Gravação eletrofisiológicas na Drosophila Embrião

Summary

Gravações eletrofisiológicas da

Abstract

Drosophila é um modelo premier genética para o estudo de ambos o desenvolvimento embrionário e neurociência funcional. Tradicionalmente, esses campos são muito afastadas umas das outras, com histórias em grande parte independentes e comunidades científicas. No entanto, a interface entre esses campos normalmente díspares são os programas de desenvolvimento subjacente aquisição de propriedades funcionais elétricos de sinalização e diferenciação das sinapses químicas funcionais durante as fases finais da formação de circuitos neurais. Esta interface é uma área extremamente importante para a investigação. Em Drosophila, estas fases de desenvolvimento funcional ocorrem durante um período de <8 horas (a 25 ° C) durante o último terço da embriogênese. Este período final de desenvolvimento foi considerado por muito tempo intratáveis ​​devido a investigação para a deposição de um resistente, impermeável cutícula epidérmica. Um avanço de avanço foi a aplicação de cola de água polimerização cirúrgica que pode ser aplicado localmente para a cutícula para que a dissecção controlada de embriões em estágio avançado. Com uma incisão dorsal longitudinal, o embrião pode ser deitadas, expondo o cordão nervoso ventral e musculatura da parede do corpo à investigação experimental. Whole-cell patch-clamp técnicas podem então ser empregadas para gravar a partir de neurônios individualmente identificáveis ​​e músculos somáticos. Estas configurações de gravação ter sido usado para rastrear o surgimento e amadurecimento de correntes iónicas e propagação do potencial de ação em ambos os neurônios e músculos. Mutantes genéticos que afetam estas propriedades elétricas foram caracterizados para revelar a composição molecular de canais iônicos e associados complexos de sinalização, e para começar a exploração dos mecanismos moleculares de diferenciação funcional. Uma atenção especial tem sido a montagem de conexões sinápticas, tanto no sistema nervoso central e periferia. O glutamatérgica junção neuromuscular (MNJ) é mais acessível a uma combinação de imagens ópticas e de gravação eletrofisiológico. Um eletrodo de sucção de vidro é usado para estimular o nervo periférico, junção com excitatórios atual (EJC) gravações feitas na tensão muscular preso. Esta configuração de gravação tem sido usado para traçar a diferenciação funcional da sinapse, e acompanhar o surgimento e amadurecimento de propriedades de liberação pré-sináptica de glutamato. Além disso, as propriedades de pós-sinápticos podem ser analisadas de forma independente por meio de iontoforese ou aplicação de pressão de glutamato diretamente na superfície do músculo, para medir o aparecimento e maturação dos campos receptores de glutamato. Assim, ambos os elementos pré e pós-sinápticos podem ser monitorados separadamente ou em combinação durante a sinaptogênese embrionárias. Este sistema tem sido fortemente usada para isolar e caracterizar mutantes genéticos que impedem a formação da sinapse embrionárias e, assim, revelar os mecanismos moleculares que regem a especificação e diferenciação das conexões sinápticas funcionais sinapse e propriedades de sinalização.

Protocol

Parte 1: Equipamentos e Suprimentos

1. Eletrofisiológicas gravação a partir de embriões Drosophila primeiro exige proficiência em técnicas de dissecção embrionárias, que são descritos em um outro vídeo Jove.
2. Eletrofisiológicas gravação a partir de embriões Drosophila utiliza padrão de patch configurações de gravação grampo. Patch clamp equipamento de gravação e software apropriado para muitas outras preparações também é adequado para a gravação a partir de embriões de Drosophila. Porque os embriões Drosophila são colados a uma lamínula durante a dissecção, a câmara de gravação deve aceitar lamínulas. A espessura da preparação e da maneira em que é montado na lamela requer uma microscópio vertical com excelente ótica DIC e uma lente de longa distância de trabalho.
3. Dois tipos de soluções de banho são usados ​​para a gravação eletrofisiológico; 1) "standard" (Jan e Jan, 1976a) ou "modificado padrão" (Broadie, 2000) salinas, com base em soluções comumente utilizadas para a gravação em sistemas de invertebrados outros, e 2) "hemolinfa-like" (HL) salinas (Stewart et al 1994), um compromisso entre a solução salina padrão e as concentrações iónicas medidas na hemolinfa Drosophila. Note-se que nenhuma dessas salinas precisa imitar a concentração iônica medida na hemolinfa, que são desfavoráveis ​​para a gravação (Broadie, 2000). Padrão de solução salina contém (em mM): 135 NaCl, KCl 5, 4 MgCl _2, 1,8 CaCl2, 72 de sacarose, 5 TES, pH 7.2.

