte lägga till några enzymer ännu. Buffertar A, B och tvättbufferten alla bör filtreras för sterilitet före lagring. Buffertar bör alla vara förvaras vid 4 ° C.
- 6-och vävnadsodling plattor måste vara klädd med 10-20 mikrogram / ml laminin i 2 ml 1XSFM dagen innan också, och bör förvaras vid 37 ° C i en CO 2 inkubator.
- På dagen för operationen, förbereda kirurgiska instrument genom sterilisering klämman, sax och pincett med 70% etanol och låt dem torka på hushållspapper.
- En 1 ml spruta fylld med 0,5 ml Heparin-lösning (90 U / ml) görs redo.
- Nu är det god sed att tvätta perfusion apparaten genom att köra igenom 70% etanol, med hjälp av peristaltiska pumpen i omvänd ordning. När färdig sköljning med etanol, spola apparaten med dubbla destillerat vatten, och slutligen spola med buffert A. Flödet genom samlas i en bägare placeras i en 37 ° C vattenbad.
- För att förbereda den rengjorda perfusionen apparaten, fyller den rätta sprutan röret med 40 ml buffert A och vänster sprutan röret med 40 ml buffert B.
- Prime perfusionen slangen till spetsen av katetern genom att Buffert A till flödet genom apparaten. Fyll till bufferten spruta till 40 ml nivå. Se till att inga luftbubblor fastnar i slangen efter detta steg.
- Nu stänger bufferten En ventil spruta kranen och upprepa processen med buffert B så att perfusionen slangen nu är laddad med buffert B.
- Slutligen är perfusion apparaten vänster med buffert B vattenkranen ventilen öppen, men med strömmen slutat använda regulatorn på IV linjen.
- Kassera bufferten flow-men i insamlingen bägaren.
- Det sista sak att göra innan operationen är att lägga till nödvändiga enzymer till din stamlösning, och sedan filtrera enzymet lösningen precis som andra lösningar filtrerades dagen innan. När filtrerad, kan denna lösning lämnas vid rumstemperatur.
Del II. Råttans hjärta dissektion
- Efter standardprotokoll euthanize råttan med isofluran i en gaskammare.
- Sterilisera snittet området på bröstkorgen med 70% etanol.
- Öppna bröstet med hjälp av sax och avslöja hjärta.
- Injicera vänster kammare med 0,5 ml Heparin-lösning (90 U / ml).
- Ta hjärta med stor portion av aorta intakt plats i iskall Buffert B.
Del III. Myocyter isolering
- En typisk råtta hjärta ska ge en hög andel stavformade myocyter (i motsats till döda rundade celler) om följande förfarande tillämpas korrekt.
- Till att börja klämma aorta till katetern. Spetsen på katetern bör inte vara alltför långt in i hjärtat att säkerställa en god perfusion av hjärtat via hjärtats kranskärl.
- När fastsatt, slips aortan att katetern med en sutur.
- Därefter öppnar IV linjen regulatorn för att möjliggöra en snabb droppningstakten (~ 60 droppar / min) och låt buffert B för att tvätta ur hjärtat.
- Under Buffert B tvätta, använd en liten sax och pincett för att ta bort förmaken och alla feta eller lungvävnad klamrar sig fast i hjärtat.
- Efter Buffert B är klar, växlar flödet till Buffer A.
- Medan Buffert A får flöda i 5 minuter, bör flera små uppgifter snabbt utföras.
- Först varmt enzymet lösning i en 37 ° C vattenbad.
- Slutligen, när buffert A utarmat från sprutan (men fortfarande finns kvar i slangen), belastning 50 ml av enzymet Solution i spruta A i perfusion apparater
- Det är nu nödvändigt att kassera alla genomströmning från samlingen bägaren i vattenbad (genom att pipettera), tills det enzym Solution perfuses hjärta.
- Så snart det enzym Solution perfuses hjärtat, aktivera peristaltiska pump som är inställd för att överföra enzymet lösningen från de kollektiva bägaren att fylla sprutan A.
