Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

الكهربية في تسجيل ذبابة الفاكهة الأجنة

Published: May 21, 2009 doi: 10.3791/1348
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Biological Sciences, University of Illinois, 2Department of Biological Sciences, Vanderbilt University

Summary

من التسجيلات الكهربية

Abstract

ذبابة الفاكهة نموذجا رئيس الوزراء الجينية لدراسة كل من التطور الجنيني وعلم الأعصاب وظيفية. تقليديا ، لا بأس هذه الحقول المعزولة عن بعضها البعض ، مع تواريخ مستقلة إلى حد كبير والمجتمعات العلمية. ومع ذلك ، فإن التفاعل بين هذه المجالات المتباينة عادة البرامج التنموية الكامنة وراء اكتساب الخصائص الكهربائية وتمايز وظيفي الإشارات الكيميائية من نقاط الاشتباك العصبي وظيفية خلال المراحل النهائية لتشكيل الدوائر العصبية. هذه الواجهة هي منطقة ذات أهمية حاسمة للتحقيق فيها. في ذبابة الفاكهة ، وهذه مراحل التطوير الوظيفي يحدث خلال الفترة من 8 ساعات <(عند درجة 25) خلال الثلث الأخير من مرحلة التطور الجنيني. واعتبر هذه الفترة الطويلة في وقت متأخر نظرا لالتنموية المستعصية التحقيق إلى ترسب من إهاب صعبة ، والبشرة غير منفذة. وكان مقدما اختراق تطبيق المياه البلمرة الغراء الجراحية التي يمكن تطبيقها محليا لإهاب لتمكين تشريح للرقابة في وقت متأخر من مرحلة الأجنة. مع شق طولي ظهري ، يمكن وضع الجنين شقة ، وكشف الحبل البطني العصب وعضلات الجسم الحائط لتحقيق التجريبية. ويمكن عندئذ خلية كاملة التصحيح ، المشبك تقنيات يمكن استخدامها لتسجيل من الخلايا العصبية بشكل فردي ، يمكن تحديدها والعضلات الجسدية. وقد استخدمت هذه التكوينات تسجيل لتتبع ظهور ونضوج التيارات الأيونية ونشر عمل محتمل في كل من الخلايا العصبية والعضلات. وقد اتسمت هذه المسوخ الوراثية التي تؤثر على الخواص الكهربائية للكشف عن التركيب الجزيئي للقنوات ايون وما يرتبط بها من مجمعات الإشارة ، والبدء في استكشاف الآليات الجزيئية للتمايز وظيفي. وثمة تركيز خاص على تجميع اتصالات متشابك ، سواء في الجهاز العصبي المركزي والأطراف. وglutamatergic الوصل العصبي العضلي (NMJ) هو الأكثر الوصول إلى مزيج من التصوير الضوئي وتسجيل الكهربية. ويستخدم الزجاج الكهربائي الشفط لتحفيز الأعصاب الطرفية ، وتقاطع مع التسجيلات (EJC) الحالي مثير المحرز في العضلات فرضت الجهد. وقد تم استخدام هذا التكوين لرسم تسجيل التمايز الوظيفي للالمشبك ، وتتبع ظهور ونضوج قبل المشبكي خصائص الافراج الغلوتامات. بالإضافة ، يمكن أن يعاير خصائص بعد المشبكي بشكل مستقل عن طريق iontophoretic أو تطبيق ضغط الغلوتامات مباشرة إلى سطح العضلات ، لقياس مدى نضج ومظهر من الحقول مستقبلات الغلوتامات. وهكذا ، يمكن مراقبة كل من العناصر السابقة وبعد المشبكي بشكل منفصل أو مجتمعة خلال synaptogenesis الجنينية. وقد تم استخدام هذا النظام بشكل كبير لعزل وتوصيف طفرات جينية الجنينية التي تعوق تشكيل المشبك ، وبالتالي تكشف عن الآليات الجزيئية التي تحكم مواصفات وتمايز الاتصالات المشبك والوظيفية خصائص متشابك الإشارة.

Protocol

الجزء 1 : الأجهزة والمعدات

  1. تسجيل الكهربية من أجنة ذبابة الفاكهة يتطلب أولا الكفاءة في أساليب تشريح الجنينية ، والتي تم وصفها في آخر الفيديو إن الرب.
  2. تسجيل الكهربية من أجنة ذبابة الفاكهة تستخدم تكوينات القياسية تسجيل التصحيح المشبك. معدات التصحيح تسجيل المشبك والبرمجيات المناسبة للكثير من الأعمال التحضيرية الأخرى أيضا مناسبة للتسجيل من أجنة ذبابة الفاكهة. لأنه يتم لصقها أجنة ذبابة الفاكهة لتغطية زلة أثناء تشريح ، ينبغي للغرفة قبول تسجيل ينزلق الغطاء. سمك إعداد والطريقة التي يتم تركيبه على ساترة يتطلب المجهر تستقيم مع مدينة دبي للإنترنت بصريات ممتازة وطويلة المسافة عدسة العمل.
  3. يتم استخدام نوعين من الحلول لتسجيل حمام الكهربية ؛ 1) "معيار" (جان وجان ، 1976a) أو "تعديل المعيار" (Broadie ، 2000) ملاحات ، على أساس الحلول شيوعا للتسجيل في النظم الأخرى اللافقارية ، و 2) "الدموي مثل" (HL) ملاحات (ستيوارت وآخرون 1994) ، حلا وسطا بين المالحة القياسية وقياس التركيزات الأيونية الدموي في ذبابة الفاكهة. تجدر الإشارة إلى أن أيا من هذه ملاحات تحاكي بدقة التركيزات الأيونية قياسها في الدموي ، والتي هي غير مواتية للتسجيل (Broadie ، 2000). يتضمن معيار المالحة (مم) : 135 كلوريد الصوديوم ، 5 بوكل ، 4 MgCl 2 و 1.8 CaCl2 ، 72 السكروز ، 5 TES ، ودرجة الحموضة 7.2.

