Preparación de Aplysia Sensorio-motor culturas de células neuronales

Summary

Cultivos primarios de

Abstract

El sistema nervioso del molusco marino Aplysia californica es relativamente simple, que consiste en aproximadamente 20.000 neuronas. Las neuronas son grandes (hasta 1 mm de diámetro) e identificable, con distintos tamaños, formas, posiciones y pigmentaciones, y los cuerpos de las células son expuestas externamente en los ganglios pares cinco marcas distribuidas por todo el cuerpo del animal. Estas propiedades han permitido a los investigadores para delimitar los circuitos subyacentes comportamientos específicos en los animales ^1. La conexión entre monosináptica neuronas sensoriales y motoras es un componente central del reflejo de enmalle a la retirada del animal, un simple reflejo defensivo en el que el animal se retira de su enmalle en respuesta a la estimulación táctil del sifón. Este reflejo se somete a las formas de aprendizaje no asociativo y asociativo, incluyendo la sensibilización, la habituación y condicionamiento clásico. De beneficio particular para el estudio de la plasticidad sináptica, las sinapsis sensorio-motor puede ser reconstituida en la cultura, donde bien caracterizados estímulos provocan las formas de plasticidad que tienen correlatos directos en el comportamiento de los animales ^2,3. Específicamente, la aplicación de la serotonina produce un reforzamiento sináptico que, según el protocolo de aplicación, tiene una duración de minutos (a corto plazo de facilitación), horas (a medio plazo de facilitación) o días (facilitación de largo plazo). Por el contrario, la aplicación de la FMRFamide transmisor péptido produce un debilitamiento o la depresión sináptica que, según el protocolo de aplicación, pueden durar desde minutos a días (depresión a largo plazo). El gran tamaño de las neuronas permite la grabación repetidas electrodo afilado de la fuerza sináptica durante períodos de días, junto con la microinyección de vectores de expresión, siRNAs y otros compuestos específicos de cascadas de señalización y de las moléculas y así identificar los pasos de biología molecular y celular que subyacen a los cambios en la eficacia sináptica.

Una ventaja adicional del sistema de cultivo Aplysia viene del hecho de que las neuronas sinapsis demostrar la especificidad de la cultura en ^4,5. Así, las neuronas sensoriales no forman sinapsis con ellos mismos (autapses) o con otras neuronas sensoriales, ni forman sinapsis con las neuronas no son objeto de automotor identificado en la cultura. Las varices, los sitios de contacto sináptico entre las neuronas sensoriales y motoras, son lo suficientemente grandes (2-7 micras de diámetro) para permitir la formación de sinapsis (así como cambios en la morfología sináptica) con las neuronas motoras de destino para ser estudiado a nivel microscópico de luz.

En este vídeo, que muestran cada paso de la preparación de sensorio-motor cultivos de neuronas, incluyendo adultos y anestesiar Aplysia juvenil, la disección de sus ganglios, la digestión de la proteasa de los ganglios, la eliminación del tejido conjuntivo por microdisección, la identificación de dos neuronas sensoriales y motoras y la eliminación de cada tipo celular por microdisección, revestimiento de la neurona motora, además de la neurona sensorial y la manipulación de las neuritas sensorial para formar el contacto con el cultivo de neuronas motoras.

Protocol

Preparación (véase la sección de soluciones al final del protocolo para la composición de las soluciones)