Parte 2: Configuração de gravação

1. Para experimentos fisiológicos, a preparação embrião dissecados é colocado em uma pequena câmara plexiglass gravação (<0,5 ml) e visualizados em luz transmitida com um microscópio composto vertical equipado com contraste de interferência diferencial (Nomarski) ótica e uma longa distância de trabalho de 40 100X ( tipicamente 40X) O objectivo imersão em água (Broadie e Bate, 1993a). As gravações são feitas tipicamente abaixo da temperatura ambiente (16-22 ° C), com dificuldade crescente em temperaturas elevadas (22 ° C +). Nós conseguimos isso refrigeração da sala ao invés de arrefecer o preapartion.
2. Pipetas patch pode ser puxado de uma variedade de fibra de copos cheios (ex.: vidro borossilicato, 1 mm de diâmetro externo) e as pontas de fogo deve ser polido para resistências final de 50-10 mohms. Um fio terra cloreto de prata é colocado no banho. Sinais são amplificados usando um amplificador de patch-clamp (por exemplo, Axopatch 1D-Instruments, Axon), filtrado com um 8 pólos do filtro de Bessel em 10/02 Hz, e qualquer amostra on-line ou armazenadas digitalmente para posterior análise.
3. Convencionais de patch-clamp gravações são feitas na maioria das vezes a 18 ° C com pipetas de patch retirado de fibra cheio vidro de borosilicato (dicas de calor polido para id ~ M 1). Registros atuais são feitos de fibras musculares multinucleadas identificados na tensão de clamp (padrão segurando potenciais -60 a -80 mV) (Broadie e Bate, 1993a-d; Broadie et al, 1997;.. Fergestad et al, 1999; Featherstone et al ., 2000). A solução da pipeta patch contém (em mM): 120 KCl, 20 KOH, 4 MgCl _2, 0,25 CaCl _2, 5 EGTA, 4 Na ₂ ATP, 36 a saca, e 5 TES, tamponada a pH 7.2. Eletrodos de registro estão de volta-cheia.

