Levande cell imaging av F-aktin Dynamics via Fluorescent Speckle Mikroskopi (FSM)

Summary

Urval, mikroinjektion och avbildning av fluorescerande-märkta F-aktin via fluorescerande speckle mikroskopi (FSM).

Abstract

I detta protokoll beskriver vi användning av fluorescerande Speckle mikroskopi (FSM) för att ta högupplösta bilder av aktin dynamik i PtK1 celler. En unik fördel med Mikronesiens är dess förmåga att fånga rörelsen och kinetik omsättning (montering / demontering) av F-aktin nätverk inom levande celler. Denna teknik är särskilt användbart med att dra kvantitativa mätningar av F-aktin dynamik när det paras ihop med datorseende programvara (qFSM). Vi beskriver valet, mikroinjektion och visualisering av fluorescerande aktin sonder i levande celler. Viktigt liknande förfaranden gäller för visualisera andra macomolecular församlingar. FSM har visats för mikrotubuli, intermediära filament och komplex vidhäftning.

Protocol

Avsnitt 1: få din fluorescerande aktin för FSM

Material som behövs: renat aktin, fluoroforen (Alexa, X-Rhodamine rekommenderas). G-buffert, ultracentrifugen

1. En viktig komponent för att skaffa bra Mikronesiens filmer kräver korrekt märkning av aktin (eller andra cytoskelettala proteiner) med fluoroforen som du väljer.
   Vi rekommenderar fluoroforer av Alexa (488, 568 våglängder) och X-Rhodamine succinimidyl derivat ester som riktar utsätts lysinrester på ytan av aktin.
2. När du väljer din fluoroforen och dess lämplig våglängd, se till att din mikroskop strukturen har lämpliga filter (excitation och emission) och belysning (kvicksilverströmriktare lampa och / eller laser) för att tillgodose dina lysrör tagg. Vi rekommenderar att välja våglängder i orange till rött våglängder (560-630 nm) för att minimera effekterna av auto-fluorescens och foto-skador och för att säkerställa dess förenlighet med GFP-konjugat.
3. Ren aktin kan utvinnas ur muskelvävnad tillhör råtta eller kyckling, men kräver en långvarig extraktionsförfarande från muskel aceton pulver. Muskel aceton pulver kan köpas från Invitrogen. Märkningen procedur är inte diskuteras i detta protokoll, men kan hittas här [1]
4. Alternativt kan du köpa märkt aktin proteiner från flera olika leverantörer, inklusive cytoskelettet Inc., och Invitrogen. Egen märkning tjänster är också tillgängliga via Invitrogen. Renat, omärkta aktin (både muskler och nonmuscle aktin) kan köpas från cytoskeleton Inc.
5. Oavsett om du väljer att köpa eller laga din egen märkta aktin, vill du se till att märkningen kvoten är någonstans runt 0,3 till 0,7 färgämnen per monomer av aktin. För högt märkning förhållande kan påverka omsättningen kinetik (och bindande för associerade proteiner) av aktin filament, medan en för låg märkning förhållandet kommer att leda till dåliga letar prickar (lågt signal-brus) och kan orsaka mikroinjektion problem (se nedan). Detta är en avgörande faktor för att få bra speckle bilder.
6. Före långtidsförvaring bör märkt aktin lösningen förtydligas genom att snurra på 75.000 - 80.000 xgi 20 minuter vid 4 grader Celsius. Märkta aktin bör förvaras i G-buffertlösning och höll -80 grader Celsius. Förbereda 2 uL portioner rekommenderas att minska de skadliga effekterna av upprepad frysning-tining (leder till olösliga aggregat). Avstå från att utsätta märkt aktin lösningen för direkt ljus (kommer fotoblekning av fluoroforer). Vi rekommenderar ogenomskinlig mikrocentrifugrör för långtidsförvaring.

