Yetişkin Sıçan Kalp miyositler İlköğretim Kültür

Summary

Bu çalışmada, yetişkin sıçan kalp miyositler izole ve kültürü tipik bir şekilde tanımladı. Kollajenaz ve proteaz tek miyositler sindirimi ve izole etmek için kullanılır. Miyositler Çoğu deney gereksinimlerini karşılamak bu protokolü takip kültürü.

Abstract

Kültüre birincil yetişkin kemirgen kalp hücrelerinin Kardiyovasküler araştırmalar için önemli bir model sistem. Bununla birlikte, sağlam, işlevsel kültür yetişkin miyositler kurulması birçok araştırmacı için, hız sınırlayıcı teknik açıdan zor bir adım olabilir. Burada, birkaç gün süreyle kültür canlı kalır yetişkin sıçan kalp miyositler yüksek verim elde etmek için bir protokol nitelendirdi. Kalp düşük Ca altında izole ve kollajenaz ve proteaz ile perfüze

Protocol

Bölüm I. Hazırlık cerrahi için

1. Rat cerrahi bir gün önce, tüm çözümler yapılır emin olun, ancak henüz herhangi bir enzimler katmayan. Tamponlar A, B ve yıkama tamponu depolama önce sterilite için filtre olmalıdır. Tamponlar 4 ° C'de muhafaza edilmelidir
2. 6-iyi doku kültürü plakaları 10-20 mg / ml 2 ml 1XSFM laminin de önceki gün kaplanmış olmalıdır ve 37 ° C CO ₂ kuvöz içinde saklanmalıdır.
3. Ameliyatın yapıldığı gün,% 70 etanol ile kelepçe, makas, forseps ve sterilizasyon cerrahi aletler hazırlamak ve onları kağıt havlu üzerinde kurumaya bırakın.
4. 0.5 mL Heparin Çözümü (90 U / ml) ile dolu bir şırınga 1 ml hazır hale getirilir.
5. Şimdi ters peristaltik pompa kullanarak,% 70 etanol ile çalışan perfüzyon aparatı yıkamak için iyi bir uygulamadır. Bir kez etanol ile durulama bitmiş cihazın, çift distile su ile temizleyin, durulayın ve akış sonunda, 37 ° C'lik su banyosuna yerleştirilir bir beher toplanan Tampon A. ile durulayın.
6. Tampon A ve sol şırınga tüp 40 ml, 40 ml Tampon B. ile temizlenmelidir perfüzyon cihazı hazırlamak için doğru şırınga tüp doldurmak
7. Tampon bir aparat üzerinden akmasına izin vererek kateter ucu Başbakan perfüzyon tüp. Tampon, 40 ml seviyesine şırınga Dolum. Bu adımdan sonra tüp içinde sıkışıp hiçbir hava kabarcığı olmadığından emin olun.
8. Şimdi, perfüzyon boru Tampon B. ile astarlanmalıdır olduğunu tampon şırınga stopcock vanasını kapatın ve örneğin Tampon B işlemi tekrarlayın
9. Son olarak, perfüzyon aparat Tampon B valfli kapak açık kalan, ancak akışı ile IV hattı regülatör kullanarak durdu.
10. Toplama beher akış olsa tampon atın.
11. Ameliyat öncesi yapılacak en son şey, diğer çözümlerin bir gün önce filtre gibi enzim çözeltisi stok solüsyonu gerekli enzimleri eklemek ve daha sonra filtre. Süzülür sonra, bu çözüm oda sıcaklığında bırakılabilir.

Bölüm II. Sıçan kalp diseksiyonu

1. Takiben standart bir protokol, bir gaz odası İsofluranın ile sıçan euthanize.
2. % 70 etanol ile toraks kesi alanı sterilize edin.
3. Açık göğüs makas kullanarak ve kalp maruz.
4. 0.5 mL Heparin çözüm (90 U / ml) ile sol ventrikül enjekte edilir.
5. Buz Tampon B. aort sağlam, yerinde büyük bir kısmı kalp çıkarın