Parte 3: Gravação Muscle

1. Em princípio, qualquer músculo embrionárias pode ser gravado a partir desta preparação. Na prática, a maioria tem se concentrado na gravação do grande, músculos longitudinal ventral na camada muscular mais interna (Bate, 1990; Broadie e Bate, 1993a-c). Registros também foram feitas a partir da musculatura dorsal e lateral da camada muscular (Kidokoro ea Nishikawa, 1994; Auld et al 1995;. Nishikawa e Kidokoro, 1995;. Baumgartner et al 1996). No entanto, a maioria dos experimentos foco no grupo de quatro longitudinal, músculos ventral (6,7,12,13), particularmente do músculo seis no abdome anterior (A2-A3).
2. Sem tratamento enzimático é necessária antes da gravação do músculo em embriões jovens (<16 hrs AEL). No entanto, uma bainha muscular desenvolve no embrião depois (> 16 hrs AEL) e deve ser removido com colagenase (colagenase tipo IV, 1 mg / ml em solução salina livre de cátions divalentes, 0,5-2 min à temperatura ambiente) antes de gravar patch. Após o tratamento enzimático, resistências selo no músculo são tipicamente> 1 GÊ.
3. Patch-clamp gravações podem ser feitas a partir dos músculos embrionárias usando uma série de técnicas padrão (Broadie e Bate 1993a-c; Broadie et al 1994, 1995, 1997;. Nishikawa e Kidokoro, 1995). Qualquer padrão de patch-clamp variações - célula inscritos, de dentro para fora, fora-out - pode ser empregada para registrar a atividade de um canal no músculo ou manchas isoladas de membrana muscular. Glutamato única atividade do canal receptor (~ 12 pA a -60 mV) são geralmente observáveis ​​na fase de queda espontânea correntes junção excitatórios (sEJCs) gravado no modo de células inteiras.
4. Mais a gravação é feita em toda célula de configuração de gravaçãouration, facilmente alcançada a partir do estado de células-unido com uma ligeira sucção elétrica ou um "buzz". Os músculos podem ser gravados a partir de qualquer tensão na braçadeira (típico potenciais realização de -60 a -80 mV) ou pinça de corrente configurações. Músculos em embriões mais jovens (<13 hrs AEL) não pode ser efetivamente tensão preso devido ao acoplamento extensa entre os miotubos embrionárias (Broadie e Bate, 1993a), o que não é geralmente um problema durante a tarde (14 + hrs AEL) estágios de desenvolvimento (Ueda e Kidokoro, 1996).
5. Nistatina perfurado gravação de patch-clamp pode ser usada para verificar registros obtidos com o padrão de célula inteira técnicas (Broadie e Bate, 1993a). A solução perfuração é feita da seguinte forma: 10 PLURONIC mg F-127 (Molecular Probes p-1572) é dissolvido em 20 ml DMSO e 10 mg Nistatina dissolvido nesta solução para fazer o estoque. 100 ul do estoque é adicionado à solução de 5 ml Pipeta filtrada para fazer a solução de gravação. De célula inteira correntes são normalmente obtidos <3 minutos após a formação do selo. Resistência em série é marcadamente aumentado na maioria dos casos e as células podem desenvolver um aumento da corrente de fuga (Broadie e Bate, 1993a).
6. O todo-célula atual voltagem dependentes na embrionárias madura (e larval) músculo é composto por cinco componentes proeminentes (Wu e Haugland, 1985; Zagotta et al 1988; Broadie e Bate, 1993b.): Um de cálcio para dentro corrente (I _Ca) e quatro fora correntes de potássio (Tsunoda e Salkoff, 1995), incluindo duas rápido, as correntes de inativação, voltagem-dependentes (I _A) e cálcio-dependente (I _CF), e dois atrasados, não inativar correntes, voltagem-dependentes (I _K) e cálcio-dependente (I _CS). Ion substituição de experimentos pode ser usado para dissecar essas correntes a partir da resposta de célula inteira durante a braçadeira de tensão (Broadie e Bate, 1993b).

Parte 4: Estimulação da junção neuromuscular e Gravação

1. O método mais comum e confiável de estimulação MNJ usa um eletrodo de sucção de vidro sobre o nervo segmentar periféricos. Eletrodos de sucção pode ser puxado de uma variedade de fibra de vidro cheio de eletrodo (1-1,5 mM diâmetro externo) e deve ser polido-fogo para conseguir a configuração desejada (~ 5 mM de diâmetro interno). Um pequeno segmento (<50 mm) do nervo motor apropriado segmentar é arrastado para a pipeta com uma sucção suave para formar uma vedação.
2. É comum para estimular o nervo intacto desenhando em um loop do nervo perto do ponto de saída do SNC. Esta abordagem permite a estimulação fácil da preparação intacto, mas tem a desvantagem de que a atividade do SNC evocadas espontânea pode ocorrer sobreposição no paradigma estímulo aplicado. Uma alternativa é para estimular o nervo motor de corte. Isto pode ser alcançado se o sistema nervoso central é removido, embora esse procedimento tende a esticar os nervos e pode causar danos. O nervo também pode ser cortado com um microeletrodo de vidro afiado, mas esse procedimento é tedioso e difícil. É recomendado que os registros sejam feitos de preparação intacta.
3. A estimulação pode ser aplicado com uma variedade de paradigmas. Estimulação breve (0,2-1 ms) funciona melhor e intensidade do estímulo (geralmente 1-5 V) vai depender da configuração de sucção e devem ser experimentalmente determinados para cada célula. Suprathreshold estimulação do nervo motor é melhor conseguido através da criação da força de estímulo ligeiramente acima (1-2 volts) limiar. Respostas evocadas MNJ são registrados a partir do patch-fixada do músculo, como descrito acima. O artefato choque pode ser substancialmente reduzida com o uso de um terreno virtual isolado.
4. Uma alternativa menos confiável para o padrão de sucção estimulação do nervo eletrodo é a estimulação direta do sistema nervoso central (Nishikawa e Kidokoro, 1995). Um microeletrodo cheio de 3-4 M KCl (ou Kac) é inserido no meio do gânglio ventral e pulsos positivo de microamp ~ 2 ~ em intensidade e 2 ms de duração são entregues (Dietcher et al. 1998). A ponta do eletrodo deve ser no neuropil mais próximo hemisegment onde a estimulação é desejada. Transmissão sináptica é registrada no patch-fixada muscular na configuração padrão.
5. O MNJ embrionárias é acessível a toda célula de gravação de patch-clamp toda a sua diferenciação. Para excitatórios juncional atual (EJC) gravações, os sinais são gravados com um amplificador de patch-clamp padrão, filtrado (geralmente em 1-2 KHz), convertido em um sinal digital, utilizando uma interface analógico-digital, e adquirido com um computador usando software apropriado.

