Elektrofysiologiska Inspelning i Drosophila Embryo

Summary

Elektrofysiologiska inspelningar från

Abstract

Drosophila är en förstklassig genetisk modell för studier av såväl embryonal utveckling och funktionell neurovetenskap. Tidigare har dessa fält helt isolerade från varandra, med i stort sett oberoende historia och vetenskapliga samfund. Dock är gränssnittet mellan dessa oftast skilda områden utvecklingsarbetet program som ligger bakom förvärvet av funktionella elektriska signalering egenskaper och differentiering av funktionella kemiska synapser under de sista faserna av neural krets bildas. Detta gränssnitt är ett mycket viktigt område för utredning. I Drosophila, dessa faser av funktionell utveckling sker under en period av <8 timmar (vid 25 ° C) under den sista tredjedelen av fosterutvecklingen. Denna sena utveckling period ansågs länge svårlösta för undersökning på grund av deponering av en tuff och tät yta epidermal nagelband. Ett genombrott förskott var tillämpningen av vatten-polymerisation kirurgiskt lim som kan vara lokalt tillämpas på nagelbanden för att kontrollerad dissekering av sena embryon. Med ett rygg-längsgående snitt, kan embryot läggas platt, utsätta den ventrala nerven sladden och kropp vägg muskulatur till experimentella undersökningar. Hela-cell patch-clamp teknik kan sedan användas för att spela in från individuellt identifierbara nervceller och somatiska muskler. Dessa inspelning konfigurationer har använts för att spåra utseende och mognad av joniska strömmar och aktionspotential utbredning i både nervceller och muskler. Genetiska mutationer som påverkar dessa elektriska egenskaper har präglats för att avslöja den molekylära sammansättningen av jonkanaler och tillhörande signalering komplex, och att börja utforska de molekylära mekanismerna av funktionella differentiering. Särskilt fokus har varit montering av synapsförbindelser, både i det centrala nervsystemet och periferi. Den glutamaterg neuromuskulära förbindelsen (NMJ) är mest tillgänglig för en kombination av optisk avbildning och elektrofysiologiska inspelning. Ett glas sug elektrod används för att stimulera de perifera nerver, med excitatoriska trafikplats ström (EJC) inspelningar i spännings spänns-muskler. Denna inspelning konfiguration har använts för att kartlägga funktionella differentiering av synapsen, och spåra utseende och mognaden av presynaptiska fastigheter glutamat release. Dessutom kan postsynaptiska egenskaper analyseras oberoende via jontoforetiskt eller tryck tillämpning av glutamat direkt till muskeln ytan, för att mäta utseende och mognaden av glutamat receptorn fält. Således kan både pre-och postsynaptiska element övervakas separat eller i kombination under embryonala synaptogenesis. Detta system har varit starkt användas för att isolera och karakterisera genetiska mutanter som försämrar embryonala synaps bildning, och därmed avslöjar de molekylära mekanismer som styr specifikation och differentiering av synaps anslutningar och funktionella synaptisk signalering egenskaper.

Protocol

Del 1: Utrustning och tillbehör

1. Elektrofysiologiska inspelning från Drosophila embryon kräver först kunskaper i embryonala dissektion tekniker, som beskrivs i en annan JUPITER video.
2. Elektrofysiologiska inspelning från Drosophila embryon använder standard patch konfigurationer klämma inspelning. Patch clamp färdskrivare och programvara som lämpar sig för många andra preparat är också lämplig för inspelning från Drosophila embryon. Eftersom Drosophila embryon limmas på ett täckglas under dissektion, bör registrering kammaren acceptera täckglas. Tjockleken på produkten och hur den monteras på täckglas kräver en upprätt mikroskop med utmärkt DIC optik och en lång arbetsdag avstånd lins.
3. Två typer av bad-lösningar används för elektrofysiologiska inspelning; 1) "standard" (Jan och Jan, 1976a) eller "modifierad standard" (Broadie, 2000) Salines, som bygger på lösningar som ofta används för inspelning i andra ryggradslösa system, och 2) "haemolymph-liknande" (HL) Salines (Stewart et al 1994), en kompromiss mellan standard koksaltlösning och den joniska koncentrationer som uppmätts i Drosophila haemolymph. Det bör noteras att ingen av dessa Salines exakt efterlikna joniska koncentrationer som uppmätts i haemolymph, som är ogynnsamma för inspelning (Broadie, 2000). Standard saltlösning innehåller (i mm): 135 NaCl, 5 KCl, 4 MgCl _2, 1,8 CaCl2, 72 sackaros, 5 TES, pH 7,2.

