Elektrofysiologische opname in de Drosophila Embryo

Summary

Elektrofysiologische opnamen van

Abstract

Drosophila is een vooraanstaande genetisch model voor de studie van zowel de embryonale ontwikkeling en functionele neurowetenschappen. Traditioneel worden deze velden geïsoleerd nogal van elkaar, met grotendeels onafhankelijke geschiedenis en wetenschappelijke gemeenschappen. Echter, de interface tussen deze vaak uiteenlopende terreinen is de ontwikkelingsprogramma's ten grondslag liggen aan de verwerving van functionele elektrische signaal-eigenschappen en de differentiatie van de functionele chemische synapsen tijdens de laatste fasen van neurale circuit formatie. Deze interface is een uitermate belangrijk gebied voor onderzoek. In Drosophila, deze fasen van de functionele ontwikkeling optreden tijdens een periode van <8 uur (bij 25 ° C) tijdens het laatste derde deel van de embryogenese. Deze late ontwikkelingsfase werd lang beschouwd als hardnekkige het onderzoek als gevolg van de afzetting van een zware, ondoordringbare epidermale cuticula. Een doorbraak van tevoren was de toepassing van de water-polymeriseren chirurgische lijm die lokaal kan worden toegepast op de cuticula om gecontroleerde dissectie van de laat-stadium embryo's mogelijk te maken. Met een dorsale longitudinale incisie, kan het embryo te plat, waardoor de ventrale zenuw snoer en de lichaamswand spieren aan experimenteel onderzoek. Whole-cell patch-clamp technieken kunnen dan worden gebruikt om op te nemen van individueel herkenbare neuronen en somatische spieren. Deze opname configuraties zijn gebruikt om het uiterlijk en de rijping van de ionische stromen en actiepotentiaal voortplanting in zowel neuronen en spieren te volgen. Genetische mutanten die deze elektrische eigenschappen werden gekenmerkt om de moleculaire samenstelling van ionenkanalen en de bijbehorende signalering complexen onthullen, en om de verkenning van de moleculaire mechanismen van functionele differentiatie te beginnen. Een bijzondere focus is de montage van synaptische verbindingen, zowel in het centrale zenuwstelsel en periferie. De glutamaat neuromusculaire junctie (NMJ) is het meest toegankelijk is voor een combinatie van optische beeldvorming en elektrofysiologische opname. Een glas zuig elektrode wordt gebruikt om de perifere zenuw te stimuleren, met prikkelende knooppunt huidige (EJC) opnames gemaakt in de voltage-opgespannen spieren. Deze opname configuratie is gebruikt om de functionele differentiatie van de synaps grafiek en het uiterlijk en de rijping van presynaptische glutamaat afgifte eigenschappen track. Daarnaast kunnen postsynaptische eigenschappen onafhankelijk van elkaar worden getest via iontoforetische of druk de toepassing van glutamaat rechtstreeks naar de spier oppervlak, het uiterlijk en de rijping van de glutamaat receptor velden te meten. Zo kunnen zowel pre-en postsynaptische elementen afzonderlijk of in combinatie worden gevolgd tijdens de embryonale synaptogenese. Dit systeem is zwaar gebruikt voor het isoleren en karakteriseren van genetische mutanten dat embryonale synapsvorming aantasten, en dus onthullen de moleculaire mechanismen voor de specificatie en differentiatie van synaps verbindingen en functionele synaptische signalering eigenschappen.