Avsnitt 2: Beredning av celler och mikroinjektion av märkta aktin

Material som behövs: mikroinjektion nålar, mikrospruta microloaders, uppvärmd media cell, injektion buffert, hink med is, mikroskop (fas ring, faskontrast mål 40X, transjector, nål avdragare, mikromanipulator)

1. Många celltyper kan bli föremål för FSM, men att få bra speckle bilder är direkt beroende av framgången med mikroinjektion förfarande. När du väljer celler för FSM bör celler vara stora (> 50 um i diameter), bör spridas när pläterade, och vara naturligt anhängare till substrat (eller plast vävnadsodling rätter). Det hjälper också om cellens cytosolen upptar en yta större än dess kärna. De ovan nämnda kriterier säkerställer att cellerna är öppna för mikroinjektion. Sökande cellinjer inkluderar (men inte begränsat till) PtK1 [2,3], newt lungceller [4] och Aplysia nervceller [3].
2. Celler bör vara klädd på ruta glas täckglas (22 × 22 mm;. Nej 1-1/2) som har syratvättad. Standard substrat beläggning kan tillämpas på täckglas och påverkar inte mikroinjektion.
3. Rätt val av mikroinjektion nålar är beroende på storleken av spetsen öppning. Vanligtvis hål storlekar kan mycket i storlek från 0,5 um till så stort som 3 um. Vi rekommenderar dock att injektion av aktin kräver en optimal öppning storlek mellan 0,5 till 1 um. Om igensättning problem påträffas konsekvent, kan större hål storlekar plats för leverans av monomera samt oönskade polymeriserade filament aktin. Mikroinjektion nålar kan köpas via flera leverantörer inklusive Eppendorf system som gör nålar femtotip mikroinjektion. Alternativt, om en kommersiell nål avdragare är tillgänglig kan glas mikroinjektion rör köps in från Sutter och drog till specifikationen. För nybörjare rekommenderar vi att ha 10-20 drog nålar till hands innan du startar injektionsproceduren.
4. Perfekt "injektion koncentration" (slutlig koncentration av aktin laddas i din nål) av aktin är mellan 0,5 till 1,0 ug / ul baserat på en 40% märkning förhållandet färgämne till aktin monomer. Lägre märkning förhållandet din aktin kan kompenseras genom att injicera högre koncentrationer (1-3 ug / ul). Men igensättning ofta din nål kommerökas. Detta kan delvis lindras genom att använda nålar med större öppningar. Stock koncentration av aktin kan spädas genom att lägga iskall injektion buffert. Iskall ddH2O kan också användas för att späda för snabba injektioner. Vid denna punkt alla arbetar Lösningarna skall förvaras på is.
5. Belastning från 0,5 till 1,0 ul av dina aktin lösningen med en mikrospruta (smalspårig - Hamilton), eller alternativt genom att använda en microloader pipettspetsen.
6. Försiktigt avstå aktin lösningen genom att försiktigt släppa lösningen. Bubblor bör undvikas, men kan lätt tas bort genom att ta upp överflödig vätska som omger bubblan.
7. Se till att aktin lösningen vilar helt på nålspetsen. Överflödig lösning någonstans längs kapillär av nålen kan störa injektionen flödet.
8. Nu, försiktigt fast nålen, undvika kontakt med nålspetsen, till injektorn hållaren. Placera hållaren så att nålen gör en 35-50 graders vinkel mot basen av mikroskop scenen. Lägre vinklar är att föredra.
9. Sänk nålspetsen tills det knappt bryter ytan av media bad dina celler.