Del 2: Inspelning konfiguration

1. För fysiologiska experiment är dissekeras embryot preparatet placeras i en liten plexiglas inspelning kammare (<0,5 ml) och visas i genomlysning med en upprätt sammansatt mikroskop utrustat med differential interferens kontrast (Nomarski) optik och lång arbetsavstånd 40-100X ( typiskt 40X) vatten nedsänkning mål (Broadie och Bate, 1993a). Inspelningar görs vanligen under rumstemperatur (16-22 ° C), med ökande svårighetsgrad vid förhöjda temperaturer (22 + ° C). Vi uppnår detta genom att kyla rummet snarare än att kyla preapartion.
2. Patch pipetter kan dras från en rad olika fiber fyllda glas (t.ex. borosilikatglas, 1 mm ytterdiameter) och tips bör vara brand-poleras till slutlig motstånd på 5-10 Mohm. En klorid-silver jordkabel placeras i badet. Signaler förstärks med hjälp av en patch-clamp förstärkare (t.ex. Axopatch-1D, Axon Instruments), filtreras med en 8-polig för Bessel-filtret på 2-10 Hz, och antingen provtas på nätet eller lagras digitalt för senare analys.
3. Konventionella patch-clamp inspelningar oftast gjorda vid 18 ° C med patch pipetter dras från fiber fyllda borosilikatglas (tips värme polerat till ~ 1 mm ID). Nuvarande rekord är gjorda av identifierade fibrer multinucleate muskler i spänning-klämma (standard håller potentialer -60 till -80 mV) (Broadie och Bate, 1993a-d, Broadie et al, 1997;.. Fergestad et al, 1999; Featherstone et al ., 2000). Plåstret pipett lösning innehåller (i mm): 120 KCl, 20 KOH, 4 MgCl _2, 0,25 CaCl _2, 5 EGTA, 4 Na ₂ ATP, 36 sackaros och 5 TES, buffrad vid pH 7,2. Inspelning elektroder är tillbaka fyllda.