Protocol

Deel 1: Uitrusting en Proviand

1. Elektrofysiologische opname van Drosophila embryo's vereist in de eerste vaardigheid in het embryonale dissectie technieken, die worden beschreven in een ander Jupiter video.
2. Elektrofysiologische opname van Drosophila embryo's maakt gebruik van standaard patch-clamp-opname configuraties. Patch clamp opname apparatuur en software die geschikt zijn voor tal van andere preparaten is ook geschikt voor het opnemen van Drosophila embryo's. Omdat Drosophila embryo's worden verlijmd op een dekglas tijdens de dissectie, moet de opname kamer te accepteren dekglaasjes. De dikte van het preparaat en de manier waarop het is gemonteerd op de dekglaasje vereist een rechtopstaande microscoop met een uitstekende DIC optiek en een lange werkafstand lens.
3. Twee soorten bad-oplossingen worden gebruikt voor elektrofysiologische opname; 1) "standaard" (Jan en Jan, 1976a) of "gewijzigde standaard" (Broadie, 2000) Salines, gebaseerd op oplossingen vaak gebruikt voor het opnemen in andere ongewervelden systemen, en 2) "hemolymfe-achtige" (HL) Salines (Stewart et al., 1994), een compromis tussen de standaard zoutoplossing en de ionische concentraties gemeten in de Drosophila hemolymfe. Opgemerkt moet worden dat geen van deze Salines nauwkeurig de ionische concentraties gemeten in de hemolymfe, die ongunstig zijn voor opname (Broadie, 2000) na te bootsen. Standaard zoutoplossing bevat (in mm): 135 NaCl, KCl 5, 4 MgCl _2, 1,8 CaCl2, 72 sucrose, 5 TES, pH 7,2.

Deel 2: Opname Configuratie

1. Voor fysiologische experimenten, is het ontleed embryo voorbereiding geplaatst in een kleine plexiglas opname kamer (<0,5 ml) en bekeken in doorvallend licht met een rechtopstaande samengestelde microscoop uitgerust met een differentieel interferentie contrast (Nomarski)-lens en een lange-werkafstand 40-100X ( typisch 40X) water-immersie objectief (Broadie en Bate, 1993a). De opnamen zijn meestal gemaakt onder de kamertemperatuur (16-22 ° C), met een toenemende moeilijkheidsgraad bij verhoogde temperaturen (22 + ° C). Wij bereiken dit door het koelen van de ruimte in plaats van het koelen van de preapartion.
2. Patch pipetten kunnen worden getrokken uit een verscheidenheid van fiber gevulde glazen (bv borosilicaatglas, 1 mm buitendiameter) en de tips moet worden brand-gepolijst tot de definitieve weerstanden van 5-10 MΩ. Een chloride-zilver aardedraden geplaatst in het bad. Signalen worden versterkt met behulp van een patch-clamp versterker (bijv. Axopatch-1D, Axon Instruments), gefilterd met een 8-polige Bessel-filter op 20-10 Hz, en ofwel bemonsterd on-line of digitaal worden opgeslagen voor latere analyse.
3. Conventionele patch-clamp opnames zijn meestal gemaakt op 18 ° C met een patch pipetten getrokken uit vezelgevulde borosilicaatglas (tips warmte gepolijst tot ~ 1 um id). De huidige records zijn gemaakt van geïdentificeerd multinucleate spiervezels in voltage-clamp (standaard holding potentialen -60 tot -80 mV) (Broadie en Bate, 1993a-d; Broadie et al., 1997;.. Fergestad et al., 1999; Featherstone et al. ., 2000). De patch pipet oplossing bevat (in mm): 120 KCl, 20 KOH, 4 _MgCl2, 0,25 _CaCl2, 5 EGTA, 4 Na _twee ATP, Sucrose 36, en 5 TES, gebufferd op pH 7,2. Registrerende elektroden weer gevuld.