1. Preparar platos de cultivo. Capa de vidrio y de la cultura plato Mattek con fondo de vidrio con poli-L-lisina (hecho en borato de sodio). Añade suficiente para cubrir completamente el vidrio bien y dejar de> 1 hora (se puede dejar toda la noche). Bien eliminar el ácido poli-L-lisina mediante lavado en agua de mar artificial (ASW) 4-5 veces. Después de quitar el último enjuague, agregar 2 ml de 50% L15 (junto con las sales y los que contienen L-glutamina a una concentración final de 2 mM) / 50% hemolinfa. Este medio de cultivo debe estar en el plato por lo menos una hora antes de las células de revestimiento de manera que las capas de la hemolinfa del plato.
2. Limpiar las herramientas y los platos Sylgard con etanol, enjuáguelos completamente con ddH ₂ 0 y luego colocarlos en> 1 hora bajo una luz UV en el barrio la cultura.
3. Preparar electrodos fuerte para microdisección de las neuronas. El uso de un extractor de microelectrodos (por ejemplo, Sutter Flaming Brown P-97), tire de los electrodos de vidrio con pipeta de 1,5 mm de diámetro exterior, 0,86 a 1,12 mm de diámetro interior y 100 mm de longitud (por ejemplo, AM catálogo del sistema # 628000; Instrumentos World Precision TW150-4, 1,55 / 1,12). Utilice los parámetros que producen un electrodo con punta fina larga y tenue de la resistencia tan alta que no hay producto capilar de líquido cuando se coloca en solución. La presencia de un menisco líquido significa que la punta del electrodo puede dañar las neuronas durante el aislamiento. El libro de cocina de electrodos Sutter ofrece excelentes pautas para la creación de programas de los electrodos. Nosotros usamos un filamento de caja, y una de un solo paso para generar atracción electrodos cultura.
4. Preparar la solución anestésica (0,35 M MgCl2), medio de cultivo (L15 suplementado con sales y hemolinfa), y la solución de proteasa (1% de la proteasa tipo IX, Sigma, 1 unidad / mg, a una concentración final de 10 unidades / ml).
5. Animales: uso en adultos 80 a 100 g Aplysia para el aislamiento de las neuronas sensoriales y de la LFS neuronas motoras. El uso de menores 4.1 g Aplysia para el aislamiento de las neuronas motoras L7. Retire con cuidado a los animales de los tanques de agua de mar, y mantener en agua de mar (en el vaso, cuchara o una bolsa de plástico) para no más de 30 minutos antes de comenzar la anestesia y el procedimiento de la cultura.