10. Placera nu nålspetsen (utan sänkning) så att den vilar direkt ovanför mitten av målet. Om nålspetsen är i linje med målet, bör du se en ljus gloria genom okularet. Detta är slutet på nålspetsen. Sakta flytta nålen sida till sida (med hjälp av roboten) kan bidra till att bättre lokalisera gloria.
11. Justera Z-fokus på mikroskopet tills cellerna är i fri sikt. Nu långsamt sänka spetsen tills glorian gradvis constricts tills slutligen konvergerar in i nålspetsen - du kommer att behöva kontrollera fokus (Z-position) samtidigt. En extra funktion för att leta efter är axeln av nål, som kommer att kasta linjär skuggor. Sänkning nålen kommer successivt definiera nålen axeln. När du gjort korrekt slutet av nålen och dina celler ska båda vara i fri sikt. Lätt justering av fas ringen kan krävas för att förbättra kontrasten.
12. När du navigerar, se till att nålspetsen är långt över dina celler för att förhindra att bryta nålspetsen.
13. När du väljer celler att injicera bör celler med fria kanter vara vänd mot nålspetsen. Detta kommer att säkerställa minskar lutningen på cellen (från tjockaste punkt, där kärnan är bosatt, till den tunnaste punkt i framkant) kommer att möta nålspetsen, snarare än att köra parallellt med det.
14. Nålen trycket måste ligga på 0,3 till 0,8 bar. Det konstanta trycket kommer att resultera i en stadig ström av aktin lösningen.
15. Efter att ha beslutat om en cell att injicera, placera nålen så tips är intill kärnan (perinukleära regionen, tjockaste delen av cellen där kärnan är inte direkt nedan).
16. Sakta lägre, och justera positionen av nålen tills spetsen är deprimerande membranet, nu stegvis sänka tills nålspetsen har hål i membranet. Om nålen är helt genomborrade membranet, kommer cellen ljusare, så fort du ser denna skillnad Höj nålen tills den inte längre röra cellen. Den faktiska piercing och injicera process kommer att ta 0,5 till 2 sekunder.
17. När du gjort korrekt, kommer cellen formen tycks oförändrade, medan för mycket injektion kommer att resultera i snabb indragning av cellens kant och i vissa fall kommer du att faktiskt se cellen explodera.
18. Om du inte ser förändringar i cellen när microinjecting (blir inte ljusare), kan nålspetsen stängas. Du kan testa detta genom att trycka på "rena" knappen om finns på din transjector. Om öppen, kommer detta att avsevärt öka konstant tryck flöde som kan ses genom okularen - den kommer att visas som krusningar och närliggande skräp kan ses spridning.
19. Om nålspetsen är stängd kan du välja att sätta in en ny mikroinjektion nål eller försök att bryta den nålspetsen genom att försiktigt sänka nålen tills nålspetsen pressar mot glaset täckglas, vilket gör att alldeles i slutet av spetsen att bryta. Det brott område bör inte vara mer än en 1 / ^{5: e} området nålen punkt (den del av nålen som börjar konvergera till en punkt).
20. Fortsätt med injektionen, spendera inte mer än 20 - 45 minuter för varje mikroinjektion session (beror på celltyp). Som regel är kortare sessioner rekommenderas för att minimera stress på cellerna.
21. Efter avslutad mikroinjektion, ändra cellen media i skålen genom att lägga till färska uppvärmd medier. Låt sedan cellerna att återhämta sig i 30 minuter i en kuvös innan avbildning. Detta kommer också att möjliggöra aktin att integreras i befintliga cytoskelettet nätverk.