Parte 5: Aplicações da Junção Neuromuscular Química e Drogas

1. Qualquer molécula pequena, pode ser efetivamente cobrada sobre o MNJ iontophoresed embrionárias (Aravamudan et al, 1999;. Fergestad et al 1999, 2001). Pipetas iontoforese pode ser puxado para configurações específicas, com aplicações por períodos variáveis, usando pulsos de corrente negativa ou positiva. É vital para evitar fugas entre puLSEs com um apoio apropriado oposição atual (Broadie et al 1993d;. Featherstone et al 2002, 2005;.. Rohrbough et al 2007). A magnitude deste apoio actual irá variar com a configuração de pipeta e deve ser determinado experimentalmente.
2. Muitas experiências foram feitas com o neurotransmissor MNJ, L-glutamato (Jan e Jan, 1976b), utilizando uma solução estoque de 100 mm (monossódico sal; pH 8-9) (Broadie e Bate, 1993c). Pipetas de alta resistência iontoforese (100-200 mohms) têm sido usados ​​para o receptor de glutamato (gluR) mapeamento (Broadie e Bate, 1993d), e pipetas menor resistência (20-50 mohms) utilizada para estimar a resposta gluR total (Broadie et al. 1995, 1997; Featherstone et al 2002, 2005;. Rohrbough et al 2007).. Pulsos curtos (0,1-1 ms) de negativa de trabalho (~ 10 nA) atual bem, com um suporte pequeno e corrente positiva para evitar fugas.
3. Não-carregada e moléculas carregadas pode ser aplicado por pressão de ejeção (Fergestad e Broadie, 2001;. Featherstone et al 2001). Para aplicação, uma pipeta de ejeção de pressão (<5 mm diâmetro interno) contendo a solução é posicionado próximo (<10 mm) a partir do terminal nervoso. A solução para ser ejetado pode ser aplicado usando uma picospritzer (psi 5-10) ou fonte de ar pressurizado outros (Featherstone et al., 2002). Durante os experimentos prolongada, a câmara de gravação (volume <0,5 ml) deve ser perfundido continuamente (0,1-0,2 ml / seg) com solução salina banho normal.
4. Muitas experiências foram feitas com soro fisiológico hiperosmótico para desencadear a fusão das vesículas sinápticas (Broadie et al 1995;. Aravamudan, et al, 1999;. Fergestad et al, 1999;.. Featherstone, et al, 2000, 2002). Outras experiências foram feitas com toxinas, como argiotoxin 636 contra os receptores de glutamato e viúva negra latroinsectotoxin veneno da aranha contendo (Broadie et al. 1995).