Bölüm III. Miyositler izolasyon

1. Aşağıdaki yordam, düzgün yapıştırılır ise tipik bir sıçan kalp çubuk şeklinde miyositler yüksek bir fraksiyonu (ölü yuvarlak hücrelere karşı) boyun eğmek zorundadır .
2. Başlamak için, kateter aort kelepçe. Kateterin ucu çok uzakta, koroner arter yoluyla kalbin iyi perfüzyon sağlamak için kalbin içine itti olmamalıdır.
3. Kelepçeli, bir dikiş ile kateter aort bağlar.
4. Sonra, hızlı bir damla oranı (~ 60 damla / dk) ve kalp yıkamak için izin Tampon B izin IV hattı regülatör açın.
5. Tampon B yıkama sırasında, kulakçıklar ve kalp yapışan herhangi bir yağ ya da akciğer dokusunda kaldırmak için küçük makas ve forseps kullanabilir.
6. Tampon B tamamlandıktan sonra, Tampon A. akım anahtarı
7. Tampon 5 dakika boyunca akmasına izin olsa da, birkaç küçük görevleri hızlı bir şekilde yapılmalıdır.
8. İlk olarak, 37 ° C su banyosunda Enzim Çözüm sıcak.
9. Son olarak, Tampon şırınga (ama hala mevcut boru) boşaldığında, şırınga Enzim Çözüm 50 ml yük bir perfüzyon aparat
10. Enzim Çözüm perfuses kalp kadar, artık tüm su banyosu (pipetleme) toplama beherine flow-through atmak için gerekli.
11. Enzim Çözüm kalp perfuses, şırınga A. doldurmak için toplama beher enzim çözeltisi aktarmak için kurulur peristaltik pompa aktive
12. Enzim çözeltisi, 10 dakika süreyle kalp akmasına izin verin. Kalp sindirir gibi, bu şişirilmiş aramaya başlar.
13. Şırınga içinde enzim çözeltisi 0,1 M CaCl ₂ 37.5 mcL ekleyin 0.1 mM Ca ² etkili bir konsantrasyon elde ^etmek.
14. 10 dakika için 0.1 M CaCl ₂ ek bir 50 mcL şırınga A ekleyerek 0.2 mM kalsiyum konsantrasyonunu artırmak ve perfüzyon bir 10 dakika daha devam edelim sonra.
15. Ventriküller kesilmiş ve 20 mL Enzim Çözüm içeren küçük bir steril beher transfer.
16. Beher 0,1 M CaCl ₂ 40 mcL daha ekleyerek 0.4 mM Kalsiyum konsantrasyonu artırır.
17. Yavaşça, küçük steril makas bir çift ile 10 veya daha fazla parçalar halinde kalp kıyma.
18. 37 5 dakika boyunca beher ° C'de nazik sallanan.
19. 40 mL 0.1 M CaCl ₂0.6 mM Ca ^{2 +} etkin konsantrasyon vermek ve kalp adet plastik bir transfer pipetlemeyin 3-5 kez yavaşça çiğnemek.
20. 37 ek bir 5 dakika inkübe sonra ° C, 40 ml 0,1 M CaCl ₂ ve yavaşça eskisi gibi çiğnemek.
21. Ayrı sindirilir tek miyositler olmayan sindirilir steril 500 mikron mesh yoluyla filtrasyon kullanarak bağ dokusu.
22. Hücrelerin oda sıcaklığında 10 dakika, 50 ml tüp yerleşmek için izin verin.
23. Bir transfer pipetlemeyin ile süpernatant atın.
24. Yıkama Tamponu # 1 yavaşça hücreleri tekrar süspansiyon ve hücrelerin oda sıcaklığında 10-20 dk yerleşmek için izin.
25. Hücrelere yerleşen olsa da, bu kez ters bir mikroskop altında süspansiyon hücrelerinin kalite ve canlılığını değerlendirmek için bir fırsat olarak küçük bir kısım almak ve kullanmak. İyi bir hazırlık net desenli hücreleri gibi bir çubuk yüksek oranda (>% 80) sahip olacak.
26. Hücreleri yerleştikten sonra, Yıkama Tamponu # 2 supernatant ve yavaşça tekrar süspansiyon hücreleri atın. Hücrelerin oda sıcaklığında dinlendiriniz, yine 10-20 dakika sürebilir ve süpernatantı atmak gerekir.
27. Yıkama işlemi tekrarlayın bir kez Yıkama Tamponu # 3, ve hücrelerin daha fazla kültür için hazır olacak.

Bölüm IV. Miyosit hücre kültürü

1. % 5 serum Medya yavaşça hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. Hücrelerin doku kültürü tabak aktarmadan önce, 1x SFM plakaları yıkayın. 3-5 saat boyunca CO ₂ doku kültürü inkübatör istenen yoğunluk ve inkübe hücrelere aktarın.
2. 1x SFM medya geçin.
3. Hücreleri dört gün kadar kültürlü ve deneyler için gerekli olabilir.

Bölüm V. Temsilcisi Sonuçlar / Sonuç

Protokolü doğru yapılır inverted mikroskop altında% 70 den fazla canlı kalp miyositler olmamalıdır.