Deel 3: Muscle opnemen

1. In principe kan elke embryonale spieren worden opgenomen van de in dit preparaat. In de praktijk heeft de meeste opnamen geconcentreerd op de grote, ventrale longitudinale spieren in het diepste spierlaag (Bate, 1990; Broadie en Bate, 1993a-c). Records zijn ook gemaakt van de dorsale en laterale spieren van deze spierlaag (Kidokoro en Nishikawa, 1994; Auld et al. 1995;. Nishikawa en Kidokoro, 1995;. Baumgartner et al. 1996). Echter, de meeste experimenten richten zich op de groep van vier longitudinale, ventrale spieren (6,7,12,13), met name spier 6 in de voorste buik (A2-A3).
2. Geen enzymatische behandeling is voorafgaand aan de spier-opname bij jonge embryo's (<16 uur AEL) nodig. Echter, een spier schede ontwikkelt zich in de latere embryo (> 16 uur AEL) en moet worden verwijderd met collagenase (collagenase type IV, 1 mg / ml in tweewaardige kation-vrij zout, 0,5 tot 2 min bij RT), voorafgaand aan de patch opnemen. Na de behandeling enzym, zegel weerstanden op de spieren zijn meestal> 1 GΩ.
3. Patch-clamp opnamen kunnen worden gemaakt van de embryonale spieren met behulp van een aantal standaard technieken (Broadie en Bate 1993a-c; Broadie et al., 1994, 1995, 1997;. Nishikawa en Kidokoro, 1995). Elke standaard patch-clamp variaties - cell-aangesloten, inside-out, outside-out - kan worden gebruikt om single channel activiteiten vast te leggen in de spier of geïsoleerde spier membraan patches. Enkele glutamaat receptor-kanaal-activiteit (~ 12 pA bij -60 mV) zijn over het algemeen waarneembaar op de dalende fase van de spontane prikkelende knooppunt stromen (sEJCs) opgenomen in whole cell-modus.
4. De meeste opname gebeurt in whole-cell opname configUUR, bereikt gemakkelijk uit de cel-ingeschreven staat met een geringe onderdruk of een elektrische "buzz". De spieren kan worden opgenomen van zowel de spanning-clamp (typisch holding mogelijkheden van -60 tot -80 mV) of de huidige-klem configuraties. Spieren bij jongere embryo's (<13 uur AEL) kan niet worden effectief voltage-geklemd als gevolg van een uitgebreide koppeling tussen de embryonale myotubes (Broadie en Bate, 1993a), dit is meestal niet een probleem tijdens later (14 + uur AEL) ontwikkelingsstadia (Ueda en Kidokoro, 1996).
5. Nystatin-geperforeerde patch-clamp opname kan worden gebruikt om records verkregen met standaard whole-cell technieken (Broadie en Bate, 1993a) te controleren. De perforatie oplossing is als volgt: 10 mg pluronic F-127 (Molecular Probes p-1572) wordt opgelost in 20 ml DMSO, en 10 mg Nystatin opgelost in deze oplossing om de voorraad te maken. 100 ul van de voorraad is toegevoegd aan 5 ml gefilterd pipet oplossing om de opname oplossing te maken. Whole-cell stromen worden meestal verkregen <3 minuten na afsluiting vorming. Serieweerstand is sterk toegenomen in de meeste gevallen en cellen kunnen een verhoogde lekstroom ontwikkelen (Broadie en Bate, 1993a).
6. De hele-cel voltage-gated stroom in volwassen embryonale (en larven) spier bestaat uit vijf prominente componenten (Wu en Haugland, 1985; Zagotta et al., 1988; Broadie en Bate, 1993b.): Een naar binnen calcium stroom (I _Ca) en vier naar buiten kalium stromingen (Tsunoda en Salkoff, 1995), waaronder twee snelle, inactiveren van stromingen, voltage-gated (I _A) en calcium-afhankelijke (I _CF), en twee vertraagde, niet-inactiverende stromingen, voltage-gated (I _K) en calcium-afhankelijke (I _CS). Ion-substitutie experimenten kunnen worden gebruikt om deze stromen ontleden van het whole-cell respons tijdens voltage-clamp (Broadie en Bate, 1993b).