Del 3: Muscle inspelning

1. I princip kan varje embryonala muskler spelas in från i denna beredning. I praktiken har de flesta inspelning koncentrerat sig på den stora, ventrala längsgående muskler i innersta muskellagret (Bate, 1990; Broadie och Bate, 1993a-c). Records har också gjorts från den dorsala och laterala musklerna i denna muskel skikt (Kidokoro och Nishikawa, 1994, Auld et al 1995;. Nishikawa och Kidokoro, 1995;. Baumgartner vid al 1996). Men de flesta experiment fokuserar på den grupp av fyra längsgående, ventrala musklerna (6,7,12,13), särskilt muskler 6 i främre buken (A2-A3).
2. Ingen enzymatisk behandling krävs före muskler inspelningen i unga embryon (<16 timmar AEL). Emellertid utvecklar en muskel slida i den senare embryot (> 16 timmar AEL) och måste tas bort med kollagenas (kollagenas typ IV, 1 mg / ml i divalent katjon-fri salt, 0,5-2 min på RT) innan patch inspelning. Efter enzym behandling, tätning motstånd på muskeln är normalt> 1 GΩ.
3. Patch-clamp inspelningar kan göras från embryonala muskler med hjälp av ett antal standard tekniker (Broadie och Bate 1993a-c; Broadie et al 1994, 1995, 1997,. Nishikawa och Kidokoro, 1995). Alla vanliga patch-clamp variationer - cell-anslutna, inifrån och ut, utanför-out - kan användas för att spela in en kanal aktivitet i muskel eller isolerade muskel fläckar membran. Enstaka glutamat receptorn kanalen aktivitet (~ 12 Pa vid -60 mV) är i allmänhet observeras på den fallande fas av spontana excitatoriska trafikplats strömmar (sEJCs) som noterats i hela cellen läge.
4. De flesta inspelningen sker i helcells-inspelning configuration uppnådde lätt från cell-ansluten stat med svag sug-eller en elektrisk "buzz". Musklerna kan spelas in från antingen i spänning-klämma (typiska innehavstiden potential på -60 till -80 mV) eller ström-clamp konfigurationer. Musklerna hos yngre embryon (<13 timmar AEL) kan inte vara effektivt spänning-spänns på grund av omfattande koppling mellan de embryonala myotubes (Broadie och Bate, 1993a), detta är oftast inte ett problem under senare (14 + timmar AEL) utvecklingsstadier (Ueda och Kidokoro, 1996).
5. Nystatin-perforerade patch-clamp registrering kan användas för att verifiera register erhålls med normala hela-cell tekniker (Broadie och Bate, 1993a). Perforeringen lösning gjorts enligt följande: 10 mg pluronic F-127 (molekylära sonder p-1572) löses i 20 ml DMSO, och 10 mg Nystatin löst i denna lösning för att göra beståndet. 100 l av beståndet tillsätts 5 ml filtrerad pipett lösning för att göra inspelningen lösningen. Helcells-strömmar erhålls vanligen <3 minuter efter tätning bildas. Serien motståndet är markant i de flesta fall och celler kan utvecklas en ökad läckström (Broadie och Bate, 1993a).
6. Hela-cells spänningskänsliga ström i mogna embryonala (och larver) är muskel består av fem framträdande komponenter (Wu och Haugland, 1985; Zagotta et al 1988, Broadie och Bate, 1993b.): Ett inåt kalcium ström (I _Ca) och fyra yttre kalium strömmar (Tsunoda och Salkoff, 1995), inklusive två snabba, inaktivera strömmar spänningskänsliga (I _A) och kalcium-beroende (I _CF), och två försenade, icke-inaktivera strömmar spänningskänsliga (jag _K) och kalcium-beroende (jag _CS). Ion-substitution experiment kan användas för att dissekera dessa strömmar från hela-cells svar under spännings-clamp (Broadie och Bate, 1993b).

Del 4: neuromuskulära förbindelsen Stimulans och inspelning

1. Den vanligaste och tillförlitlig metod för NMJ stimulering använder en elektrod glas sug på segmentell perifer nerv. Sug elektroder kan dras från en rad olika fiber fyllda elektrod glas (1-1,5 ìm ytterdiameter) och bör brand-poleras för att uppnå önskad konfiguration (~ 5 ìm innerdiameter). En liten del (<50 mikrometer) av lämpliga segmentell motoriska nerv sugs in i pipetten med mjuka sug för att bilda en tät försegling.
2. Det är vanligt att stimulera intakt nerv genom att dra i en slinga av nerv nära CNS utförselstället. Detta tillvägagångssätt gör det lätt stimulering av intakt förberedelser, men har nackdelen att spontana CNS-framkallat aktivitet kan förekomma ovanpå tillämpas stimulans paradigm. Ett alternativ är att stimulera nerven skär motorn. Detta kan uppnås om CNS tas bort, även om detta förfarande tenderar att sträcka nerv och kan orsaka skador. Nerven kan också skäras med en vass glas mikroelektrod, men detta förfarande är jobbigt och svårt. Det rekommenderas att register göras från intakta förberedelser.
3. Stimulering kan appliceras med en mängd olika paradigm. Kort stimulering (0,2-1 msek) som fungerar bäst och stimulering intensitet (vanligtvis 1-5 V) kommer att bero på sug-konfiguration och skall experimentellt bestämmas för varje cell. Suprathreshold stimulering av motoriska nervceller uppnås bäst genom att ställa den stimulans styrkan något över (1-2 volt) tröskel. Evoked NMJ svar registreras från patch-spänns musklerna som beskrivits ovan. Chocken artefakt kan avsevärt minskas med hjälp av en isolerad virtuell mark.
4. En mindre pålitliga alternativ till standard sug elektroden nervstimulering är direkt stimulering av centrala nervsystemet (Nishikawa och Kidokoro, 1995). En mikroelektrod fylld med 3-4 M KCl (eller KAC) sätts in i mitten av den ventrala ganglion och positiva pulser av ~ 2 MicroAmp i intensitet och ~ 2 ms varaktighet levereras (Dietcher et al. 1998). Elektroden spetsen ska vara i neuropil närmast hemisegment där stimulering önskas. Synaptic transmission redovisas i patch-fastklämd muskel i standardkonfigurationen.
5. Den embryonala NMJ är tillgänglig för hel-cell patch-clamp inspelning hela sin differentiering. För excitatoriska Junktional ström (EJC) inspelningar, är signaler som spelats in med en standard patch-clamp förstärkare, filtreras (vanligtvis vid 1-2 kHz), omvandlas till en digital signal med en analog-till-digital-gränssnitt, och förvärvade med en dator via lämplig programvara.