الجزء 2 : تكوين تسجيل

  1. لإجراء التجارب الفسيولوجية ، يتم وضع الجنين إعداد تشريح في غرفة صغيرة شبكي تسجيل (<0.5 مل) ، والنظر إليه في ضوء تنتقل مع المجهر المركب تستقيم مزودة المقابل تدخل الفرق (Nomarski) البصريات وعلى بعد مسافة طويلة في العمل 40 - 100X ( عادة 40X) الغمر بالمياه الهدف (Broadie وباتي ، 1993a). تكون عادة مصنوعة التسجيلات تحت درجة حرارة الغرفة (16-22 درجة مئوية) ، مع صعوبة متزايدة في درجات حرارة مرتفعة (22 + درجة مئوية). نحقق ذلك عن طريق تبريد غرفة تبريد بدلا من preapartion.
  2. يمكن سحب ماصات التصحيح من مجموعة متنوعة من الألياف المليئة النظارات (مثل الزجاج البورسليكات ، 1 مم الخارجي) ، ونصائح ينبغي النار مصقول لالمقاومات النهائية 50-10 MΩ. يتم وضع سلك الأرض كلوريد الفضة في الحمام. وتتضخم الإشارات باستخدام مكبر للصوت التصحيح ، المشبك (مثل Axopatch - 1D ، الآلات أكسون) وتصفيتها مع مرشح بسل 8 قطب في 10/02 هرتز ، وأخذ عينات منها إما على الخط أو تخزينها رقميا لتحليلها لاحقا.
  3. وغالبا ما أدلى التقليدية التصحيح ، المشبك التسجيلات عند 18 درجة مئوية مع ماصات التصحيح سحبها من الألياف الزجاجية البورسليكات مملوءة (نصائح حرارة مصقول لمعرف ~ ميكرون 1). السجلات الحالية مصنوعة من الألياف العضلية التي تم تحديدها في المشبك متعدد النوى ذات الجهد (معيار امكانات عقد -60 إلى -80 فولت) (Broadie وباتي ، 1993a - D ؛ Broadie وآخرون ، 1997 ؛. Fergestad وآخرون ، 1999 ؛ فيذرستون وآخرون ، 2000). الحل ماصة التصحيح يحتوي على (مم) : 120 بوكل ، 20 KOH ، 4 MgCl 2 ، 0.25 CaCl 2 ، 5 EGTA ، 4 نا 2 ATP ، 36 السكروز ، وقسم التدريب والامتحانات 5 ، مخزنة عند pH 7.2. يتم تسجيل أقطاب العودة شغلها.

الجزء 3 : تسجيل العضلات

  1. من حيث المبدأ ، قد يتم تسجيل أي عضلة من الجنينية في هذا الإعداد. في الممارسة العملية ، وركزت معظم تسجيل على عضلات كبيرة ، طولية بطني في طبقة العضلات الداخلية أقصى (باتي ، 1990 ؛ Broadie وباتي ، 1993a ، ج). كما تم سجلات مصنوعة من العضلات الظهرية والجانبية من هذه الطبقة العضلية (Kidokoro ونيشيكاوا ، 1994 ؛ أولد وآخرون 1995 ؛. نيشيكاوا وKidokoro ، 1995 ؛. بومغارتنر في مخيم 1996). ومع ذلك ، فإن معظم التجارب التي تركز على مجموعة من أربعة عضلات ، طولية بطني (6،7،12،13) ، ولا سيما العضلات 6 في البطن الأمامي (A2 - A3).
  2. مطلوب أي علاج الأنزيمية قبل تسجيل العضلات في الأجنة الصغار (<AEL ساعة 16). ومع ذلك ، غمد العضلة تطور الجنين في وقت لاحق (> 16 ساعة AEL) ويجب إزالتها مع كولاجيناز (كولاجيناز النوع الرابع (1) ملغم / لتر في المياه المالحة الموجبة خالية ثنائي التكافؤ ، 0،5-2 دقيقة في RT) قبل تسجيل التصحيح. بعد العلاج الانزيم ، المقاومات الختم على العضلات وعادة ما تكون> 1 GΩ.
  3. ويمكن إجراء التصحيح ، المشبك التسجيلات من عضلات الجنينية باستخدام عدد من التقنيات القياسية (Broadie وباتي 1993a - C ؛ Broadie وآخرون 1994 ، 1995 ، 1997 ؛. نيشيكاوا وKidokoro ، 1995). أي معيار التصحيح ، المشبك الاختلافات -- الخلايا المرفقة ، من الداخل إلى الخارج ، خارج التدريجي -- يمكن أن تستخدم لسجل واحد في نشاط قناة العضلات أو بقع معزولة غشاء العضلات. عموما يمكن ملاحظة واحدة قناة نشاط مستقبلات الغلوتامات (~ 12 -60 السلطة الفلسطينية في بالسيارات) على مرحلة من السقوط العفوي التيارات تقاطع مثير (sEJCs) المسجلة في وضع الخلية بأكملها.
  4. ويتم تسجيل أكثر في التكوين تسجيل كامل الخليةuration ، يتحقق بسهولة من حالة الخلية المرفقة مع شفط طفيف أو الكهربائية "الطنانة". يمكن تسجيل العضلات إما من الجهد في المشبك (نموذجي امكانات عقد -60 إلى -80 فولت) أو تكوينات الجاري المشبك. يمكن العضلات في أصغر أجنة (<13 ساعة AEL) لن تكون فعالة الجهد فرضت بسبب اقتران واسعة بين myotubes الجنينية (Broadie وباتي ، 1993a) ، وهذا لا يعتبر عادة مشكلة أثناء وقت لاحق (14 + ساعات AEL) في المراحل التطورية (اويدا وKidokoro ، 1996).
  5. ويمكن استخدام النيستاتين - مثقبة التصحيح ، المشبك تسجيل للتحقق من السجلات التي تم الحصول عليها باستخدام تقنيات خلية كاملة القياسية (Broadie وباتي ، 1993a). يتم حل ثقب على النحو التالي : 10 ملغ pluronic F - 127 (المسابر الجزيئية ف 1572) يذوب في DMSO 20 مل و 10 ملغ النيستاتين المذاب في هذا الحل لجعل المخزون. يضاف 100 ميكرولتر من الأسهم إلى 5 مل ماصة تصفيتها حل لجعل حل التسجيل. وعادة ما يتم الحصول على كامل الخلية التيارات <3 دقائق بعد تشكيل الختم. ويزداد بشكل ملحوظ المقاومة سلسلة في معظم الحالات وخلايا يمكن أن تتطور تيار التسرب المتزايد (Broadie وباتي ، 1993a).
  6. في خلية كاملة الجهد الحالي في بوابات الجنينية ناضجة (واليرقات) ويتألف من خمسة مكونات العضلات البارزة (وو وHaugland ، 1985 ؛ Zagotta وآخرون 1988 ؛ Broadie وباتي ، 1993b). : والكالسيوم الداخل الحالية (I CA) وأربعة تيارات البوتاسيوم الخارج (تسونودا وSalkoff ، 1995) ، من بينهم اثنان من الصيام ، والتيارات تعطيل ، والجهد ، بوابات (I A) والتي تعتمد على الكالسيوم (I CF) ، واثنين من تأخير ، وعدم تعطيل التيارات ، والجهد بوابات (I K) والتي تعتمد على الكالسيوم. (I CS) يمكن استخدام بدائل ايون تجارب لتشريح هذه التيارات من استجابة خلية كاملة خلال المشبك الجهد (Broadie وباتي ، 1993b).