Cultura procedimiento

A. Cultivo pleural neuronas sensoriales de 80-100 g Aplysia

1. Anestesiar a los animales para la extracción de los ganglios: Inyectar 0,35 M de MgCl ₂ en adultos Aplysia (80-100 g) con una jeringa de 60 ml con una aguja de 1,5 pulgadas de calibre 18. Introduzca el pie del animal en un ángulo de 35 grados, y no entrar en demasiada profundidad. El objetivo es inyectar en el hemocele del animal, sin penetrar en los órganos internos. El animal debe ser muy distendido y relajado.
2. Disecar los ganglios: Pin el animal anestesiado en un plato de disección, con un alfiler (de calibre 18 agujas funcionan bien para los animales de 80 a 100 g) a la cabeza y la cola, y el pie hacia arriba. Sujete el pie con una pinza dentada y cortar la piel y el tejido conectivo subyacente a todo lo largo del pie (desde la cabeza hasta la cola) con una tijera quirúrgica. Pin de los dos lados hacia abajo. Utilizando unas pinzas y tijeras, corte el esófago y hágase a un lado para exponer los ganglios. El uso de un fórceps y tijeras finas, cortar los ganglios pedal pleural (las neuronas sensoriales en los ganglios pleural). Dejar una buena cantidad de nervios ya que esto hace que sea más fácil de precisar los ganglios después del tratamiento de la proteasa.
3. La digestión de los ganglios de la proteasa: Coloque los ganglios en la solución de proteasa (10 mg / ml de 1 unidad / mg en L15) en una incubadora a 34,5 ° C (34-35 ° C está bien) durante 2 horas y 15 minutos. Con la punta fina pinza de transferencia y lavado de los ganglios en ASW en tres ocasiones. Mantenga los ganglios en el L15. Tenga en cuenta que el tiempo de incubación puede variar de la proteasa. El propósito es permitir que el tejido conectivo que se puede quitar fácilmente. Si es demasiado difícil desheath los ganglios sin dañar las neuronas, aumenta el tiempo de incubación de la proteasa. Si es muy fácil de desheath los ganglios, y las neuronas son "suaves", reducir el tiempo de incubación de la proteasa.
4. Desheathing los ganglios: Transferencia de la proteasa digerido ganglios a un 60 mm o 35 mm plato que contiene Sylgard y L15. Viendo bajo un microscopio estereoscópico (con iluminación halógena exterior), quitar los ganglios pedal y precisar los ganglios pleural en el plato Sylgard en la orientación adecuada con alfileres de insectos y unas pinzas finas. Con el fórceps y tijeras quirúrgicas Vanna, levante con cuidado el tejido conectivo y corte para exponer el grupo sensorial. Tenga cuidado de no tocar nunca ni dañe la somata neuronal. Elimine cualquier exceso de tejido conectivo en el plato y añadir más medio, asegurándose de no exponer el ganglio desheathed al aire. El grupo sensorial se compone de aproximadamente 200 neuronas de clúster de 40 a 50 micrones de diámetro. Establecer un alfiler para hacer un "post" a corta distancia de la Gangliones (en el campo de visión).
5. El aislamiento de las neuronas: El uso de electrodos largos y afilados cultura del vidrio, sacar el identificado las neuronas de uno en uno al tocar el cuerpo de la célula justo fuera del centro (no empalar) y poco a poco y constantemente tirando del soma celular, junto con el axón, lejos de la ganglionares. Golpee suavemente contra el pasador de desalojar a las neuronas del electrodo.
6. Neuronas Revestimiento: Utilice un Pipetman (P10) para la transferencia de las neuronas individuales de la antena Sylgard a una placa de cultivo. Antes de la transferencia de las neuronas, medio de cultivo de la pipeta en la punta de modo que la punta de plástico está cubierta con la hemolinfa (esto evita que las neuronas se pegue al plástico). Tenga mucho cuidado para evitar exponer a las neuronas a las burbujas de aire o de cualquier fuerza extrema (es decir, tener mucho cuidado y quitar las neuronas de la pipetteman). Distribuir uniformemente a través de las neuronas del plato. Use un electrodo afilado para suavemente hacia los procesos y toque hacia abajo hasta el fondo.
7. Incubación: dejar los platos en la platina del microscopio a temperatura ambiente durante no menos de 3 horas. En forma rutinaria a dejar toda la noche. Asegúrese de que la platina del microscopio es imperturbable durante este período. Cubrir el escenario con papel de aluminio para protegerlo de la luz. Con cuidado, traslado a una incubadora de 18 ° C.
8. Los cultivos deben cumplir con el plato de aproximadamente 3 horas y el crecimiento de las neuritas nueva debe ser visible dentro de aproximadamente 6.12 hrs. El crecimiento de las neuronas sensoriales aisladas llega a una meseta de 3 ó 4 DIV. Tenga en cuenta que las neuronas sensoriales aisladas no doe autapses forma o sinapsis química entre ellos, aunque sí forma eléctrica uniones brecha.

B. Preparación de las neuronas sensoriales, las neuronas motoras cocultivos

Las neuronas sensoriales forman sinapsis con las neuronas motoras en la cultura meta. Las neuronas motoras más comunes son las neuronas motoras LFS y la neurona del motor L7, desde el ganglio abdominal. Las neuronas motoras LFS están aislados de los adultos (80 a 100 g) Aplysia, y hay aproximadamente 20 neuronas motoras LFS por ganglio abdominal. El L7 de la neurona motora es aislada de juveniles (1-4 g) los animales, y sólo hay un L7 por los ganglios abdominales. LFS neuronas motoras son 40-50 micras de diámetro, se intercalan entre las neuronas sensoriales LE cerca de la raíz del nervio sifón en la superficie ventral de los ganglios abdominales, y se caracterizan por una mancha de pigmento oscuro sutil en cada uno de soma. El L7 de la neurona motora es de 100-150 micras de diámetro y está presente en la superficie dorsal del ganglio, en el borde medio del lado izquierdo del ganglio. Si bien es más económico utilizar LFS neuronas motoras, el gran tamaño de la neurona del motor L7 es una ventaja para algunos experimentos. La L11 de la neurona motora, también en la superficie dorsal izquierda del ganglio abdominal, caudal de L7, es una neurona del motor no son objetivos y pueden ser usados ​​efectivamente como un control con el que la neurona sensorial fasciculates pero no forman sinapsis químicas.