Avsnitt 3: Sätta ihop Imaging avdelningen

Material som behövs: coverglass, dubbelhäftande tejp, Q-tips, pincett, valap, Kim torka, oxyrase, bildhantering media, rakblad, P200 piPette, ren etanol

1. Börja med att prewarming avbildning media och upptining en 15 ul alikvot av Oxyrase. Se till att skydda de ljuskänsliga oxyrase från ljus. Tillskottet av oxyrase kommer att kraftigt minska effekterna av fotoblekning.
2. Prewarm de valap, genom att ställa den varma plattan temperaturen låg. Inte överhettas / bränna valap för det kommer att förlora sin effekt som en tätning.
3. Torka av en coverglass med en kimwipe doused med ren etanol för att rengöra och ta bort skräp.
4. Stack två lika stora längder (2,5 cm lång) av dubbelhäftande tejp ovanpå varandra, med en ren plan yta som plattform. Tryck ut eventuella luftbubblor att skapa en helt platt plan.
5. Använda ett rakblad, skär två raka remsor längs den långa axeln, så att varje remsa åtgärder 0,5 cm i bredd.
6. Använd pincett, placera varje remsa mot långsidan av din coverglass så att de två remsor av tejp skapar en lucka i mitten av din coverglass. Tryck försiktigt på bandet för att göra en fin tätning med glaset. Den tejpremsor kommer att fungera som distanser mellan coverglass och täckglas.
7. Se till att valap helt har flytande innan du börjar med nästa steg.
8. Hämta din uppvärmd bildbehandling media, lägga 15 ul av oxyrase till varje 500 ul av media.
9. Vik kimwipes i trianglar för att skapa 3 hårda kanter. Detta kommer att användas för att skapa en torr yta för bandet att hålla på.
10. Hämta dina celler från inkubatorn. Använd pincett, ta ett hörn av täckglas. Snabbt placera täckglas på ett kimwipe (cell är vänd uppåt, inte vidröra vävnaden), och använd den vikta kimwipe att torka två motsatta sidor av täckglas för att skapa en halvtorr yta (om ytan där dina celler vila).
11. Använd pincett, ta ett hörn på täckglas och placera den på din coverglass så att den torra ytorna anpassas till två remsor av tejp. Meddelande Nu har du två stängda sidor och två öppna slitsar. Sakta pipett 200 ul av imaging-media-oxyrase lösning nära till en öppning. Viktigare att inga luftbubblor införas. Lösningen ska sugas upp till det nyligen samlades kammaren genom kapillärkrafter får du full upplevelse dina celler i lösning.
12. Använd en tops badda fyra hörnen av ditt täckglas med smält valap att snabbt fästa och stabilisera täckglas. Du kommer att märka att valap torkar snabbt (inom några sekunder vid rumstemperatur).
13. Nu börjar med öppna sidor (icke-bandets sida), lägg en tunn remsa av valap med hjälp av en tops och härma en borstning slaganfall. Upprepa för den stängda sidor. Sakta bygga upp lager av valap, vilket förstärker tätningen genom att upprepa beläggningen steg. Den valap bör begränsas till kanterna, vilket i mitten av täckglaset tydlig.
14. Försiktigt rengöra centrum delen av täckglas med hjälp av en tops med ddH2O att ta bort eventuella media, vara uppmärksam att inte krossa cellerna. Upprepa rengöringen steg med ren etanol.
15. Du kommer nu att ha en helt sluten avbildning kammare optimerad för speckle avbildning. Att ha en helt sluten låda kommer att hindra din fluoroforer från snabbt fotoblekning.

Avsnitt 4: Imaging celler

Material som behövs: inverterat widefield mikroskop, mecury lampa, lämpliga filter, kyls CCD-kamera med 6,7 micron pixlar hög numerisk apertur, olje-immersion Plan-apokromatiska mål (60X till 100X, fas eller DIC). Vibration bord. Imaging programvara.

1. Prewarm mikroskop scenen till 37 grader. Placera din nyligen avslutade bildbehandling kammare och vänta 10-15 minuter för temperaturen att stabilisera innan avbildning.
2. Börja med att fokusera dina celler i Bright-fältet, och sedan hitta din injiceras celler genom att växla rätt fluorescens inställningar. Försök att minimera tiden av fluorescens exponering för att minska fotoblekning.
3. Leta efter injicerade celler som har friska böjda framkanter. Över-injicerade celler (exploderade celler) ska präglas av indragen och taggiga kanter, liknar många filopodia - undvik avbildning dessa celler.
4. Förvärv inställningar beror på celltyp, kvaliteten på den märkta aktin, och komponenter mikroskop. Dock bör exponeringen inte vara större än 2 sekunder, och tidsintervall mellan bilderna bör vara mellan 5 och 10 sekunder. Typisk längd för en tidsserie (per avbildas cell) kan variera någonstans mellan 10 till 30 minuter, och begränsas av fotoblekning effekter. Gain-inställningar på kameran kan vridas upp för att öka signal-brus.
5. Idealisk speckle egenskaper bör ha varje speckle fördelade med ~ 2 speckle diameter till nästa angränsande speckle. Detta garanterar optimal tid och provtagning av aktin struktur. För epitelceller kommer spräckliga aktin nätverket visas homogen, med prickar jämnt spridda från varandra. Cellinjer som har täta stressen fibrer eller lamellipodiakommer att urskilja, men kommer att ha en prickad / spräcklig utseende. Exponeringsinställningar bör justeras för att få bästa spräckliga bilder.
6. Över-idag injiceras celler kommer att ha tätt packade fläckar som inte verkar vara diskreta. Stress fibrer och lamellipodia kommer att förlora sin prickade utseende.
7. Under-idag injiceras celler kommer att synas mycket svagt genom okularet, med fläckar som är långt ifrån varandra (> 10 prickar mellanrum) och som förekommer slumpmässigt utspridda. Stress fibrer och lamellipodia i dessa celler kommer att särskiljas.
8. Nyckeln till att få "bra" speckle filmer är att upprätthålla fokus. Detta är särskilt viktigt för post-analys där speckle flöde och mätningar omsättning. Därmed kvaliteten på den kvantitativa analysen kommer att bero på låsning i fokus för den tid tidsförlopp. Detta kan vara särskilt utmanande om bildbehandling planet är ganska tunn. Andra faktorer är beroende av stabiliteten i mikroskop systemet, i synnerhet scenen bostäder och bildbehandling kammaren. Kontrast-baserade fokusering kan användas om bilden intervallet längder är tillräckliga för att rymma den här funktionen. Andra alternativ är att köpa ett nära infraröda baserad fokus system som ger tillförlitlig realtid fokus justeringar. Du hittar dessa erbjudanden från Nikon, Olympus och ASI.