الجزء 4 : تحفيز الاعصاب مفرق وتسجيل

  1. الأسلوب الأكثر شيوعا وموثوق بها من التحفيز الكهربائي NMJ يستخدم الشفط الزجاج على الأعصاب الطرفية قطعي. يمكن سحب أقطاب الشفط من مجموعة متنوعة من الألياف الزجاجية القطب مملوءة (1-1،5 قطرها ميكرون الخارجي) ، وينبغي إطلاق النار مصقول لتحقيق تكوين المطلوب (~ قطرها 5 ميكرومتر الداخلية). ويوجه قطعة صغيرة (<50 ميكرون) من العصب المحرك القطعة المناسبة في ماصة مع طيف الامتصاص لتشكيل ختم مشددة.
  2. ومن الشائع لتحفيز العصب سليمة من خلال الاعتماد في حلقة من العصب بالقرب من نقطة الخروج الجهاز العصبي المركزي. هذا النهج يسمح التحفيز سهلة التحضير سليمة ، ولكن لها مساوئ التي يمكن أن تحدث عفويا فرضه الجهاز العصبي المركزي ، أثار النشاط على النموذج التحفيز التطبيقية. بديل هو لتحفيز العصب المحرك قطع. ويمكن تحقيق ذلك إذا تمت إزالة الجهاز العصبي المركزي ، على الرغم من أن هذا الإجراء يميل إلى امتداد العصب ويمكن أن تسبب أضرارا. ويمكن أيضا أن يكون قطع العصب مع microelectrode زجاج حادة ، ولكن هذا الإجراء هو شاقة وصعبة. فمن المستحسن أن تكون من إعداد سجلات سليمة.
  3. ويمكن تطبيق التحفيز مع مجموعة متنوعة من النماذج. التحفيز وجيزة (0،2-1 ميللي ثانية) يعمل على نحو أفضل وشدة الاستثارة (عادة 1-5 V) سيتوقف على تكوين السحب ويجب أن يتحدد تجريبيا لكل خلية. هو أفضل طريقة لتحقيق التحفيز Suprathreshold العصب المحرك عن طريق وضع قوة الحافز أعلاه قليلا (1-2 فولت) العتبة. وقد سجلت استجابات NMJ من العضلات التصحيح فرضت على النحو المبين أعلاه. يمكن أن تكون الأداة الصدمة انخفضت انخفاضا كبيرا مع استخدام الارض ظاهري معزولة.
  4. ثمة بديل أقل موثوقية لتحفيز العصب شفط القياسية هو التحفيز الكهربائي المباشر للنظام العصبي المركزي (نيشيكاوا وKidokoro ، 1995). يتم إدراج microelectrode مليئة بوكل M 3-4 (أو شركة الخطوط الجوية الكويتية) في منتصف العقدة البطنية والبقول الإيجابية microamp 2 ~ في كثافة و(1998 Dietcher وآخرون) ~ يتم تسليم 2 ميللي ثانية في المدة. وينبغي أن يكون الطرف الكهربائي في أقرب neuropil hemisegment حيث هو المطلوب التحفيز. يتم تسجيل انتقال متشابك في العضلات التصحيح فرضت في التكوين القياسية.
  5. وNMJ الجنينية يمكن الوصول إلى تسجيل التصحيح ، المشبك خلية كاملة في جميع أنحاء تمايز فيها. مثير للتسجيلات صلي (EJC) الحالي ، يتم تسجيل إشارات مع مكبر للصوت التصحيح ، المشبك القياسية وتصفيتها (عادة في 1-2 كيلو هيرتز) ، وتحويلها إلى إشارة رقمية باستخدام واجهة التناظرية إلى الرقمية ، والتي يتم الحصول عليها باستخدام جهاز كمبيوتر المناسبة البرمجيات.

