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Biology

मानव अग्नाशय आइलेट अलगाव: भाग द्वितीय: और मानव islets के शोधन और संस्कृति

doi: 10.3791/1343 Published: May 26, 2009

Summary

उच्च गुणवत्ता और मानव islets की उचित मात्रा में हासिल सफल आइलेट प्रत्यारोपण के लिए प्रमुख किसी और चीज की की है. इस वीडियो में, हम कदम से कदम का वर्णन एक संशोधित स्वचालित पद्धति का उपयोग मानव अग्नाशय आइलेट (भाग द्वितीय: और मानव islets की शुद्धि और संस्कृति) अलगाव के लिए प्रक्रियाओं.

Abstract

टाइप 1 मधुमेह के प्रबंधन को भारी है, दोनों व्यक्ति और समाज के लिए, 100 से अधिक अरब डॉलर सालाना लागत. ग्लूकोज की निगरानी और नए इंसुलिन योगों के व्यापक उपयोग के बावजूद, कई व्यक्तियों को अभी भी विनाशकारी माध्यमिक जटिलताओं के विकास. अग्नाशय आइलेट प्रत्यारोपण मधुमेह के रोगियों में सामान्य ग्लूकोज नियंत्रण के पास बहाल कर सकते हैं

Protocol

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1. Islets की शुद्धि

  1. आइलेट शुद्धि प्रक्रिया शुरू करने के लिए, COBE बैग लोड, हरे रंग की ट्यूब को छोड़कर सभी ट्यूबों दबाना, और 1500 के लिए गति सेट और सुपर 0 से बाहर.
  2. हुड में पंप और ढाल beakers सेट और हरे रंग की ट्यूब संग्रह टयूबिंग कनेक्ट.
  3. अब 1.100 ficoll की लोडिंग शुरू कर सकते हैं: धक्का "स्पिन" तब सामने बीकर 1.100 Ficoll के 110 मिलीलीटर जोड़ने, और पंप शुरू क्रम में COBE बैग लोड. के रूप में Ficoll भरी हुई है, सुपर प्रेस बाहर, पंप बंद, पंप सिर unclamp और 100 सुपर बाहर गति सेट.
  4. जब ficoll बीकर पहुँचता है और सभी हवा टयूबिंग, पंप सिर पर फिर से दबाना से निष्कासित कर दिया है. स्पिन 3000 के लिए, गति और सुपर बाहर गति 0 करने के लिए सेट.
  5. अब सामने बीकर में भारी ढाल गिरने से gradients लोड तैयार करते हैं. थोड़ा किसी भी हवा निकालने के दो beakers के बीच दबाना जारी है. फिर वापस बीकर में प्रकाश ढाल डालना.
  6. चुंबकीय उत्तेजक चालू COBE मशीन पर "स्पिन" प्रेस, दो beakers जोड़ने ट्यूब से दबाना को निकालने के और नेत्रहीन सत्यापित करें कि भारी और प्रकाश gradients के मिश्रण कर रहे हैं.
  7. एक बार gradients के मिश्रण शुरू कर दिया, अपकेंद्रित्र पर बारी. एक मिनट रुको, और फिर पंप पर बारी करने के लिए मिश्रण gradients लोड.
  8. लोड ऊतक ढाल सामने बीकर में कम चलाने के लिए, लेकिन, तो काफी कम हवा लोड हो रहा है ट्यूब में प्रवेश करने की अनुमति नहीं beakers जोड़ने ट्यूब reclamp और ऊतक लोड.
  9. ऊतक के बाकी जोड़ने जारी रखें. फिर ट्यूब कि धोने के समाधान के 50 मिलीलीटर के साथ ऊतक आयोजित धोने, और यह सामने बीकर धोने का उपयोग करने के लिए.
  10. के रूप में ऊतक के पिछले बैग में प्रवेश करती है, साथ ही साथ पंप बंद करो, पंप सिर पर unclamp, और बैग ऊपर टयूबिंग दबाना. 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र जारी रखें.
  11. जबकि centrifugation जारी है, हुड के 12 संग्रह ट्यूबों लाने और उनके टोपियां ढीला. पीले रंग की ट्यूब संग्रह टयूबिंग संलग्न, और शंक्वाकार 1 ट्यूब में बाँझ संग्रह नोक जगह. तब पीले ट्यूब unclamp, और हरे रंग की ट्यूब दबाना.
  12. जब स्पिन समाप्त होता है, धीरे धीरे 100 से Superout बढ़ा. 1 ट्यूब में 150 मिलीलीटर ले लीजिए. फिर 2-12 ट्यूबों में 30 मिलीलीटर इकट्ठा (200-230 मिलीलीटर से).
  13. एक बार जब पूरा संग्रह है, COBE पर "STOP" धक्का. अब जब कि शुद्धि समाप्त हो गया है, islets और मूल्यांकन किया जा सकता है सुसंस्कृत.