Del 5: neuromuskulära förbindelsen Kemisk och Drug Applications

1. Alla små, laddade molekyler effektivt kan iontophoresed på embryonala NMJ (Aravamudan et al, 1999;. Fergestad et al 1999, 2001). Jontoforetiskt pipetter kan dras för specifika konfigurationer, med applikationer för rörlig perioder, med hjälp av pulser av negativ eller positiv ström. Det är viktigt att förhindra läckage mellan puLSES med en lämplig motsatta stöd ström (Broadie et al 1993d;. Featherstone et al 2002, 2005,.. Rohrbough et al 2007). Omfattningen av detta stöd nuvarande varierar med pipett konfigurationen och den bör bestämmas experimentellt.
2. Många försök har gjorts med NMJ signalsubstans, L-glutamat (Jan och Jan, 1976b), med hjälp av en 100mm stamlösning (Mononatriumsalt, pH 8-9) (Broadie och Bate, 1993c). Hög motståndskraft jontoforetiskt pipetter (100-200 Mohm) har använts för glutamat receptor (gluR) kartläggning (Broadie och Bate, 1993d) och lägre motstånd pipetter (20-50 Mohm) används för att uppskatta den totala gluR svar (Broadie et al. 1995, 1997, Featherstone et al 2002, 2005;. Rohrbough et al 2007).. Korta pulser (0.1-1 ms) negativ ström (~ 10 NA) fungerar bra, med en liten, positiv uppbackning aktuella för att förhindra läckage.
3. Icke-laddade och laddade molekyler kan appliceras med tryck utmatning (Fergestad och Broadie, 2001;. Featherstone et al 2001). För ansökan, är ett tryck utmatning pipett (<5 ìm inre diameter) som innehåller lösningen placeras nära (<10 mikrometer) från nerven terminalen. Lösningen ska matas ut kan appliceras med en picospritzer (5-10 psi) eller andra tryckluft källa (Featherstone et al., 2002). Under långvarig experiment, bör registrering kammare (volym <0,5 ml) ska perfusion kontinuerligt (0,1 - 0,2 ml / sek) med normal bad saltlösning.
4. Många försök har gjorts med hyperosmotic koksaltlösning för att utlösa fusion av synaptiska vesiklar (Broadie et al 1995;. Aravamudan, et al, 1999;. Fergestad et al, 1999;.. Featherstone, et al, 2000, 2002). Andra försök har gjorts med gifter, såsom argiotoxin 636 mot glutamat-receptorer och svarta änka gift med latroinsectotoxin (Broadie et al. 1995).