الجزء 5 : الوصل العصبي العضلي الكيميائية والعقاقير تطبيقات

  1. يمكن أن يكون أي صغيرة ، جزيء مشحون iontophoresed على نحو فعال في NMJ الجنينية (Aravamudan وآخرون ، 1999 ؛. Fergestad وآخرون 1999 ، 2001). يمكن سحب ماصات Iontophoretic لتكوينات معينة ، مع تطبيقات لفترات متغيرة ، وذلك باستخدام نبضات الحالية سلبية أو إيجابية. أنه أمر حيوي لمنع التسرب بين بوlses مع الدعم المناسب المعارضة الحالية (Broadie آخرون 1993d ؛ فيذرستون وآخرون 2002 ، 2005 ؛. Rohrbough وآخرون 2007). وحجم هذا الدعم الحالية تختلف مع تكوين ماصة وينبغي أن تحدد تجريبيا.
  2. وقد أجريت تجارب عديدة مع NMJ العصبي ، L - الغلوتامات (جان وجان ، 1976b) ، وذلك باستخدام محلول المخزون 100mM (أحادي الصوديوم الملح ؛ الحموضة 8-9) (Broadie وباتي ، 1993c). وقد استخدمت ماصات iontophoretic مقاومة عالية (100-200 MΩ) لمستقبلات الغلوتامات (gluR) رسم الخرائط (Broadie وباتي ، 1993d) ، وماصات مقاومة أقل (20-50 MΩ) المستخدمة لتقدير استجابة gluR الإجمالي (Broadie وآخرون. 1995 ، 1997 ؛ فيذرستون وآخرون 2002 ، 2005 ؛. Rohrbough وآخرون 2007). نبضات قصيرة (0،1-1 مللي) من السلبية العمل (~ 10 NA) الحالي ، مع وجود الدعم ، سواء كان إيجابيا الحالية الصغيرة لمنع التسرب.
  3. غير المشحونة ويمكن تطبيقها الجزيئات المشحونة التي طرد الضغط (Fergestad وBroadie ، 2001 ؛. فيذرستون وآخرون 2001). للتطبيق ، يتم وضع ماصة طرد الضغط (<5 ميكرون القطر الداخلي) الذي يحتوي على حل قريب (<10 ميكرون) من المحطة الطرفية العصبية. يمكن تطبيق حل يمكن إخراجه باستخدام picospritzer (PSI 5-10) أو غيرها من مصدر الهواء المضغوط (فيذرستون وآخرون ، 2002). خلال التجارب لفترات طويلة ، ينبغي perfused غرفة التسجيل (حجم <0.5 مل) بشكل مستمر (0،1-0،2 مل / ثانية) مع حمام المالحة العادي.
  4. وقد أجريت تجارب عديدة مع ملحي مفرط التناضح لتحريك انصهار حويصلات متشابك (Broadie وآخرون 1995 ؛. Aravamudan ، وآخرون ، 1999 ؛. Fergestad وآخرون ، 1999 ؛. فيذرستون ، وآخرون ، 2000 ، 2002). وقد أجريت تجارب أخرى مع السموم ، مثل argiotoxin 636 ضد مستقبلات الغلوتامات السم الأسود والعنكبوت latroinsectotoxin أرملة تحتوي على (Broadie وآخرون 1995).

الجزء 6 : التكميلية العضلية تقنيات التصوير مفرق الحيوية

  1. يمكن رصد حركية حويصلة متشابك مع الأصباغ الفلورية stryl محبة للدهون (Fergestad وBroadie ، 2001 ؛. Rohrbough وآخرون 2004). ويمكن توزيع حويصلات الملاحظة المباشرة ، وقياس معدلات الإلتقام وإيماس. وقد بذلت عدة أنواع مختلفة مع خصائص فلوري (FM1 - ​​43 ، فلوريسئين مثل ؛ FM4 - 64 ، رودامين الشبيهة). أثمرت تعديلات في صبغ المنتجات الأصلية مع خصائص مسعور تغيير ، وبالتالي مع حركية تبييض مختلفة ، مثلا ، FM2 - 10 تنأى أسرع بكثير من الغشاء.
  2. لتسمية NMJ الجنينية مع الأصباغ stryl ، يمكن تحميل 10 ميكرومتر FM1 - ​​43 لمدة 1-5 دقائق باستخدام البوتاسيوم خارج الخلية مرتفعة (50-90 ملم) (Fergestad وBroadie ، 2001). ويمكن تحقيق نهج أكثر الفيزيولوجية عبر تحفيز العصب الكهربائي بواسطة الشفط. ثم يتم غسلها مرارا وتكرارا في التحضيرات كا 2 + خالية العازلة لمدة 5 دقائق ، واحتفظت مضان (تمثل الحويصلات متشابك مصبوغ) قياسه. لقياس إيماس ، يمكن للمرء تحميل الصبغة باستخدام البوتاسيوم مرتفعة أو التحفيز الكهربائي العصبية.
  3. وقد تم إنتاج البروتينات الانصهار مع المتغيرات GFP السماح متعدد الألوان توسيم المشبك NMJ الجنينية (العلامة التجارية ، 1999 ؛. تشانغ وآخرون 2002). معربا عن العديد من الجينات GFP الموسومة البروتينات هي المتاحة بما في ذلك علامات غشاء العامة (على سبيل المثال ، mCD8 GFP) ، وعلامات بعد المشبكي (على سبيل المثال ، شاكر GFP ، GluRIIA - GFP) ، هيكل الخلية (على سبيل المثال أكتين - GFP ، moesin - GFP ، تويولين - GFP) والميتوكوندريا علامات (مثل C - السيتوكروم GFP) وعلامات حويصلة متشابك (على سبيل المثال ، synaptobrevin GFP ، synaptotagmin - GFP ؛ تشانغ وآخرون ، 2002).
  4. مقصورات للصحفيين GFP التسمية التي هي حيوية للغاية ويمكن استخدامها لتقييم ميزات تنموية أو الظواهر متحولة (فيذرستون وBroadie ، 2000). تبيض ثم مراقبة انتعاش مضان (FRAP) وقد تبين أن يكون ذلك ممكنا ، على الأقل على ذبابة الفاكهة NMJ اليرقات (تشانغ وآخرون ، 2002 ؛. يان وBroadie ، 2007). كلمة من الحذر ، ولكن : بعض هذه العلامات لا الانقاذ تماما لاغية والمسوخ قد يغير حتى العادي NMJ الفيزيولوجيا.