- Låt enzymet lösningen rinna genom hjärtat i 10 min. Som hjärtat smälter, börjar det att se ut uppsvälld.
- Tillsätt 37,5 mikroliter av 0,1 M CaCl 2 till enzymet lösning i spruta A för att ge en effektiv koncentration av 0,1 mM Ca 2 +.
- Efter 10 minuter öka koncentrationen av kalcium till 0,2 mm genom att lägga till ytterligare 50 mikroliter av 0,1 M CaCl 2 och spruta A och låt perfusionen fortsätta i ytterligare 10 minuter.
- Skär av ventriklarna och överför till en liten steril bägare som innehåller 20 ml enzym.
- I bägaren öka kalciumkoncentrationen till 0,4 mm genom att lägga till ytterligare 40 mikroliter av 0,1 M CaCl 2.
- Försiktigt finhacka hjärtat i 10 eller fler bitar med ett par små steril sax.
- Inkubera bägaren i 5 minuter vid 37 ° C med varsam gungning.
- Tillsätt 40 ml 0,1 M CaCl 2 tillger en effektiv koncentration av 0,6 mm Ca 2 + och försiktigt mal sönder hjärtat bitar med en plast överföring pipett 3-5 gånger.
- Efter inkubation under ytterligare 5 minuter vid 37 ° C, tillsätt 40 ml 0,1 M CaCl 2 och försiktigt mal sönder som tidigare.
- Separat smält enda myocyter från icke-smält bindväv med filtrering genom ett sterilt 500 ìm mesh.
- Låt cellerna att bosätta sig i en 50 ml tub i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Kassera supernatanten med en överföring pipett.
- Försiktigt resuspendera cellerna i tvättbuffert # 1 och låta cellerna att bosätta sig i 10-20 minuter i rumstemperatur.
- Medan cellerna är lösa, ta ett litet delprov, och använda denna tid som ett tillfälle att bedöma kvaliteten och livskraften hos de celler i suspension i ett inverterat mikroskop. En bra förberedelse kommer att ha en hög andel (> 80%) av stav som celler med skarpa strimmor.
- När cellerna har avgjorts, kassera supernatanten och försiktigt återsuspendera cellerna i tvättbuffert # 2. Låt cellerna lösa i rumstemperatur bör ta igen 10-20 minuter, och kassera supernatanten.
- Upprepa tvättprocessen gång med tvättbuffert # 3, och cellerna är redo för kultur.
Del IV. Myocyte cellodling
- Försiktigt resuspendera celler i 5% Serum Media. Innan du överför cellerna att plattorna vävnadskultur, tvätta plattorna med 1x SFM. Överför celler vid en önskad täthet och inkubera i en CO 2 vävnadsodling inkubator i 3-5 timmar.
- Växla media för att 1x SFM.
- Celler kan odlas upp till fyra dagar och används som krävs för experiment.
Del V. representativa resultat / Utfall
Det bör finnas mer än 70% lever hjärtat myocyter i inverterat mikroskop när protokollet görs korrekt.
Tabell 1: Lösning recept för en L 10X Ca2 +-fri KH buffert:
| massan | Slutlig koncentration | |
| NaCl | 68,96 g | 1180 mm |
| KCl | 3,58 g | 48 mm |
| HEPES | 59,58 g | 250 mm |
| K 2 HPO 4 | 2,85 g | 12,5 mm |
| MgSO 4 | 3,08 g | 12,5 mm |
Tabell 2: Lösning recept för 1 L buffert A:
Tillsätt 1,98 g glukos till 100 ml 10X KH buffert och ta med till en slutlig volym på 1 liter Justera osmolaritet till nära fysiologi villkor (~ 300) med glukos. Ta till pH 7,4 med NaOH.