Del 6: Kompletterande neuromuskulära förbindelsen Vital avbildningstekniker

1. Synaptic vesikler kinetik kan övervakas med fluorescerande lipofila stryl färgämnen (Fergestad och Broadie, 2001;. Rohrbough et al 2004). Fördelningen av blåsor kan observeras direkt, och skattesatserna för endocytos och exocytos mätas. Flera varianter har gjorts med olika fluorescerande egenskaper (FM1-43, fluorescein-liknande, FM4-64, Rhodamine-liknande). Ändringar av den ursprungliga färgen har gett produkter med förändrad hydrofoba egenskaper, och därmed med olika washout kinetik, t.ex., FM2-10 dissocierar mycket snabbare från membranet.
2. Att märka den embryonala NMJ med stryl färgämnen, kan 10 mikroM FM1-43 skall lastas för 1-5 minuter med förhöjda extracellulära kalium (50-90 mm) (Fergestad och Broadie, 2001). En mer fysiologisk metod kan uppnås genom stimulering av en nerv sug elektrod. Förberedelserna är sedan tvättas flera gånger i Ca ^{2 +-buffert} i 5 minuter, och behöll fluorescens (motsvarar färgade synaptiska vesiklar) mäts. För att mäta exocytos, kan man lossa färgen med hjälp av antingen förhöjda kalium-eller nerv elektrisk stimulering.
3. Fusion proteiner med GFP varianter har producerats så multicolor märkning av embryonala NMJ synapsen (Brand, 1999;. Zhang et al 2002). Många transgena uttrycka GFP-märkta proteiner finns bland annat allmänna membran markörer (t.ex. mCD8-GFP), postsynaptiska markörer (t.ex. Shaker-GFP, GluRIIA-GFP), cytoskelettala (t.ex. aktin-GFP, moesin-GFP, tubulin-GFP) och mitokondriella markörer (t.ex. cytokrom C-GFP) och synaptic markörer vesikler (t.ex. synaptobrevin-GFP, synaptotagmin-GFP;. Zhang et al, 2002).
4. GFP reportrar etikett fack som är mycket dynamisk och kan användas för att bedöma utvecklings-funktioner eller mutant fenotyper (Featherstone och Broadie, 2000). Blekning och sedan observera återhämtning av fluorescens (FRAP) har visat sig vara möjligt, åtminstone på larver Drosophila NMJ (Zhang et al, 2002;. Yan och Broadie, 2007). Ett varningens ord dock: Vissa av dessa markörer inte helt rädda null mutanter och kan även förändra normala NMJ fysiologi.

Del 7: Inspelning från Central motoriska nervceller

1. Många embryonala nervceller kan identifieras på grundval av soma position och projektion morfologi (Bate och Martinez-Arias, 1993, Goodman och Doe, 1993; Landgraf et al 1997). Dessutom kan GAL4/UAS systemet (Brand och Perrimon, 1993) Målet GFP uttryck för att visualisera identifierbar neuron populationer (Baines et al., 1998). Inspelning studier som hittills har koncentrerat sig på en grupp av fem ytliga, bröst nervceller i embryonala ventrala nerv sladd (VNC), fyra motoriska nervceller (ACC och RP1-4) och ett interneuron PCC (Baines et al, 1998, 1999, 2001. , Rohrbough och Broadie, 2002, Featherstone et al 1995)..
2. Cell organ identifierade nervceller är tillgängliga för hel-cell patch-clamp inspelning elektroder. VNC neurolemma slida måste först tas bort med kort fokal behandling med proteashämmare (Baines och Bate, 1998; Baines et al, 1999;. Rohrbough och Broadie, 2002). Dorsal neuronal cell kroppar exponeras med en stor diameter (~ 20 mikrometer) patch pipett innehåller 0,5-1% proteas (typ XIV (Sigma) i inspelningen koksaltlösning). CNS mantelmaterial dras sugs in i pipettspetsen i 1-2 minuter tills skidan spricker (Featherstone et al. 1995). För att bekräfta cellulär identitet under inspelningarna, Lucifer gul (dikaliumsalt, 1-2 mg / ml) kan läggas till plåstret lösning för att visualisera läge och morfologi av cellen.
3. Standard helcells-spännings-och ström-clamp inspelningar kan göras (Rohrbough och Broadie, 2002;. Featherstone et al, 2005). Den externa inspelning saltlösning innehåller (i mm): 140 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl _2, 4 MgCl _2, 5 HEPES, 10 sackaros, 2 NaOH (pH 7,2). Plåstret lösning innehåller (i mm): 140 K-Acetat, 2 MgCl _2, 0,1 CaCl2, 10 HEPES, 1,1 EGTA, 2 Na2-ATP, ~ 6 KOH (pH 7,2). Spänning-clamp Inspelningarna är gjorda på att hålla potential på -60 mV vid 18 ° C. Typiska ojusterade vila potentialer i intervallet -45 till -65 mV (-52,9 ± 7,5 mV, medelvärde ± SD, n = 78).
4. Tillgängliga analyser avslöjar spänningskänsliga jonströmmar (Baines och Bate, 1998), repetitiva potentialer åtgärder, synaptically-medierad aktivitet och agonist-medierade reaktioner (Baines et al., 2001). Synaptic bidrag till motoriska nervceller registreras i form av både snabb AP-medierad snabbt excitatoriska postsynaptiska strömmar (ESC), och återkommande, ihållande (upp till 1 sek varaktighet) episoder av excitatoriska indata förekommer flera gånger eller mer per minut (Baines et al ., 1999; Baines et al, 2001)..
5. Cell Soma svara på iontophoretically tillämpas acetylkolin (ACh) och den inhibitoriska neurotransmittorn GABA (Baines och Bate, 1998;. Featherstone et al 2005). ACh kan tillämpas iontophoretically till neuronala soma via en vass mikroelektrod innehåller 100mm ACh i dH ₂ 0, vid pH 4-5 gynna agonist jontofores av positiva ström.