الجزء 7 : التسجيل من الخلايا العصبية الحركية المركزية

  1. الخلايا العصبية الجنينية يمكن أن يكون العديد من التعرف عليهم بناء على موقف وسوما مورفولوجيا الإسقاط (باتي ومارتينيز أرياس ، 1993 ؛ غودمان والفلاني ، 1993 ؛ Landgraf وآخرون 1997). كذلك ، يمكن للنظام GAL4/UAS (العلامة التجارية وPerrimon ، 1993) الهدف التعبير GFP لتصور السكان عصبون تعريفية (بينز وآخرون ، 1998). وقد ركزت الدراسات حتى الآن على تسجيل مجموعة من خمسة الخلايا العصبية ، وسطحية داخل الحبل الظهري البطني العصبية الجنينية (VNC) ، وأربعة الخلايا العصبية الحركية (ACC وRP1 - 4) واحد عصبون PCC (بينز وآخرون ، 1998 ، 1999 ، 2001. ؛ Rohrbough وBroadie ، 2002 ؛ فيذرستون وآخرون 1995).
  2. الهيئات خلية من الخلايا العصبية التي تم تحديدها للوصول إلى خلية كاملة أقطاب تسجيل التصحيح ، المشبك. يجب أولا غمد neurolemma VNC يمكن إزالة التنسيق مع العلاج قصير مع البروتيني (بينز وباتي ، 1998 ؛ بينز هر بن ، 1999 ؛. Rohrbough وBroadie ، 2002). تتعرض الخلايا العصبية الظهرية الهيئات باستخدام ضخمة قطرها (~ 20 ميكرون) ماصة التصحيح تحتوي على الأنزيم البروتيني 0.5-1 ٪ (النوع الرابع عشر (سيغما) في تسجيل المالحة). ويوجه المواد غمد CNS عن طريق الشفط في تلميح ماصة لمدة 1-2 دقائق حتى تمزقات غمد (فيذرستون وآخرون 1995). ويمكن لتأكيد الهوية الخلوية خلال التسجيلات ، لوسيفر الصفراء (ملح dipotassium ، 1-2 ملغ / مل) يمكن ان تضاف الى حل التصحيح من أجل تصور الموقف ومورفولوجية الخلية.
  3. ويمكن إجراء القياسية خلية كاملة والجهد الجاري التسجيلات المشبك (Rohrbough وBroadie ، 2002 ؛. فيذرستون وآخرون ، 2005). والمالحة تسجيل خارجي يحتوي على (مم) : 140 كلوريد الصوديوم ، 3 بوكل ، 2 CaCl 2 ، 4 MgCl 2 ، 5 HEPES ، 10 السكروز (2) ، هيدروكسيد الصوديوم (7.2 درجة الحموضة). الحل يتضمن التصحيح (مم) : 140 K - خلات ، 2 MgCl 2 ، 0.1 CaCl2 ، 10 HEPES ، 1.1 EGTA ، 2 Na2 - ATP ، ~ 6 KOH (7.2 درجة الحموضة). تبذل الجهد المشبك التسجيلات في امكانات عقد -60 بالسيارات في 18 درجة مئوية. نموذجي إمكانات غير المعدلة ويستريح في مجموعة من -45 إلى -65 بالسيارات (-52.9 ± 7.5 بالسيارات ، يعني ± SD ، ن = 78).
  4. المقايسات المتوفرة تكشف عن الجهد بوابات التيارات الأيونية (بينز وباتي ، 1998) ، وإمكانات العمل المتكررة والنشاط synaptically بوساطة وناهض بوابات الردود (بينز وآخرون ، 2001). يتم تسجيل إدخال متشابك إلى الخلايا العصبية الحركية في شكل سريع على حد سواء AP - بوساطة التيارات السريعة متشابك مثير (المجالس) ، ونوبات دورية ومستمرة (حتى 1 ثانية مدتها) المدخلات مثير تحدث عدة مرات أو أكثر في الدقيقة (بينز وآخرون ، 1999 ؛ بينز وآخرون ، 2001).
  5. سوما خلية الاستجابة للأستيل تطبيق iontophoretically (ACH) والمثبطة GABA الارسال (بينز وباتي ، 1998 ؛. فيذرستون وآخرون 2005). ويمكن تطبيق أدن تشافيز iontophoretically إلى سوما العصبية عبر microelectrode الحادة التي تحتوي على أدن تشافيز في 100mM درهم 2 0 ، في درجة الحموضة 4-5 لصالح الرحلان الشاردي ناهض بواسطة الايجابية الحالية.

ممثل النتائج

العضلات البطنية طولية 6 شرائح A2 - A3 هو الهدف الأكثر شيوعا المستخدمة لتسجيل (Broadie وباتي ، 1993a - D ؛ هاريسون وآخرون 1994 ؛. سويني في مخيم 1995 ؛. Renden وآخرون 2001 ؛. هوانغ وآخرون 2006 ؛ Mohrmann وآخرون 2008). في الجنين ناضجة وفقست حديثا اليرقة طور مرحلي الأولى (20-21 ساعة AEL عند 25 درجة مئوية = الفقس) والعضلات 6 السعة خلية كاملة هو عادة 25-30 PF ، والمقاومة مدخلات MΩ 20-40 ، وتغيير مع تقدم العمر التنموية. أقصى مدى NMJ التيارات متشابك من عشرات picoamps (13-14 ساعة AEL) ل2nA - 1 (20-21 ساعة AEL) ، وزيادة بسرعة بوصفها وظيفة من العمر. التدبير المباشر للغلوتامات بوابات التيارات الغلة القصوى ردود مئات picoamps (13-14 ساعة AEL) إلى 1.5 4NA فقط قبل الفقس. سلسلة أخطاء المقاومة (مجموع سلسلة X الحالي المقاومة) وعادة ما تكون <5 بالسيارات ، ولكن في الأجنة ، قبل الفقس ناضجة ، قد تكون مرتفعة تصل إلى 10 + بالسيارات ، وبالتالي ينصح سلسلة التعويض المقاومة. عضلات الجنينية مع متوسط ​​قطرها 1-30 ميكرون ، ومتوسط ​​مدة 4-80 ميكرون ، تبدو مثالية لإظهار ما يقرب من المعلمات المشبك الفضاء. الثوابت الخلية الوقت المشبك (R سلسلة الخلية XC) المتوسط ​​أقل من 0.25 ميللي ثانية.