Parte 6: Complementar junção neuromuscular técnicas de imagem Vital

1. Cinética das vesículas sinápticas podem ser monitorados com corantes fluorescentes lipofílico stryl (Fergestad e Broadie, 2001;. Rohrbough et al 2004). A distribuição das vesículas pode ser observado diretamente, e as taxas de endocitose e exocitose medido. Diversas variantes têm sido feitas com diferentes propriedades fluorescentes (FM1-43, de fluoresceína-like; FM4-64, rodamina-like). Modificações do corante originais produziram produtos com alteradas propriedades hidrofóbicas e, portanto, com cinética de washout diferentes, por exemplo, FM2-10 dissocia muito mais rápido a partir da membrana.
2. Para rotular o MNJ embrionária com corantes stryl, 10 mM FM1-43 pode ser carregado para 1-5 minutos, usando de potássio extracelular elevada (50-90 mM) (Fergestad e Broadie, 2001). Uma abordagem mais fisiológica pode ser alcançado através da estimulação por um eletrodo de sucção do nervo. Preparações são lavados repetidamente em Ca ^{2 +} livre de buffer para 5 minutos, e manteve fluorescência (representando tingido vesículas sinápticas) medido. Para medir a exocitose, pode-se descarregar o corante utilizando o potássio elevados ou estimulação elétrica nervosa.
3. Proteínas de fusão com GFP variantes foram produzidas permitindo multicolor rotulagem do MNJ embrionárias sinapse (Brand, 1999;. Zhang et al 2002). Transgênicos expressando muitas proteínas GFP estão disponíveis, incluindo os marcadores de membrana em geral (por exemplo, mCD8-GFP), marcadores pós-sináptica (por exemplo, Shaker-GFP, GluRIIA-GFP), do citoesqueleto (eg actina-GFP, moesin-GFP, tubulina-GFP) e mitocondrial marcadores (por exemplo, do citocromo C-GFP) e marcadores de vesículas sinápticas (por exemplo, sinaptobrevina-GFP, sinaptotagmina-GFP;. Zhang et al, 2002).
4. Repórteres GFP rótulo compartimentos que são altamente dinâmico e pode ser usado para avaliar as características de desenvolvimento ou fenótipos mutantes (Featherstone e Broadie, 2000). Branqueamento e, em seguida, observando a recuperação da fluorescência (FRAP) tem se mostrado viável, pelo menos no Drosophila larval MNJ (Zhang et al, 2002;. Yan e Broadie, 2007). Uma palavra de cautela, no entanto: alguns desses marcadores não totalmente resgate mutantes nulos e pode até mesmo alterar normais MNJ fisiologia.

Parte 7: Gravar a partir de neurônios Central Motor

1. Muitos neurônios embrionárias podem ser identificados individualmente com base na soma posição e morfologia projeção (Bate e Martinez-Arias, 1993; Goodman e Silva, 1993; Landgraf et al 1997). Além disso, o sistema GAL4/UAS (Brand e Perrimon, 1993) pode ter como alvo expressão GFP para visualizar populações de neurônios identificáveis ​​(Baines et al., 1998). Estudos de gravação até à data têm-se concentrado em um grupo de cinco superficial, os neurônios dorsal dentro do cordão nervoso ventral embrionárias (VNC), quatro neurônios motores (ACC e RP1-4) e um interneurônio PCC (Baines et al, 1998, 1999, 2001. ; Rohrbough e Broadie, 2002; Featherstone et al 1995)..
2. Corpos celulares dos neurônios identificados são acessíveis a toda-cell patch-clamp eletrodos de gravação. O VNC bainha neurolemma primeiro deve ser removido com o tratamento focal breve com protease (Baines e Bate, 1998; Baines et al, 1999;. Rohrbough e Broadie, 2002). Dorsal corpos celulares de neurônios são expostos através de um grande diâmetro (~ 20 mm) pipeta patch contendo 0,5-1% protease (tipo de XIV (Sigma) em solução salina de gravação). O material bainha CNS é puxado por sucção na ponta da pipeta por 1-2 minutos, até as rupturas bainha (Featherstone et al. 1995). Para confirmar a identidade do celular durante as gravações, amarelo lucifer (sal dipotássico, 1-2 mg / ml) pode ser adicionado à solução de patch para visualizar a posição e morfologia da célula.
3. Padrão de célula inteira de tensão e corrente de fixação gravações podem ser feitas (e Rohrbough Broadie, 2002;. Featherstone et al, 2005). A solução salina de gravação externa contém (em mM): 140 NaCl, KCl 3, 2 CaCl _2, 4 MgCl _2, 5 HEPES, 10 de sacarose, 2 NaOH (pH 7,2). A solução patch contém (em mM): 140 K Acetato, 2 MgCl _2, 0,1 CaCl2, 10 HEPES, 1,1 EGTA, 2 Na2-ATP, ~ 6 KOH (pH 7,2). Tensão-clamp gravações são feitas em potenciais realização de -60 mV a 18 ° C. Típico não ajustados potenciais de repouso estão na faixa de -45 a -65 mV (-52,9 ± 7,5 mV, média ± DP, n = 78).
4. Ensaios disponíveis revelam voltagem dependentes correntes iónicas (Baines e Bate, 1998), potenciais de ação repetitivos, sinapticamente mediada por atividade e agonista-gated respostas (Baines et al., 2001). Entradas sinápticas neurônios motores é registrada na forma de ambos rápida AP-mediada excitatórias rápidas correntes sinápticas (CES), e episódios periódicos, sustentada (até 1 seg de duração) de entrada excitatórios que ocorrem várias vezes ou mais por minuto (Baines et al ., 1999; Baines et al, 2001)..
5. Soma de células respondem a acetilcolina iontophoretically aplicada (ACh) e os inibidores transmissor GABA (Bate Baines e, de 1998;. Featherstone et al 2005). ACh pode ser aplicado à soma iontophoretically neuronal através de um microeletrodo afiada contendo 100mM ACh em dH ₂ 0, a pH 4-5, a favor iontoforese agonista pela corrente positiva.