Deel 4: neuromusculaire junctie Stimulatie en opname

1. De meest voorkomende en betrouwbare methode voor het NMJ stimulatie maakt gebruik van een glas zuigkracht elektrode op de segmentale perifere zenuw. Afzuiging elektroden kunnen worden getrokken uit een verscheidenheid van fiber gevuld glas elektrode (1-1,5 um uitwendige diameter) en moet worden brand-gepolijst om de gewenste configuratie (~ 5 micrometer binnendiameter) te bereiken. Een klein deel (<50 um) van de juiste segmentale motorische zenuw wordt getrokken in de pipet met zachte zuigkracht om een ​​goede afdichting te vormen.
2. Het is gebruikelijk om de intacte zenuw te stimuleren door gebruik te maken in een lus van de zenuw in de buurt van het centraal zenuwstelsel uitgang. Deze aanpak maakt een eenvoudige stimulatie van de intact voorbereiding, maar heeft als nadeel dat spontane CNS opgewekte activiteit kan optreden bovenop de toegepaste stimulatie paradigma. Een alternatief is het stimuleren van de snede motorische zenuw. Dit kan worden bereikt als de CNS is verwijderd, hoewel deze procedure heeft de neiging te rekken van de zenuwen en kan schade veroorzaken. De zenuw kan ook worden gesneden met een scherp glas micro-elektrode, maar deze procedure is vervelend en moeilijk. Het wordt aanbevolen dat records worden gemaakt van de intacte voorbereiding.
3. Stimulatie kan worden toegepast met een verscheidenheid van paradigma's. Brief stimulatie (0.2 tot 1 msec) werkt het beste en stimulatie-intensiteit (meestal 1 tot 5 V) zal afhangen van de zuig-configuratie en moet proefondervindelijk worden bepaald voor elke cel. Suprathreshold stimulatie van de motorische zenuw wordt het beste bereikt door het instellen van de stimulus kracht iets boven (+1-2 volt) drempel. Evoked NMJ reacties worden geregistreerd vanaf de patch-opgespannen spieren zoals hierboven beschreven. De schok artefact kan aanzienlijk worden verminderd met het gebruik van een geïsoleerde virtuele grond.
4. Een minder betrouwbaar alternatief voor de standaard zuig-elektrode zenuwstimulatie is directe stimulatie van het centrale zenuwstelsel (Nishikawa en Kidokoro, 1995). Een micro-elektrode gevuld met 3-4 M KCl (of KAC) wordt ingevoegd in het midden van de ventrale ganglion en de positieve impulsen van ~ 2 MICROAMP in intensiteit en ~ 2 msec in duur worden geleverd (Dietcher et al.. 1998). De elektrode tip moet in de neuropil het dichtst bij de hemisegment waar stimulatie is gewenst. Synaptische transmissie is opgenomen in de patch-geklemd spier in de standaard configuratie.
5. De embryonale NMJ is toegankelijk voor whole-cell patch-clamp-opname gedurende de differentiatie. Voor prikkelend junctional huidige (EJC) opnamen, zijn signalen opgenomen met een standaard patch-clamp versterker, gefilterd (meestal bij 1-2 KHz), omgezet in een digitaal signaal met behulp van een analoog-naar-digitaal-interface, en verwierf met een computer met behulp van geschikte software.