1. Anestesiar a los animales para la extracción de los ganglios. Para LFS neuronas motoras, como se describe para hacer pleural neuronas sensoriales. Para L7 las neuronas motoras, inyectar 0,35 M _de MgCl2 en Aplysia juvenil (1-4 g) con una jeringa de 10 ml con una aguja de calibre 21.
2. Diseccionar los ganglios abdominales: Pin el animal anestesiado en un plato de disección como se describió anteriormente (con 21 agujas de calibre para los animales jóvenes). El uso de un fórceps y tijeras finas, cortar los ganglios abdominales.
3. La digestión de los ganglios de la proteasa: Esto se hace como se describe en las neuronas sensoriales pleural, salvo que el tiempo de digestión se reduce a 1 h 45 min de los ganglios de juveniles (1-4 g) los animales.
4. Desheathing los ganglios: Transferencia de la proteasa digerido los ganglios de un plato de 35 mm o 60 que contiene Sylgard y L15. Viendo bajo un microscopio estereoscópico (con iluminación halógena externa), en los ganglios en el plato Sylgard en la orientación adecuada con alfileres de insectos y unas pinzas finas. Con el fórceps y tijeras quirúrgicas Vanna, levante con cuidado el tejido conectivo y corte para exponer los cuerpos de las células neuronales. Para aislar las neuronas LFS motor, pin del ganglio de manera que la superficie ventral hacia arriba, y con una pinza de tirar de la vaina de tejido conectivo para exponer toda la mitad del ganglio que contiene el LFS las neuronas motoras (a su derecha), el desheath partes restantes del ganglio, remover el tejido conectivo del plato y añadir más L15. Para aislar el L7 o L11 de la neurona motora, el pin del ganglio de manera que la superficie dorsal es hacia arriba, y con una pinza de tirar de la vaina de tejido conectivo para exponer la mitad del ganglio que contiene tanto L7 y L11 (a la izquierda). Tenga cuidado de no tocar nunca ni dañe la somata neuronal. Coloque un alfiler para hacer un "post" a corta distancia del ganglio (dentro del campo de visión).
5. El aislamiento de las neuronas: Quitar las neuronas con un electrodo afilado como se describe en las neuronas sensoriales. Las neuronas LFS son diferentiated de vecinos neuronas sensoriales LE sobre la base de un lugar pequeño y oscuro pigmento en sus cuerpos celulares. La neurona L7 se puede diferenciar de la neurona L11 en primer lugar porque la L11 es caudal de L7, ya que el cuerpo de la celda L11 es más de forma oblonga, mientras que el cuerpo celular L7 es redondo y por el axón L11 tiende a ramificarse en dos cerca de la célula cuerpo.
6. Neuronas Revestimiento: Utilice un Pipetman (P10) para la transferencia de las neuronas individuales de la antena Sylgard a una placa de cultivo como se describe en las neuronas sensoriales.
7. Vinculación con las neuronas sensoriales: Que las neuronas motoras se adhieren a la placa de cultivo de al menos 1 hora. A continuación, añada las neuronas sensoriales aisladas con una Pipetman, la entrega de cada neurona sensorial junto a una neurona motora plateado. El uso de un electrodo de vidrio afilado cuidadosamente enderezar el axón de neuronas sensoriales, y convencer al cuerpo de la célula sensorial a una posición al lado de la neurona motora, a una distancia igual o ligeramente menor que la longitud del axón de células sensoriales. Usando el electrodo de vidrio, cable coaxial del axón sensorial a entrar en contacto con la neurona motora, muy suavemente con el lado del electrodo cónico que, finalmente, el axón sensorial físicamente en contacto con el axón de la neurona motora. No levante la placa de cultivo, sino que se deslizan suavemente el plato a lo largo de la platina del microscopio.
8. Dejar los platos en la platina del microscopio a temperatura ambiente durante no menos de 3 horas y traslado a una incubadora de 18 ° C como se describe en las neuronas sensoriales.
9. Los cultivos deben cumplir con el plato de aproximadamente 3 horas y el crecimiento de las neuritas nueva debe ser visible dentro de aproximadamente 6.12 hrs. Las neuronas sensoriales forman sinapsis glutamatérgica con las neuronas motoras muy rápido - tan pronto como las células se adhieren lo suficiente como para realizar la grabación de electrodos aguda (3-5 horas), una excitación post-sináptica potenciales se pueden grabar. Conectividad sináptica sigue aumentando hasta DIV 3, y luego se mantienen estables hasta DIV7. Las neuronas se muestran crecimiento de las neuritas elaborados durante los primeros uno a tres días en la cultura.