| - | Mass | Slutlig koncentration |
| 10X KH buffert | 100 ml | 100 ml |
| Glukos | 1,98 g | 11 mm |
| Ta till 1 L | ||
| Ta till pH 7,4 med NaOH | ||
| Justera osmolaritet till nära fysiologiska tillstånd (~ 300) med glukos. | ||
Tabell 3: Lösning recept för Enzyme Buffertar
| massan | Slutlig koncentration | |
| Kollagenas typ II | 25 mg | 0,05% (w / v) |
| Protease XIV | 10 mg | 0,02% (w / v) |
| BDM | 0,025 g | 5 mM |
| Karnitin | 0,020 g | 2 mM |
| Taurin | 0,031 g | 5 mM |
| Glutaminsyra | 0,020 g | 2 mM |
| 0,1 M CaCl 2 | 12,5 uL | 25 um |
| Buffert A | Fyll till 50 ml |
Tabell 4: Lösning recept för 25X BDM / Taurin / BSA (B / T / B)
| massan | Slutlig koncentration | |
| BDM | 0,076 g | 125 mm |
| Taurin | 0,094 g | 125 mm |
| BSA | 0,1% (w / v) | |
| Buffert A | Fyll till 6 ml |
Tabell 5: Lösning recept för buffert B och buffertar Wash
| Buffert: | B | # 1 | # 2 | # 3 |
| Lägg till: | ||||
| 0,5 M CaCl 2 | 0,4 ml | 0,1 ml | 0,125 mL | 0,15 ml |
| Slutlig koncentration av CaCl 2 | 1 mM | 1 mM | 1,25 mm | 1,5 mm |
| 25X B / T / B | --- | 2 ml | 2 ml | 2 ml |
| Buffert A till slutliga volymen | 200 ml | 50 ml | 50 ml | 50 ml |
Tabell 6: Lösning Recept för odling Media
| 2X serumfritt Media (SFM) | ||
| Slutlig koncentration | ||
| (Efter utspädning) | ||
| Karnitin | 0,099 g | 10 mm (5 mm) |
| Taurin | 0,063 g | 10 mm (5 mm) |
| Kreatin | 0,075 g | 10 mm (5 mm) |
| Antibiotika / Antimykotika | 0,5 ml | 1% (0,5%) (v / v) |
| Media 199 | 45 ml | Fyll till 50 ml |
| 1X SFM | ||
| Slutlig koncentration | ||
| 2X SFM | 25 ml | 1X |
| Media 199 | Fyll till 50 ml | |
| 1X 5% Serum Media | ||
| Slutlig koncentration | ||
| 2X SFM | 25 ml | 1X |
| FBS | 2,5 mL | 5% (v / v) |
| Media 199 | Fyll till 50 ml |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ett avgörande steg är den hastighet med vilken den isolerade hjärtat hängs upp på perfusion systemet. Längden på enzymatisk spjälkning perioden kan vara lite olika för varje råtta. Justeringen beror på hur mjukt hjärta blir efter ordinarie digestionstid. Den sakta återhämtning av Ca 2 + efter enzymet matsmältning är viktigt för att erhålla Ca2 +-toleranta friska celler.
För marsvin, är protokollet desamma förutom hyaluronidas används i stället för Protease XIV. Vanligtvis hittar vi denna första del av levande celler är lägre för marsvin jämfört med råtta, även om de överlever lika länge i kulturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P9666 | |
| MgSO4 | Fluka | 63068 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Carnitine | Sigma-Aldrich | C9500 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Creatine | Sigma-Aldrich | C3630 | |
| Antibiotic | Cellgro | 30-009-CI | |
| Media 199 | GIBCO, by Life Technologies | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Laminin | BD Biosciences | 354232 | |
| water bath | Fisher Scientific | 15-462-5 | |
| variable flow chemical pump | Fisher Scientific | 15-077-67 | |
| 6-well culture plate | Corning | 3516 |
References
- Miriyala, J., Nguyen, T., Yue, D. T., Colecraft, H. M. Role of CaVbeta subunits, and lack of functional reserve, in protein kinase A modulation of cardiac CaV1.2 channels. Circ Res. 102 (7), e54-e64 (2008).
- SX, T. akahashi, Mittman, S., Colecraft, H. M. Distinctive modulatory effects of five human auxiliary beta2 subunit splice variants on L-type calcium channel gating. Biophys. , 84-845 (2003).