Deel 5: Neuromuscular Junction Chemical and Drug Applications

1. Elke kleine, geladen molecuul kan effectief worden iontophoresed op de embryonale NMJ (Aravamudan et al., 1999;. Fergestad et al. 1999, 2001). Iontoforetische pipetten kunnen worden getrokken voor specifieke configuraties, met toepassingen voor variabele periodes, met behulp van pulsen van negatieve of positieve stroom. Het is van vitaal belang om te voorkomen dat lekkage tussen puLSES met een geschikte tegenstander back-stroom (Broadie et al., 1993d;. Featherstone et al. 2002, 2005,.. Rohrbough et al. 2007). De omvang van deze back-stroom zal variëren met pipet configuratie en moet experimenteel worden bepaald.
2. Veel experimenten zijn gedaan met de NMJ neurotransmitter, L-glutamaat (Jan en Jan, 1976b), met behulp van een 100mm-stamoplossing (Mononatriumzout, pH 8-9) (Broadie en Bate, 1993c). Hoge weerstand iontoforetische pipetten (100-200 MΩ) zijn gebruikt voor de glutamaat receptor (gluR) mapping (Broadie en Bate, 1993d), en een lagere weerstand pipetten (20-50 MΩ) gebruikt om de totale gluR respons (Broadie et al. schatten. 1995, 1997; Featherstone et al. 2002, 2005;. Rohrbough et al. 2007).. Korte pulsen (0,1-1 ms) van de negatieve stroom (~ 10 nA) werken goed, met een kleine, positieve steun stroom om lekkage te voorkomen.
3. Niet-geladen en geladen moleculen kan worden toegepast door de druk uitwerpen (Fergestad en Broadie, 2001;. Featherstone et al. 2001). Voor de toepassing, is een druk uitwerpen pipet (<5 micrometer inwendige diameter) met de oplossing dicht gepositioneerd (<10 micrometer) van het zenuwuiteinde. De oplossing voor worden uitgeworpen kan worden toegepast met behulp van een picospritzer (5-10 psi) of andere onder druk staande lucht bron (Featherstone et al.., 2002). Tijdens langdurige experimenten, moet de opname kamer (volume <0,5 ml) continu worden geperfundeerd (0,1 - 0,2 ml / sec) met een normaal bad zoutoplossing.
4. Veel experimenten zijn gedaan met hyperosmotische zoutoplossing om fusie van synaptische blaasjes (Broadie et al., 1995.; Aravamudan, et al., 1999;. Fergestad et al., 1999;.. Featherstone, et al., 2000, 2002) activeren. Andere experimenten zijn gedaan met giftige stoffen, zoals argiotoxin 636 tegen glutamaat receptoren en de zwarte weduwe spin gif bevat latroinsectotoxin (Broadie et al.. 1995).

Deel 6: Aanvullende neuromusculaire junctie Vital Imaging Techniques

1. Synaptische blaasje kinetiek kan worden gecontroleerd met fluorescerende lipofiele stryl kleurstoffen (Fergestad en Broadie, 2001;. Rohrbough et al. 2004). De verdeling van de blaasjes kan direct worden waargenomen, en de tarieven van endocytose en exocytose gemeten. Verschillende varianten zijn gemaakt met verschillende fluorescerende eigenschappen (FM1-43, fluoresceïne-achtige, FM4-64, rhodamine-achtig). Wijzigingen van de oorspronkelijke kleurstof hebben opgeleverd producten met veranderde hydrofobe eigenschappen, en dus met verschillende washout kinetiek, bijvoorbeeld, FM2-10 distantieert veel sneller van het membraan.
2. Om het label van de embryonale NMJ met stryl kleurstoffen, kan 10 uM FM1-43 worden geladen voor 1-5 minuten met verhoogde extracellulaire kalium (50-90 mm) (Fergestad en Broadie, 2001). Een meer fysiologische aanpak kan worden bereikt via stimulatie door een zenuw zuigkracht elektrode. De voorbereidingen zijn dan herhaaldelijk gewassen in Ca ^{2 +-vrije} buffer voor 5 minuten, en behield fluorescentie (die geverfd synaptische blaasjes) gemeten. Voor het meten van exocytose, kan men het lossen van de kleurstof met behulp van een verhoogd kalium-of zenuw elektrische stimulatie.
3. Fusie-eiwitten met GFP-varianten zijn geproduceerd waardoor multicolor de etikettering van de embryonale NMJ synaps (Brand, 1999;. Zhang et al. 2002). Veel transgene uitdrukken GFP-gemerkte eiwitten zijn beschikbaar, waaronder algemene membraan markers (bijv. mCD8-GFP), postsynaptische markers (bijv. Shaker-GFP, GluRIIA-GFP), cytoskelet (zoals actine-GFP, Moesin-GFP, tubuline-GFP) en mitochondriale markers (bijv. cytochroom C-GFP) en synaptische vesicles markers (bijv. synaptobrevin-GFP, synaptotagmin-GFP;. Zhang et al., 2002).
4. GFP verslaggevers label compartimenten die zeer dynamisch en kan gebruikt worden om ontwikkelings-functies of mutant fenotypen (Featherstone en Broadie, 2000) te beoordelen. Bleken en vervolgens observeren het herstel van de fluorescentie (FRAP) is aangetoond dat het haalbaar is, ten minste op het larvale Drosophila NMJ (Zhang et al., 2002;. Yan en Broadie, 2007). Een woord van voorzichtigheid, echter: een aantal van deze markers niet helemaal redden null mutanten en kan zelfs veranderen normale NMJ fysiologie.