Resultados representante

Muscular longitudinal ventral 6 é segmentos A2-A3 é o alvo mais comumente utilizado para a gravação (Broadie e Bate, 1993a-d; Harrison et al 1994;. Sweeney et al, 1995;. Renden et al 2001;. Huang et al 2006.; Mohrmann et al. 2008). No embrião maduro e recém-eclodidos, larva de primeiro ínstar (20-21 AEL horas a 25 ° C = incubação), músculo 6 capacitância de células inteiras é tipicamente 25-30 pF, e as resistências de entrada 20-40 mohms, mudando com a idade de desenvolvimento. Máxima MNJ gama correntes sinápticas de dezenas de picoamps (13-14 hrs AEL) para 1-2NA (20-21 hrs AEL), aumentando rapidamente em função da idade. Medida direta de glutamato-gated correntes respostas rendimento máximo de centenas de picoamps (13-14 hrs AEL) para 1,5 4NA pouco antes da eclosão. Erros série de resistência (resistência em série corrente total X) são geralmente <5 mV, mas, na maturidade, incubação pré-embriões, pode ser tão alta quanto 10 + mV e, portanto, compensação da resistência série é aconselhada. Músculos embrionárias com um diâmetro médio de 10-30 micrômetros, comprimento médio de 40-80 mM, parecem mostrar parâmetros de fixação quase ideal espaço. Célula constantes clamp tempo _(série R _célula XC) média, menos de 0,25 ms.

No embrião maduro e larva recém-eclodidos, a população neurônio dorsal motor tem sido objecto de gravação mais limitado. Gravações revelam soma neuronal capacitância células inteiras na faixa de 1,8-2,5 pF (2,0 pF média), resistência em série de 40-60 mohms e resistência de entrada de ~ 5 GÊ (Baines e Bate, 1998; Featherstone et al 2005). Estas células claramente crescer em tamanho e complexidade durante a maturação do embrião, e este crescimento continue ao longo do desenvolvimento larval. Em terceiro ínstares, capacitância de células inteiras é 17-20 pF, a resistência série é 25-37 mohms e médias resistência de entrada ~ 900 mohms (Rohrbough e Broadie, 2002; Richard Baines, comunicação pessoal). Condutâncias iônicas aumentar ao longo do desenvolvimento, mas a densidade de corrente (pA / pF) permanece notavelmente constante. Em embriões maduros, correntes sinápticas média de 75 100 Pa em amplitude, com ambos os eventos rápidos e correntes ESC prolongada média de ~ 500 ms (Baines e Bate, 1998; Featherstone et al 2005). Em embriões, esses eventos sustentada médio por 3-5 min, aumentando para ~ 20 por min no primeiro estádio (Richard Baines, comunicação pessoal). Note-se que a complexidade morfológica e propriedades da membrana de Drosophila neurônios faz com que seja praticamente impossível de tensão adequada fixação da célula muito além da soma. Deve-se, portanto, interpretar as gravações com cuidado.