Representativa resultat

Ventrala längsgående muskel 6 är segment A2-A3 är den mest utnyttjade mål för inspelning (Broadie och Bate, 1993a-d, Harrison et al 1994;. Sweeney vid al 1995;. Renden et al 2001;. Huang et al 2006. Mohrmann et al. 2008). I den mogna embryo och nykläckta first INSTAR larv (20-21 timmar AEL vid 25 ° C = kläckning), är muskel 6 helcells kapacitans typiskt 25-30 pF, och input motstånd 20-40 Mohm, byta med utvecklingsstörning ålder. Maximal NMJ synaptiska strömmar variera från ett tiotal picoamps (13-14 timmar AEL) till 1-2nA (20-21 timmar AEL), ökar snabbt som en funktion av ålder. Direkt mått på glutamat-medierade strömmar ge maximal respons av hundratals picoamps (13-14 timmar AEL) till 1,5-4NA strax före kläckning. Serieresistiv fel (totalt nuvarande X-serien motstånd) är vanligtvis <5 mV, men i mogna, före kläckningen embryon, kan vara så hög som 10 + mV och därmed serieresistiv ersättning rekommenderas. Embryonala muskler med en genomsnittlig diameter av 10-30 ìm och genomsnittlig längd på 40-80 ìm, tycks visa nästan idealiska parametrar utrymme klämma. Cell klämma tidskonstanter _(R-serien XC _cell) genomsnitt mindre än 0,25 msek.

I den mogna embryo och nykläckta larven har dorsala motoriska neuron befolkningen varit föremål för mer begränsad inspelning. Neuronal soma inspelningar avslöjar helcells kapacitans i intervallet 1,8-2,5 pF (2,0 pF genomsnitt), serie motstånd 40-60 Mohm och input motstånd ~ 5 GΩ (Baines och Bate, 1998; Featherstone et al 2005). Dessa celler växer klart i storlek och komplexitet under embryonala mognad och tillväxten fortsätter hela larver utveckling. På tredje instars är helcells kapacitans 17-20 pF, serie motstånd är 25-37 Mohm och Ingångsresistans genomsnitt ~ 900 Mohm (Rohrbough och Broadie, 2002, Richard Baines, personlig kommunikation). Ionic conductances öka i hela utvecklingen, men strömtäthet (PA / pF) är anmärkningsvärt konstant. I mogna embryon, synaptiska strömmar genomsnittlig 75-100 Pa i amplitud, med både snabba ESC händelser och långvarig strömmar genomsnitt ~ 500 msek (Baines och Bate, 1998; Featherstone et al 2005). I embryon, dessa ihållande händelser genomsnitt 3-5 per min, öka till ~ 20 per minut i den första INSTAR (Richard Baines, personlig kommunikation). Observera att morfologiska komplexitet och egenskaper membran av Drosophila nervceller gör det praktiskt taget omöjligt att korrekt spänning klämma mycket av cellen bortom soma. Man bör därför tolka inspelningar med omsorg.