Deel 7: Opname van het Centraal Motor Neuronen

1. Veel embryonale neuronen kan individueel worden geïdentificeerd op basis van soma positie en projectie morfologie (Bate en Martinez-Arias, 1993; Goodman en Doe, 1993; Landgraf et al. 1997). Verder kan het GAL4/UAS systeem (Brand en Perrimon, 1993) richten GFP expressie aan identificeerbare neuron populaties (Baines et al.., 1998) te visualiseren. Het opnemen van studies tot op heden hebben zich geconcentreerd op een groep van vijf oppervlakkige-, rug-neuronen in de embryonale ventrale zenuw koord (VNC), vier motorneuronen (ACC en RP1-4) en een interneuron PCC (Baines et al., 1998, 1999, 2001. , Rohrbough en Broadie, 2002; Featherstone et al. 1995)..
2. Cellichamen van de geïdentificeerde neuronen zijn toegankelijk voor whole-cell patch-clamp registrerende elektroden. De VNC neurolemma schede moet eerst worden verwijderd met korte focale behandeling met protease (Baines en Bate, 1998; Baines et al, 1999;. Rohrbough en Broadie, 2002). Dorsale neuronale cellichamen zijn blootgesteld met behulp van een grote diameter (~ 20 urn) patch pipet met 0,5-1% protease (type XIV (Sigma) in het opnemen van zoutoplossing). Het CZS schede materiaal wordt getrokken door zuiging in de pipet tip voor 1-2 minuten totdat de mantel scheurt (Featherstone et al.. 1995). Om cellulaire identiteit te bevestigen tijdens de opnames, Lucifer geel (Dikaliumzout, 1-2 mg / ml) kunnen worden toegevoegd aan de patch oplossing om de positie en de morfologie van de cel te visualiseren.
3. Standaard whole-cell spanning-en stroom-klem-opnamen kunnen worden gemaakt (Rohrbough en Broadie, 2002;. Featherstone et al., 2005). De externe opname zoutoplossing bevat (in mm): 140 NaCl, KCl 3, 2 _CaCl2, 4 MgCl _2, 5 HEPES, 10 sucrose, 2 NaOH (pH 7,2). De patch oplossing bevat (in mm): 140 K-acetaat, 2 MgCl _2, 0,1 CaCl2, 10 HEPES, 1,1 EGTA, 2 Na2-ATP, ~ 6 KOH (pH 7,2). Voltage-clamp opnames zijn gemaakt op holdingniveau mogelijkheden van -60 mV bij 18 ° C. Typische niet-aangepaste rusten mogelijkheden zijn in het bereik van -45 tot -65 mV (-52,9 ± 7,5 mV, gemiddelde ± SD, n = 78).
4. Beschikbare assays onthullen voltage-gated ionenstromen (Baines en Bate, 1998), repetitief actiepotentialen, synaptisch gemedieerde activiteit en agonist-gated reacties (Baines et al., 2001).. Synaptische input voor motorneuronen is vastgelegd in de vorm van zowel snel AP-gemedieerde excitatoire synaptische snel stromen (SER), en periodieke, aanhoudende (tot 1 sec duur) episodes van prikkelende inbreng zich meerdere malen of meer per minuut (Baines et al. ., 1999; Baines et al., 2001)..
5. Cel soma te reageren op iontophoretically toegepast acetylcholine (ACh) en de remmende transmitter GABA (Baines en Bate, 1998;. Featherstone et al. 2005). ACh kan iontophoretically worden toegepast op de neuronale soma via een scherpe micro-elektrode met een 100mm ACh in dH ₂ 0, pH 4-5 te agonist iontoforese gunst door positieve stroom.