C. Preparación de hemolinfa

Hemolinfa se utiliza como un factor de crecimiento en la cultura de Aplysia (análogo al uso de suero fetal bovino en cultivo de células de mamíferos). Se recoge de gran tamaño (500 g, 1 kg) los animales, y el mejor momento para recoger la hemolinfa (anecdóticamente) es durante la primavera (mediados de marzo a junio). Envolver al animal en un underpad desechables de manera que sólo una pequeña parte del animal está expuesto, limpiar la parte de la piel con etanol, y luego mantenerlo, mientras que otra persona use una hoja de afeitar estéril para hacer una incisión en el área expuesta. Apriete el animal para que el eyacula hemolinfa en un vaso limpio, asegurándose de que no entra en contacto con la piel sucia de los animales. La hemolinfa llena el hemocele de los animales (es decir, el animal es básicamente un saco de hemolinfa). Vuelva a envolver al animal una o dos veces, hacer una nueva incisión y apretar duro para recoger la hemolinfa tanto como sea posible (por cobrar en un vaso de nuevo, así que si se contamina, la primera colección todavía se puede utilizar). Hemolinfa de cada animal debe mantenerse por separado (es decir, no hemolinfa piscina de diferentes animales). Haga girar la hemolinfa a 2000 xg durante 10 min para eliminar las células sanguíneas. Alícuota del sobrenadante en alícuotas de 10 ml, la etiqueta de los animales y almacenar a -80 ° C. Tenga en cuenta que la hemolinfa almacenadas a -20 ° C forma un precipitado en el medio. Una nueva alícuota de la hemolinfa se debe utilizar cada medio de cultivo tiempo se prepara, y la alícuota deben descongelarse inmediatamente antes de preparar el medio. No vuelva a congelar después de la descongelación.

Discussion

La preparación exitosa de Aplysia sensorio-motor culturas tiene una curva de aprendizaje un poco lento, ya que implica el desarrollo de las habilidades motoras finas relacionadas con microdisección y la manipulación de las neuronas individuales han visto a través de un microscopio estereoscópico. En nuestra experiencia, lleva semanas aproximadamente 1-3 de la práctica para obtener saludable neuronas sensoriales aisladas en la cultura y un adicional de 1-3 semanas para aprender a par de las neuronas sensoriales con las neuronas motoras. En forma rutinaria preparar cultivos en un banco de Labconco limpio, aunque es posible prepararlas en cualquier mesa de laboratorio o en el escritorio, siempre y cuando el microscopio es imperturbable durante el cultivo (las vibraciones o perturbaciones mecánicas evitar la adherencia de las neuronas). Dado que las neuronas crecen en agua de mar a 18 ° C contaminación, bacterias y hongos son mucho menos comunes que en cultivos celulares de mamíferos. La variable más importante en la preparación de la cultura es la calidad de los animales. Aplysia puede ser comprado a los vendedores que los recogen directamente desde el Océano Pacífico (prontitud, o Marinus), o de la Universidad de Miami instalación de maricultura, que recoge las parejas reproductoras desde el Pacífico y luego crece Aplysia a través del ciclo de cría. Por lo tanto, los animales son genéticamente heterogéneas, y, en el caso de los animales recogidos en el mar, también son heterogéneos en cuanto a su historia ambiental. Hay una cierta estacionalidad en la calidad de las neuronas obtenidas de Aplysia, con el peor período que ocurre generalmente en agosto, y otro período de baja calidad en torno a diciembre. Otra variable importante es la hemolinfa. Es una buena idea para poner a prueba los diferentes lotes de la hemolinfa de su crecimiento, promover la capacidad, y utilizar el mismo lote de la hemolinfa de una serie de experimentos.