في الجنين واليرقة تنضج حديثا فقس ، ظلت الخلايا العصبية الحركية الظهرية السكان تخضع لتسجيل أكثر محدودية. تسجيلات سوما العصبية تكشف كامل السعة خلية في نطاق 1،8-2،5 PF (2.0 PF المتوسط) ، والمقاومة سلسلة من 40-60 MΩ والمقاومة مدخلات ~ 5 GΩ (بينز وباتي ، 1998 ؛ فيذرستون وآخرون 2005). هذه الخلايا تنمو بشكل واضح في حجم وتعقد خلال نضج جنينية ، وهذا النمو لا يزال في جميع أنحاء نمو اليرقات. في instars الثالث كله سعة الخلية 17-20 PF ، المقاومة هي سلسلة 25-37 MΩ المقاومة والمتوسطات مدخلات ~ 900 MΩ (Rohrbough وBroadie ، 2002 ؛ ريتشارد بينز ، اتصال شخصي). المواصلة الأيونية زيادة خلال مراحل تطوره ، ولكن الكثافة الحالية (السلطة الفلسطينية / الجبهة الوطنية) لا تزال مستمرة بشكل ملحوظ. في أجنة ناضجة ، والتيارات متشابك متوسط ​​75 100pA في السعة ، مع كل الأحداث والتيارات ESC السريع لفترات طويلة في المتوسط ​​~ 500 مللي ثانية (بينز وباتي ، 1998 ؛ فيذرستون وآخرون 2005). في الأجنة ، فإن هذه الأحداث المطرد 3-5 المتوسط ​​لكل دقيقة ، وزيادة ل~ 20 لكل دقيقة في طور مرحلي الأول (ريتشارد بينز ، اتصال شخصي). علما بأن التعقيد والخصائص المورفولوجية غشاء الخلايا العصبية ذبابة الفاكهة يجعل من المستحيل عمليا أن الجهد صحيح المشبك الكثير من الخلايا خارج سوما. ولذلك ينبغي للمرء تفسير التسجيلات مع الرعاية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تسجيل الكهربية من أجنة ذبابة الفاكهة تتطلب التلاعب اليدوي والتشريح. الحالة الصحية للإعداد ، ويترتب على ذلك من جودة التسجيلات ، ويعتمد على أن يكون أحدهما قادرا على بسرعة وبدقة يعد الأنسجة الجنينية الهشة للتسجيل ، وثم تنفيذ التجربة. وينبغي أن يتقن المجربون في كل من تشريح الجنينية والتصحيح الكهربية المشبك قبل محاولة معالجة كل دفعة واحدة.

ويمكن أن يتم في واحدة من تسجيلات عدة أنواع من "المعيار المعدل" أو "الدموي مثل" ملاحات (HL). الاختلافات الأساسية بين هاتين الطبقتين المالحة هي 1) تركيز الصوديوم + (120-135 ملم قياسية مقابل HL 70 ملم) و 2) 2 + المغنيسيوم تركيز (4 ملي القياسية مقابل 20 HL ملم). الميزة الرئيسية للتركيز عال + نا في الحل هو معيار لتسهيل العمل الإمكانات الانتشار ، وبالتالي الحفاظ على انتقال عادية ، منقوشة متشابك. وملاحات HL قمع العمل الإمكانات انتقال متشابك توسط. الفرق في ميغاغرام 2 + الذي يمنع قنوات الكالسيوم الجهد مسور ، يغير من سعة نقل متشابك والتحولات كا 2 + - صعودا نطاق التبعية في ملاحات HL (ستيوارت وآخرون 1994). HL ملاحات اظهار ذلك أقل بكثير من سعة نقل متشابك على معطى [كا 2 +]. مراقبة دقيقة ليحل الأسمولية تفجي الخلوية في كل من ملاحات ، والتشكل يظهر بشكل جيد في الحفاظ على قدم المساواة سواء المالحة. منذ لا يتطابق المالحة الدموي الفعلية ، وينبغي أن اختيار المالحة تعكس احتياجات المسألة قيد الدراسة.