Representatieve resultaten

Ventrale longitudinale spier 6 is segmenten A2-A3 is de meest gebruikte doelwit voor opname (Broadie en Bate, 1993a-d; Harrison et al., 1994;. Sweeney et al. 1995;. Renden et al. 2001;. Huang et al., 2006.; Mohrmann et al.. 2008). In de volgroeide embryo en nieuw-uitgekomen eerste instar larve (20-21 uur AEL bij 25 ° C = broed), spier-6 whole cell capaciteit is meestal 25 tot 30 pF, en input weerstanden 20-40 MΩ, het veranderen van met ontwikkelingsstoornissen leeftijd. Maximale NMJ synaptische stromen lopen uiteen van tientallen picoamps (13-14 uur AEL) naar 1-2Na (20-21 uur AEL), snel toe als een functie van de leeftijd. Directe meting van glutamaat-gated stromingen opbrengst maximaal reacties van honderden picoamps (13-14 uur AEL) naar 1,5-4NA net voor het uitkomen. Serieweerstand fouten (totale huidige X-serie weerstand) zijn meestal <5 mV, maar in de volwassen, pre-embryo's uitkomen, kan oplopen tot 10 + mV en daarmee serieweerstand vergoeding wordt geadviseerd. Embryonale spieren met een gemiddelde diameter van 10-30 pm en gemiddelde lengte van 40-80 urn, lijken bijna ideale ruimte klem parameters laten zien. Cel klem tijdsconstanten _(R-serie XC _cel) gemiddeld minder dan 0,25 ms.

In de volgroeide embryo en nieuw-uitgekomen larve, heeft de dorsale motor neuron bevolking onderhevig geweest aan meer beperkte opname. Neuronale soma-opnamen onthullen hele cel capaciteit in het bereik van 1,8-2,5 pF (2,0 pF gemiddeld), serie weerstand van 40-60 MΩ en input weerstand van ~ 5 GΩ (Baines en Bate, 1998; Featherstone et al. 2005). Deze cellen duidelijk groeien in omvang en complexiteit tijdens de embryonale ontwikkeling, en deze groei blijft gedurende larvale ontwikkeling. In de derde stadia, whole cell capaciteit is 17 tot 20 pF, serieweerstand is 25 tot 37 MΩ en ingangsweerstand gemiddelden ~ 900 MΩ (Rohrbough en Broadie, 2002; Richard Baines, persoonlijke communicatie). Ionische conductances stijgen gedurende de ontwikkeling, maar de huidige dichtheid (pA / pF) blijft opmerkelijk constant. In volwassen embryo's, synaptische stromen gemiddeld 75-100pA in amplitude, met zowel snelle ESC gebeurtenissen en langdurige stroom van gemiddeld ~ 500 msec (Baines en Bate, 1998; Featherstone et al. 2005). In embryo's, deze aanhoudende gebeurtenissen gemiddeld 3-5 per minuut, oplopend tot ~ 20 per min in het eerste larvestadium (Richard Baines, persoonlijke communicatie). Merk op dat de morfologische complexiteit en de membraan eigenschappen van Drosophila neuronen maakt het vrijwel onmogelijk om goed te voltage klem een groot deel van de cel buiten de soma. Men moet dan ook geïnterpreteerd opnames met zorg.

Discussion

Elektrofysiologische opname van Drosophila embryo's moet handmatig manipulatie en dissectie. De gezondheid van de voorbereiding, en de daaruit voortvloeiende de kwaliteit van de opnames, hangt af van een in staat om snel en netjes voor te bereiden de kwetsbare embryonale weefsels voor het opnemen, en voer vervolgens het experiment. Onderzoekers moet bedreven zijn in zowel de embryonale ontledingen en patch clamp electrofysiologie voordat je probeert om zowel aan te pakken tegelijk.