Tablo 1: 1 L Çözüm tarifi 10X Ca ^{2 +-KH} Tampon:

	kitle	Final Konsantrasyon
NaCl	68,96 g	1180 mM
KCl	3.58 g	48 mm
Hepes	59.58 g	250 mm
K 2 HPO 4	2.85 g	12,5 mm
MgSO 4	3.08 g	12,5 mm

Tablo 2: 1 L Tampon A Çözüm tarifi:

100 ml 10X KH tampon 1.98 g glukoz ve glukoz ile yakın fizyolojisi durumu (~ 300) ozmolarite ayarlayın son hacmi 1 L. getirmek. NaOH ile pH 7.4 'e getirin.

-	Kitle	Final Konsantrasyon
10X KH Tampon	100 mL	100 ml.
Glikoz	1.98 g	11 mm
1 L Getir
NaOH ile pH 7.4 Getir
Glukoz ile yakın fizyolojik durumu (~ 300) ozmolarite ayarlayın.

Tablo 3: Enzim Tamponlar Çözüm tarifi

	kitle	Final Konsantrasyon
Kollajenaz Tip II	25 mg	0.05% (w / v)
Proteaz XIV.	10 mg.	% 0,02 (w / v)
BDM	0.025 g	5 mM
Karnitin	0.020 g	2 mM
Boğa	0.031 g	5 mM
Glutamik asit	0.020 g	2 mM
0.1 M CaCl 2	12.5 uL	25 UM
Bir tampon		50 ml doldurun

Tablo 4: 25X BDM / Taurin / BSA (B / T / B) Çözüm tarifi

	kitle	Final Konsantrasyon
BDM	0.076 g	125 mm
Boğa	0.094 g	125 mm
BSA		% 0,1 (w / v)
Bir tampon		6 ml doldurun

Tablo 5: Tampon B ve Yıkama Tamponlar Çözüm tarifi

Tampon:	B	# 1	# 2	# 3
Ekle:
0.5 M CaCl 2	0,4 mL	0.1 mL	0.125 ml	0.15 mL
CaCl 2 Final konsantrasyonu	1 mM	1 mM	1.25 mM	1.5 mM
25X B / T / B	---	2 mL	2 mL	2 mL
Nihai hacmi Tampon	200 mL	50 ml	50 ml	50 ml

Tablo 6: Kültürleme Medya İçin Çözüm Tarif

2X Serum Medya (SFM)
		Final Konsantrasyon
		(Seyreltme sonra)
Karnitin	0.099 g	10 mM (5 mM)
Boğa	0.063 g	10 mM (5 mM)
Kreatin	0.075 g	10 mM (5 mM)
Antimikotik / antibiyotik	0.5 ml	% 1 (% 0.5) (v / v)
Medya 199	45 ml	50 ml doldurun
1X SFM
		Final Konsantrasyon
2X SFM	25 ml	1X
Medya 199		50 ml doldurun
1X% 5 serum Medya
		Final Konsantrasyon
2X SFM	25 ml	1X
FBS	2.5 mL	% 5 (v / v)
Medya 199		50 ml doldurun

Discussion

Kritik bir adım, izole kalp perfüzyon sistemi üzerinde asılı olduğu hızı. Enzimatik sindirim sürenin uzunluğu, her bir sıçan için biraz farklı olabilir. Ayarı, kalp, sindirim düzenli bir süre sonra ne kadar yumuşak olur bağlıdır. Enzim sindirimi yavaş Ca ^{2 +-hoşgörülü} sağlıklı hücreleri elde etmek için gerekli Ca ^{2 +} sonra kurtarma.

Hiyalüronidaz Proteaz XIV yerine kullanılır hariç kobay için, protokol ile aynıdır. Tipik olarak, onlar gibi uzun kültürü hayatta olmasına rağmen, bu ilk canlı hücrelerin yüzdesi fareye göre kobay için daha düşük.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma-Aldrich	S6191
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P9666
MgSO4	Fluka	63068
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
CaCl2	Sigma-Aldrich	C7902
Heparin Sodium Salt	Sigma-Aldrich	H4784
Collagenase Type II	Worthington Biochemical	LS004176
Protease XIV	Sigma-Aldrich	P5147
2,3-Butanedione Monoxime (BDM)	Sigma-Aldrich	B0753
Carnitine	Sigma-Aldrich	C9500
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Glutamic Acid	Sigma-Aldrich	G1501
BSA	Sigma-Aldrich	A3294
Creatine	Sigma-Aldrich	C3630
Antibiotic	Cellgro	30-009-CI
Media 199	GIBCO, by Life Technologies	11150
FBS	Hyclone	SH30071.03
Laminin	BD Biosciences	354232
water bath	Fisher Scientific	15-462-5
variable flow chemical pump	Fisher Scientific	15-077-67
6-well culture plate	Corning	3516