هناك مبادئ توجيهية هامة عديدة لتحقيق أقصى قدر من النجاح التسجيلات الجنينية. أولا ، والقدرة على النموذج بنجاح الأختام gigaohm على العضلات مع التقدم في السن يقلل الجنينية التنموية. وهذا هو الأرجح يرجع أساسا إلى تطوير الغشاء القاعدي للعضلات المحيطة النضج. للتصدي لهذا ، مطلوب يعد العلاج كولاجيناز (1-2 دقائق). ومع ذلك ، يجب توخي الحذر لان هذا العلاج سوف تطول الأنزيمية التسوية بسرعة المرفق العضلات لجدار الجسم ، ويمكن أن يؤدي بسهولة إلى فصيلة العضلات. قاعدة واحدة وجدناه فعالة للحد من العلاج الانزيم إلى ٪ 50 ~ من الوقت الذي كشف أسباب الانفصال العضلات. الثاني ، فإنه من الأهمية بمكان أن العصب قد تناسب ضيق في القطب الشفط لتحفيز الكافي ؛ فضفاضة جدا وفشل التحفيز ، ضيقة جدا وليس من الممكن لحفز قسما كافية من العصب. في تجربتنا ، وهذا هو بالتأكيد اكبر واحد لتسجيل القيد NMJ ناجحة. يجب أن يكون قطرها مناسبا لتحديد القطب شفط تجريبيا ، ولكن ينبغي بذل كل جهد ممكن للحفاظ على التحفيز الكهربائي جيدة ، والتي يمكن استخدامها بسهولة لمدة يوم كامل للتسجيل. الثالثة ، لتطبيقات العصبي والمخدرات ناجحة لNMJ ، فمن الأهمية بمكان أن تصبح مألوفة مع التنسيب المشبك. من ذوي الخبرة ، ويمكن بسهولة أن تكون النهايات النمطية التي وجدت مع مدينة دبي للإنترنت البصريات. للمبتدئين ، ويمكن كشف الطرفية العصبية في جنين مع الأصباغ غشاء الميتوكوندريا نفيذ الفلورسنت ، مثل 123 أو رودامين 4 دي - 2 - ASP (Yoshikami واوكون ، 1984 ؛ Broadie وباتي ، 1993a). يتعرض الجنين ببساطة لتشريح الصبغة صبغة (5mm ، و 5 دقائق) وإزالة الزائدة مع يغسل عدة من المياه المالحة. وينظر بعد ذلك مع مرفق إعداد برنامج التحصين الموسع ومضان والفلاتر المناسبة. ويمكن الاستفادة من نهج مماثل يبني GFP المعدلة وراثيا بمناسبة المشبك الجنينية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

معتمد من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح كيلوبايت GM54544.