Opnamen kunnen worden gedaan in een van de vele varianten van de "gewijzigde standaard" of "hemolymfe-achtig" (HL) Salines. De voornaamste verschillen tussen deze twee klassen zijn zoutoplossing 1) Na ⁺ concentratie (120-135 mM standaard vs 70 mM HL) en 2) Mg ^{2 +-concentratie} (4 mM standaard vs 20 mM HL). Het grote voordeel van de hoge Na ⁺ concentratie in de standaard oplossing is het faciliteren van actie-potentieel voortplanting en dus het behoud van een normale, patroon synaptische transmissie. De HL Salines onderdrukken actie-potentieel gemedieerde synaptische transmissie. Het verschil in Mg ^{2 +,} welke blokken voltage-gated calcium kanalen, verandert de amplitude van synaptische transmissie en verschuift de Ca ^{2 +-afhankelijkheid} range naar boven in de HL Salines (Stewart et al.. 1994). HL salines blijkt dus veel lager synaptische transmissie amplitudes op een gegeven [Ca ^{2 +].} Zorgvuldige controle van de osmolariteit elimineert cellulaire vacuolatie in zowel Salines, en morfologie lijkt even goed bewaard gebleven in een zoutoplossing. Aangezien noch zout repliceert de werkelijke hemolymfe, moet de selectie van een zoutoplossing op de behoeften van de vraag onder studie.

Er zijn een aantal belangrijke richtlijnen voor het succes van de embryonale opnames te maximaliseren. Ten eerste, de mogelijkheid om met succes gigaohm zegels formulier op embryonale spieren afneemt met de ontwikkelingsleeftijd. Dit is waarschijnlijk voornamelijk te wijten aan de ontwikkeling van de basale membraan rond de rijping spieren. Om dit tegen te gaan, is langer collagenase behandeling (1-2 min) nodig. Toch moet erop worden gelet, omdat dit verlengde enzymatische behandeling snel zal afbreuk doen aan de spier gehechtheid aan het lichaam muur, en kan gemakkelijk leiden tot spier onthechting. Een regel we hebben gevonden is effectief te beperken het enzym behandeling ~ 50% van de tijd die detecteerbare spier onthechting veroorzaakt. Ten tweede is het cruciaal dat de zenuw een strakke pasvorm in de zuig-elektrode voor een adequate stimulatie heeft, te los en het stimuleren mislukt, te strak en het is niet mogelijk te stimuleren een adequaat deel van de zenuw. In onze ervaring, dit is zeker de grootste beperking voor een succesvolle NMJ opname. De juiste diameter voor de zuig-elektrode moet empirisch worden bepaald, maar alles in het werk moet worden gedaan om een ​​goede stimulatie-elektrode, die gemakkelijk kan worden gebruikt voor een hele dag van de opname te bewaren. Ten derde, voor een succesvolle neurotransmitter en drugs applicaties om de NMJ, is het essentieel om vertrouwd te raken met de synaps plaatsing. Met ervaring, kan de stereotiepe eindes gemakkelijk gevonden worden met DIC optiek. Voor de beginner, kan zenuwuiteinden in het embryo worden onthuld met membraan-permeant fluorescerende mitochondriale kleurstoffen, zoals Rhodamine 123 of 4-Di-2-Asp (Yoshikami en Okun, 1984; Broadie en Bate, 1993a). De ontleed embryo is gewoon blootgesteld aan de kleurstof (5mm, 5 minuten) en de overtollige kleurstof verwijderd met enkele wasbeurten van een zoutoplossing. Het preparaat wordt vervolgens bekeken met een epi-fluorescentie gehechtheid en passende filters. Een soortgelijke aanpak gebruik kunnen maken van transgene GFP constructen markering van de embryonale synaps.