Discussion

Eletrofisiológicas gravação a partir de embriões Drosophila requer manipulação manual e dissecção. A saúde da preparação e conseqüente qualidade das gravações, depende de um ser capaz de rapidamente e ordenadamente preparar os tecidos frágeis embrionárias para gravação, e depois executar o experimento. Experimentadores devem ser proficientes em ambas as dissecções embrionárias e eletrofisiologia patch clamp antes de tentar resolver ao mesmo tempo.

As gravações podem ser feitas em uma das diversas variantes do "padrão modificado" ou "hemolinfa-like" (HL) salinas. As principais diferenças entre essas duas classes salinas são: 1) Na ⁺ concentração (120-135 mM padrão vs 70 mm HL) e 2) Mg ^{2 +} de concentração (4 padrão vs 20 mM mM HL). A principal vantagem da alta concentração ^de Na ⁺ na solução-padrão é para facilitar a ação potencial de propagação e, portanto, a manutenção do normal, padrão de transmissão sináptica. O salinas HL suprimir ação potencial de transmissão sináptica mediada. A diferença de Mg ^{2 +,} que bloqueia canais de cálcio voltagem-dependente, altera a amplitude da transmissão sináptica e desloca o Ca ^{2 +} para cima de dependência-range nas salinas HL (Stewart et al. 1994). HL salinas, portanto, mostram muito mais baixas amplitudes transmissão sináptica em um dado [Ca ^{2 +].} Controle cuidadoso da osmolaridade elimina vacuolização celular em ambos os salinas e morfologia parece igualmente bem preservados em solução salina. Uma vez que nem salina replica hemolinfa real, a seleção de um soro fisiológico deve refletir as necessidades da questão em estudo.

Existem várias orientações importantes para maximizar o sucesso das gravações embrionárias. Primeiro, a capacidade de formar com sucesso selos gigaohm no músculo embrionárias diminui com a idade de desenvolvimento. Isto é provavelmente devido principalmente ao desenvolvimento da membrana basal ao redor dos músculos amadurecimento. Para compensar, o tratamento mais prolongado colagenase (1-2 min) é necessária. No entanto, é preciso ter cuidado porque este tratamento enzimático alongada rapidamente comprometer a fixação à parede muscular do corpo, e pode facilmente levar ao descolamento do músculo. Uma regra que temos encontrado eficaz é limitar o tratamento enzimático para ~ 50% do tempo que provoca descolamento do músculo detectável. Em segundo lugar, é crucial que o nervo foi um ajuste apertado no eletrodo de sucção para a estimulação adequada; muito solto eo estímulo falhar, muito apertada e não é possível estimular um segmento adequado do nervo. Em nossa experiência, este é definitivamente o maior limitação única gravação MNJ sucesso. O diâmetro adequado para o eletrodo de sucção deve ser determinada empiricamente, mas todos os esforços devem ser feitos para preservar um eletrodo de estimulação boa, que pode ser facilmente utilizado por um dia inteiro de gravação. Terceiro, para aplicações bem sucedidas de neurotransmissores e drogas para o MNJ, é fundamental para se familiarizar com a colocação de sinapse. Com a experiência, as terminações estereotipada pode ser facilmente encontrado com a óptica DIC. Para o novato, terminações nervosas no embrião pode ser revelado com membrana permeante fluorescentes corantes mitocondrial, como Rodamina 123 ou 4-Di-2-Asp (Yoshikami e Okun, 1984; Broadie e Bate, 1993a). O embrião dissecados é simplesmente exposto ao corante corante (5mM, 5 minutos) e excesso removido com várias lavagens de soro fisiológico. A preparação é então visto com um anexo de epi-fluorescência e filtros apropriados. Abordagens semelhantes podem utilizar construções GFP transgênicos marcação da sinapse embrionárias.