Avsnitt 5: qFSM analys

Detta avsnitt diskuteras inte i detalj, men informationen om den analys programvaran finns här [5]. Mjukvara nedladdning önskemål kan göras på vår hemsida (lccb.scripps.edu).

Ämnen som tas upp:

• Buller kalibrering
• Speckle upptäckt
• Spårning med hjälp av en hybrid strategi av bild korrelation-baserad spårning av den grova rörelse speckle områden och enskild partikel spårning av detaljerade rörelse enskilda fläckar.
• Beräkning av polymeren montering och demontering priser från den intensitet svängningar under speckle utseende och händelser försvinnande.

Discussion

Flera viktiga faktorer är avgörande för att lyckas få speckle bilder, hur bra prickar börjar och slutar med kvaliteten på din fluorescerande aktin. En hög märkning förhållande färgämne till aktin monomer, ligger runt 0,4 till 0,7 kommer att säkerställa att fläckarna kommer att visas ljusa och diskreta, medan de märkta proteinet i sig bör vara lösliga och fri från aggregat. Lika viktigt är mikroinjektion förfarande. För att säkerställa normal cell homeostas (och överlevnad), celler måste injiceras med ett lågt flöde tryck, införa en låg koncentration av märkta proteinet. Detta kräver en viss teknisk kompetens / erfarenhet avseende användning av mikroinjektion systemet. Som en allmän regel, kortare injektion gånger (<1s) är att föredra framför längre injektion gånger. Den sista avgörande komponenten är mikroskopet. Ett inverterat mikroskop paras ihop med en kvicksilver-lampa epi-belysning, finns i de flesta core faciliteter, kommer att fungera som en lämplig plattform för speckle avbildning. Förutsatt rätt fluorescens filtren är på plats, kombinationen av en hög NA mål och en kyld CCD-kameran kommer att producera högupplösta bilder av ljusa fläckar. Vi rekommenderar att använda hög förstoring (100x), hög NA (> 1,3), Plan-apochromat mål som ger överlägsen upplösning och ljusstyrka. Under idealiska injektion förhållanden kan förstoringen sänkas till 60X, öka ljusstyrkan och SNR per pixel. Låg ljudnivå, hög quantum effektiv, kyls CCD-kameror, med Pixel storlekar på ~ 6,5 mikrometer är idealiska detektorer, och i vissa fall kan kompensera för dålig kvalitet fluorescerande prober. Dessutom kan fluorescerande proteinet sonder vara tillsammans injiceras med cDNA konstruktioner (nucleoinjection) att uttrycka GFP / RFP konjugerade proteiner inom samma cell. Detta kräver nucleoinjection av cDNA i kärnan av celler, följt av en andra injektion i den omgivande cytoplasman. Sammanfattningsvis innehåller FSM aldrig tidigare skådad inblick i cytoskelettet dynamik. Att få bra fläckar kräver riktigt prober, utrustning och lite tålamod (utbildning).

Materials

Injection buffer (IB) 50 mM potassium glutamate 0.5 M MgCl2 (APPENDIX 2A) Store up to 2 years at −20° C G-buffer 2 mM Tris⋅Cl, pH 8.0 (APPENDIX 2A) 0.2 mM CaCl2 (APPENDIX 2A) Add just before use: 0.2 mM ATP (see recipe for 100 mM) 0.5 mM 2-mercapt–thanol Store up to 1 day at 4° C