Discussion

Elektrofysiologiska inspelning från Drosophila embryon kräver manuell manipulation och dissektion. Hälsa förberedelser, och därmed kvaliteten på inspelningarna, beror på en att snabbt kunna och prydligt förbereda den ömtåliga embryonala vävnader för inspelning, och sedan köra experimentet. Praktiker bör ha goda kunskaper i både embryonala dissektioner och patch clamp elektrofysiologi innan du försöker att ta itu med båda samtidigt.

Inspelningar kan göras på en av flera varianter av "modifierad standard" eller "haemolymph-liknande" (HL) Salines. Den främsta skillnaden mellan dessa två saltlösning klasser 1) Na ⁺ koncentration (120-135 mm standard vs 70 mm HL) och 2) Mg ^{2 +} koncentration (4 mm standard jämfört med 20 mM HL). Den stora fördelen med den höga Na ⁺ koncentration i standardlösningen är att underlätta åtgärder potential spridning och därmed bibehållande av normal mönstrade, synaptisk transmission. HL Salines undertrycka action-potential medierad synaptisk överföring. Skillnaden i Mg ^{2 +,} som blockerar spänningskänsliga kalciumkanaler, förändrar amplituden synaptisk transmission och förskjuter ^{Ca2 +-beroende} räckvidd uppåt i HL Salines (Stewart et al. 1994). HL Salines visar därför mycket lägre synaptisk transmission amplituder vid en given [Ca ^{2 +].} Noggrann kontroll av osmolaritet eliminerar cellulär vakuolisering i både Salines, och morfologi verkar lika väl bevarad i antingen koksaltlösning. Eftersom varken saltlösning replikat faktiska haemolymph, bör valet av en saltlösning återspegla behoven av frågan under utredning.

Det finns flera viktiga riktlinjer för att maximera framgången för embryonala inspelningar. Först minskar förmågan att framgångsrikt bilda gigaohm sälar på embryonala muskeln med utvecklingsstörning ålder. Detta beror sannolikt främst på utvecklingen av basalmembranet omger mogna muskler. För att motverka detta är längre kollagenas behandling (1-2 min) krävs. Måste dock vara försiktig eftersom detta förlängas enzymatisk behandling kommer snabbt äventyra muskeln infästning i kroppen väggen, och kan lätt leda till muskel lossnar. En regel vi har funnit effektiva är att begränsa det enzym behandling till ~ 50% av tiden som orsakar upptäckas muskler lossnar. För det andra är det avgörande att nerven har en tight passform i sug-elektrod för tillräcklig stimulans, för löst och stimulans misslyckas, för hårt och det är inte möjligt att stimulera en tillräcklig del av nerven. Enligt vår erfarenhet är detta definitivt den största enskilda begränsningen för framgångsrika NMJ inspelning. Lämplig diameter för sug elektroden måste vara empiriskt bestämt, men alla ansträngningar bör göras för att bevara en god stimulans elektrod, som lätt kan användas för en hel dag av inspelning. Tredje, för framgångsrik neurotransmittor och drog ansökningar till NMJ är det viktigt att bli bekant med synaps placering. Med erfarenhet kan stereotypa ändelser lätt hittas med DIC optik. För nybörjare kan nerv terminaler i embryot att avslöjas med membran-permeant fluorescerande mitokondriella färger, såsom Rhodamine 123 eller 4-Di-2-Asp (Yoshikami och Okun, 1984; Broadie och Bate, 1993a). Den dissekerade embryot är helt enkelt utsatt för färgen (5mm, 5 min) och överflödig färg bort med flera tvättar av saltvatten. Preparatet är sedan visas med en epi-fluorescens fäste och lämpliga filter. Liknande metoder kan använda transgena GFP konstruerar markera embryonala synaps.