2. नमूना और संस्कृति

  1. शुद्ध islets भिन्न इकट्ठा करने के बाद, 12 संग्रह ट्यूबों में से प्रत्येक से एक नमूना हटाने और Dithizone साथ दाग. धुंधला दिखाएगा जो परतें हैं कम शुद्धता islets के साथ उच्च शुद्धता islets बनाम परतों होते हैं.
  2. उच्च और कम शुद्धता के ऊतकों और पूल प्रत्येक एक साथ ले लीजिए.
  3. घुमाओ और दो बार धोने. दूसरा धोने के बाद, अंतिम धो मीडिया के साथ प्रत्येक के 250 मिलीलीटर मात्रा को लाने.
  4. आकलन जमा भिन्न जमा कम से और एक 1 मिलीलीटर नमूना भिन्न के उच्च से दो एक मिलीलीटर नमूने लेने के द्वारा शुरू करते हैं. एक शंक्वाकार धोने के समाधान के 9 मिलीलीटर युक्त ट्यूब में प्रत्येक 1ml नमूना स्थानांतरण.
  5. फिर प्रत्येक 15 मिलीलीटर ट्यूब से गिनती पकवान 1 मिलीलीटर हस्तांतरण. खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की जांच करने और गिनती.
  6. (कुल / दशमलव में islets के ईआईऍन शुद्धता) / (फ्लास्क प्रति 30,000 EIN): गिनती कोशिकाओं निम्न सूत्र का उपयोग islets संस्कृति की जरूरत बोतल की संख्या की गणना के बाद. उदाहरण के लिए, 90% शुद्धता के साथ 100,000 islets 4 बोतल में सुसंस्कृत हैं.
  7. T175 बोतल और संस्कृति 37 में islets के स्थानांतरण ˚ सी और 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर.

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Discussion

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मानव आइलेट अलगाव की तकनीक में महत्वपूर्ण प्रगति के बावजूद, आइलेट उपज उच्च चर और अप्रत्याशित रहेगा. पचा अग्नाशय के ऊतकों के शोधन सफल enzymatic पाचन के बाद प्रत्यारोपण के लिए एक पर्याप्त टापू जन ठीक करने के लिए महत्वपूर्ण है. यूआईसी शुद्धि विधि है क्योंकि अत्यधिक शुद्ध मानव islets की एक बेहतर वसूली इस पद्धति का उपयोग करके प्रदर्शन किया गया था की सिफारिश की है. इसके अलावा, पचा ऊतक के ऊपर से 50 मिलीलीटर शुद्धि के लिए एक एकल चलाने के Cobe में लोड किया जा सकता है, इस प्रकार कुल अलगाव पर इस्तेमाल किया समय छोटा करके ischemia-जुड़े रहे हैं मानव islets की चोट को कम.

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Acknowledgments

शिकागो में इलिनोइस विश्वविद्यालय से स्थापना के रूप में अच्छी तरह के द्वारा समर्थित आइलेट सेल संसाधन केंद्र NIH अनुदान (RFA-05-003 आर आर), क्रिस्टोफर फाउंडेशन, Efroymson फाउंडेशन, और Tellabs फाउंडेशन के रूप में.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Centrifuge equipment Beckman Coulter Inc. 424803
Cobe 2991 Cell Processor equipment Gambro. BCT 2556 islet purification
MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 equipment Leica Microsystems 4103
Cell Culture Dish with 2 mm Grid equipment Nalge Nunc international 174926 islet counting
Digital Sight DS L1 equipment Nikon Instruments 217267
COBE bag disposable equipment O.R. Solution 66707003
T175 culture flask disposable equipment Sarstedt Ltd 83.1812.500
University of Wisconcin (UW) solution reagent DURAMED 1000-46-06
Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) reagent Mediatech, Inc. 99-597-CM
Ficoll 1.100 reagent Bichrom AG L6155
M199 media (wash solution) reagent Mediatech, Inc. 99-784-CM
Final wash/Culture Medium reagent Mediatech, Inc. 99-785-CV
Dithizone reagent Sigma-Aldrich D5130

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References

  1. Shapiro, A. M. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
  2. Nano, R. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia. 48, 906-912 (2005).
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मानव अग्नाशय आइलेट अलगाव: भाग द्वितीय: और मानव islets के शोधन और संस्कृति
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Cite this Article

Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets. J. Vis. Exp. (27), e1343, doi:10.3791/1343 (2009).More

Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets. J. Vis. Exp. (27), e1343, doi:10.3791/1343 (2009).

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