A pesar de la dificultad de la preparación de los cultivos Aplysia neuronal, que poseen una serie de ventajas únicas y valiosas para el estudio de la formación de sinapsis y la plasticidad sináptica. Forman conexiones monosináptico en la cultura que pueden ser monitoreados mediante el registro de electrodos fuerte durante períodos de días. Protocolos bien caracterizados existen que provocan las formas de plasticidad que tienen un claro paralelismo en el comportamiento del animal. Los estímulos pueden ser aplicados a la bañera o en subconjuntos de synapses6, 7, y la geometría de culturas puede ser variada, para que una neurona sensorial contactos de la neurona del motor único, o una neurona sensorial con un axón bifurcado dos contactos de las neuronas motoras, sensoriales o dos neuronas en contacto con un neurona motora individual. Las vías de la biología molecular y celular puede ser alterada en las neuronas individuales mediante microinyección de ADN, el ARN, siRNA y otros reactivos, y los efectos sobre la estructura y la función neuronal, la transmisión sináptica y la plasticidad se puede controlar con resolución temporal y espacial. El NIH y el Instituto Broad están a punto de completar la secuenciación del genoma Aplysia, que debe

Materials

Solutions needed for culture 0.35 M MgCl2, stored at room temperature, used for anesthesia. Poly-L-lysine solution, Sigma: P-1524, MW >300,000, made in 0.1M Sodium Borate pH8.2 to 0.5mg/ml solution. Vortex well and filter sterilize through a 0.22 μm filter, store it at 4C°. Do not freeze-thaw. L-15 Medium powder (Leibovitz) (Sigma: L4386) supplemented with the salts as below to make 1 liter L-15 powder 13.8g NaCl 15.4 g D-Glucose 6.24 g MgSO4•7H20 6.45g KCl 350 mg NaHCO3 170 mg MgCl2•6H2O 5.49 g CaCl2•2H2O 1.43g HEPES 3.53g Add ddH20 to 1 liter. The pH should be about 7.4-7.5, add 10ml of 100X Pen/Strep solution, and filter-sterilize through a 0.22 μm filter. Store at 4C0 for no longer than 1 month. Protease digestion solution: 1% Protease IX (1unit/mg) is made in L15 (supplemented with salts as above) or in ASW immediately before use, filter-sterilized through a 0.22 μm Millipore. 5mls should be enough for the ganglia from two animals (make sure the ganglia are completely immersed in protease solution). Sigma has reported that they will discontinue selling Protease IX. A substitute protease is: Dispase II (Roche Applied Science catalog # 04942078001). Culture medium. Immediately prior to preparing cultures, thaw a 10 ml aliquot of hemolymph and mix it with 10 mls of L15 (supplemented with salts as above) to make 20mls culture medium. Add 200 μl of 200mM L- Glutamine, mix well and use for preparing cultures. This medium should be prepared fresh each time cultures are made. Artificial Seawater can be made from Instant Ocean (Aquarium Systems, Mentor, OH) or as follows: 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 30 mM MgCl2(6H2O), 20 mM MgSO4, 10 mM CaCl2(2H2O), 10 mM HEPES, with pH adjusted to 7.4.