References

  1. Aravamudan, B., Fergestad, T., Davis, W. S., Rodesch, C. K., Broadie, K. Drosophila UNC-13 is essential for synaptic transmission. Nat. Neurosci. 2, 965-971 (1999).
  2. Auld, V. J., Fetter, R. D., Broadie, K., Goodman, C. S. Gliotactin a novel transmembrane protein on peripheral glia, is required to form the blood-nerve barrier in Drosophila. Cell. 81, 757-767 (1995).
  3. Baines, R. A., Bate, M. Electrophysiological development of central neurons in the Drosophila embryo. J. Neurosci. 18, 4673-4683 (1998).
  4. Baines, R. A., Robinson, S. G., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. Postsynaptic expression of tetanus toxin light chain blocks synaptogenesis in Drosophila. Curr. Biol. 9, 1267-1270 (1999).
  5. Baines, R. A., Uhler, J. P., Thompson, A., Sweeney, S. T., Bate, M. Altered electrical properties in Drosophila neurons developing without synaptic transmission. J. Neurosci. 21, 1523-1531 (2001).
  6. Bate, M. The embryonic development of the larval muscles in Drosophila. Development. 110, 791-804 (1990).
  7. Bate, M., Martinez Arias, A. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. Vol. I, II (1993).
  8. Baumgartner, S., JT, L. ittleton, Broadie, K., MA, B. hat, Harbecke, R., JA, L. engyel, Chiquet-Ehrismann, R., Prokop, A., Bellen, H. J. A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function. Cell. 87, 1059-1068 (1996).
  9. AH, B. rand Perrimon N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  10. Brand, A. GFP as a cell and developmental marker in the Drosophila nervous system. Methods Cell Biol. 58, 165-181 (1999).
  11. Broadie, K. Electrophysiological Approaches to the Neuromusculature. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 273-296 (2000).
  12. Broadie, K., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. J. Neurosci. 13, 144-166 (1993a).
  13. Broadie, K., Bate, M. Development of larval muscle properties in the embryonic myotubes of Drosophila melanogaster. J. Neurosci. 13, 167-180 (1993b).
  14. Broadie, K., Bate, M. Activity-dependent development of the neuromuscular synapse during Drosophila embryogenesis. Neuron. 11, 607-619 (1993c).
  15. Broadie, K., Bate, M. Synaptogenesis in the Drosophila embryo: innervation directs receptor synthesis and localization. Nature. 361, 350-353 (1993d).
  16. Broadie, K., Bellen, H. J., DiAntonio, A., Littleton, J. T., Schwarz, T. L. The absence of Synaptotagmin disrupts excitation-secretion coupling during synaptic transmission. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10727-10731 (1994).
  17. Broadie, K., Prokop, A., Bellen, H. J., O'Kane, C. J., Schulze, K. L., Sweeney, S. T. Syntaxin and Synaptobrevin function downstream of vesicle docking in Drosophila. Neuron. 15, 663-673 (1995).
  18. Broadie, K., Rushton, E., Skoulakis, E. C. M., Davis, R. L. eonardo a 14-3-3 protein involved in learning, regulates presynaptic function. Neuron. 19, 391-402 (1997).
  19. Broadie, K., Skaer, H., Bate, M. Whole-embryo culture of Drosophila: development of embryonic tissues in vitro. Roux's Arch. Develop. Biol. 201, 364-375 (1992).
  20. Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , Springer. Berlin. (1985).
  21. Deitcher, D. L., Ueda, A., Stewart, B. A., Burgess, R. W., Kidokoro, Y., Schwartz, T. L. Distinct requirements for evoked and spontaneous release of neurotransmitter are revealed by mutations in the Drosophila gene neuronal-synaptobrevin. J. Neurosci. 18, 2028-2039 (1998).
  22. Featherstone, D. E., Broadie, K. Surprises from Drosophila: genetic mechanisms of synaptic development and plasticity. Brain Res. Bull. 53, 501-511 (2000).
  23. Featherstone, D. E., Rushton, E. M., Hilderbrand-Chae, M., Phillips, A. M., Jackson, F. R., Broadie, K. Presynaptic glutamic acid decarboxylase is required for induction of the postsynaptic receptor field at a glutamatergic synapse. Neuron. 27, 71-84 (2000).
  24. Featherstone, D. E., Davis, W. S., Dubreuil, R. R., Broadie, K. Drosophila alpha- and beta-spectrin mutations disrupt presynaptic neurotransmitter release. J Neurosci. 21, 4215-4224 (2001).
  25. Featherstone, D. E., Rushton, E., Broadie, K. Developmental regulation of glutamate receptor field size by nonvesicular glutamate release. Nat Neurosci. 5, 141-146 (2002).
  26. Featherstone, D. E., Rushton, E., Rohrbough, J., Liebl, F., Karr, J., Sheng, Q., Rodesch, C. K., Broadie, K. An essential Drosophila glutamate receptor subunit that functions in both central neuropil and neuromuscular junction. J. Neurosci. 25, 3199-3208 (2005).
  27. Fergestad, T., Davis, W. S., Broadie, K. The stoned proteins regulate synaptic vesicle recycling in the presynaptic terminal. J Neurosci. 19, 5847-5860 (1999).
  28. Fergestad, T., Wu, M. N., Schulze, K. L., Lloyd, T. E., Bellen, H. J., Broadie, K. Targeted mutations in the syntaxin H3 domain specifically disrupt SNARE complex function in synaptic transmission. J Neurosci. 21, 9142-9150 (2001).
  29. Fergestad, T., Broadie, K. Interaction of stoned and synaptotagmin in synaptic vesicle endocytosis. J Neurosci. 21, 1218-1227 (2001).
  30. Goodman, C. S., Doe, C. Q. Embryonic Development of the Drosophila Central Nervous System. In The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 1131-1206 (1993).
  31. Harrison, S. D., Broadie, K., Goor, J. vande, Rubin, G. M. Mutations in the Drosophila Rop gene suggest a function in general secretion and synaptic transmission. Neuron. 13, 555-566 (1994).
  32. Huang, F. D., Woodruff, E., Mohrmann, R., Broadie, K. Rolling blackout is required for synaptic vesicle exocytosis. J. Neurosci. 26, 2369-2379 (2006).
  33. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
  34. Jan, L. Y., Jan, Y. N. L-glutamate as an excitatory transmitter at the Drosophila larval neuromuscular junction. J. Physiol. 262, 215-236 (1976b).
  35. Kidokoro, Y., Nishikawa, K. I. Miniature endplate currents at the newly formed neuromuscular junction in Drosophila embryos and larvae. Neuroscience Research. 19, 143-154 (1994).
  36. Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila. J. Neurosci. 17, 9642-9655 (1997).
  37. Mohrmann, R., Matthies, H. J., Woodruff III, E., Broadie, K. Stoned B mediates sorting of integral synaptic vesicle proteins. Neuroscience. 153, 1048-1063 (2008).
  38. Nishikawa, K. I., Kidokoro, Y. Junctional and extrajunctional glutamate receptor channels in Drosophila embryos and larvae. J. Neurosci. 15, 7905-7915 (1995).
  39. Renden, R., Berwin, B., Davis, W., Ann, K., Chin, C. T., Kreber, R., Ganetzky, B., Martin, T. F., Broadie, K. Drosophila CAPS is an essential gene that regulates dense-core vesicle release and synaptic vesicle fusion. Neuron. 31, 421-437 (2001).
  40. Rohrbough, J., Broadie, K. Electrophysiological Analysis of Synaptic Transmission in Central Neurons of Drosophila Larvae. J. Neurophysiol. 88, 847-860 (2002).
  41. Rohrbough, J., Rushton, E., Palanker, L., Woodruff, E., Matthies, H. J., Acharya, U., Acharya, J. K., Broadie, K. Ceramidase regulates synaptic vesicle exocytosis and trafficking. J. Neurosci. 24, 7789-7803 (2004).
  42. Rohrbough, J., Rushton, E., Woodruff, E. 3rd, Fergestad, T., Vigneswaran, K., Broadie, K. Presynaptic establishment of the synaptic cleft extracellular matrix is required for postsynaptic differentiation. Genes Dev. 21, 2607-2628 (2007).
  43. Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J. Comp. Physiol.. A175, 179-191 (1994).
  44. Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O'Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14, 341-351 (1995).
  45. Tsunoda, S., Salkoff, L. Genetic analysis of Drosophila neurons: Shal, Shaw, and Shab encode most embryonic potassium currents. J. Neurosci. 15, 1741-1754 (1995).
  46. Ueda, A., Kidokoro, Y. Longitudinal body wall muscles are electrically coupled across the segmental boundary in the third instar larva of Drosophila melanogaster. Invertebrate Neuroscience. 1, 315-322 (1996).
  47. Wu, C. F., Haugland, F. N. Voltage clamp analysis of membrane currents in larval muscle fibers of Drosophila. J. Neurosci. 5, 2626-2640 (1985).
  48. Yan, Y., Broadie, K. In vivo assay of presynaptic microtubule cytoskeleton dynamics in Drosophila. J Neurosci Methods. 162, 198-205 (2007).
  49. Yoshikami, D., Okun, L. Staining of living presynaptic nerve terminals with selective fluorescent dyes. Nature. 310, 53-56 (1984).
  50. Zagotta, W. N., Brainard, M. S., Aldrich, R. W. Single-channel analysis of four distinct classes of potassium channels in Drosophila muscle. J. Neurosci. 8, 4765-4779 (1988).
  51. Zhang, Y. Q., Rodesch, C. K., Broadie, K. A living synaptic vesicle marker: synaptotagmin-GFP. Genesis. 34, 142-145 (2002).

Tags

علم الأعصاب ، العدد 27 ، ذبابة الفاكهة ، جنين ، خلية كاملة التصحيح ، المشبك والعضلات والخلايا العصبية ، الوصل العصبي العضلي ، مشبك
الكهربية في تسجيل<em> ذبابة الفاكهة</em> الأجنة
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Chen, K., Featherstone, D. E.,… More

Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo. J. Vis. Exp. (27), e1348, doi:10.3791/1348 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter