制备海兔感觉运动神经元细胞培养

Summary

小学文化

Abstract

海洋软体动物海兔californica的神经系统是相对简单的，约20,000神经元组成。神经元大（直径可达1毫米）和识别，具有不同的大小，形状，位置和色素沉着，胞体外部暴露在五个配对神经节分布于整个动物的身体。这些属性允许划定的基本^电路 1，在动物的特定行为的调查。感觉和运动神经元之间的突触连接，是一个在动物的鳃撤退反射的核心组成部分，其中动物撤回其刺中虹吸触觉刺激的一个简单的防御反射。这种反射的非关联和关联学习经历的形式，包括敏，习惯性和经典性条件反射，。感官电机突触突触可塑性的研究特别的好处，可以在文化重组，特点刺激引起的可塑性在动物^的 2,3行为有直接关联的形式。具体来说，羟色胺的应用程序产生一个突触的加强，取决于应用协议，持续几分钟（短期便利），小时（中期的便利）或天（长期便利）。相比之下，肽发射机FMRFamide的应用产生了突触减弱或抑郁症，取决于应用协议，去年从天分钟（长期抑郁症）。的神经元的大尺寸允许反复突触强度的急剧电极记录天期间注射表达载体，siRNA和其他化合物，针对特定的信号级联和分子，从而确定分子和细胞生物学的步骤背后的变化在突触效能。

海兔文化体系的一个额外的好处，从事实的神经元突触特异性^展示文化4,5。因此，感觉神经元不与自己（autapses）或与其他感觉神经元形成突触，也没有形成与非目标确定在文化运动神经元突触。静脉曲张，感觉和运动神经元之间的突触联系的网站，都足够大（直径在2-7微米），允许在光镜水平研究目标的运动神经元突触的形成与（以及突触形态的变化）。

在这段视频中，我们展示了准备的感觉，运动神经元的文化，包括anesthetizing成人和青少年海兔的每一步，剖析他们的神经节，神经节蛋白酶消化，去除结缔组织显微切割，感觉和运动神经元的识别和清除每个显微切割细胞类型，运动神经元，感觉神经元和感觉神经轴突的操纵此外电镀形成与培养运动神经元的联系。

Protocol

准备（参见解决方案在协议结束部分解决方案的组成）

1. 准备培养皿。涂层玻璃Mattek玻璃底培养皿与聚- L -赖氨酸（四硼酸钠）。加入足够的完全覆盖的玻璃和离开> 1小时（可以过夜）。彻底清除聚- L -赖氨酸，在人工海水冲洗（ASW）的4-5倍。删除最后一次冲洗后，加2毫升50％L15（补充盐和含L -谷氨酰胺在终浓度为2mm）/ 50％血淋巴。这种培养基中必​​须至少一个小时，在盘前电镀细胞，使血淋巴大衣的菜。
2. 清洁工具和Sylgard菜用乙醇，冲洗彻底DDH ₂ 0> 1小时，然后将他们文化罩在UV光下。
3. 准备的神经元显微切割电极是雪亮的。 使用微电极拉马（如萨特火焰山布朗的P - 97），外直径1.5毫米，内径0.86至1.12毫米和100毫米的长度与拉玻璃吸管电极（如AM系统目录＃628000;世界精密仪器TW150 - 4，1.55 / 1.12）。使用参数产生长如此之高的阻力和束状的精尖，没有毛细管流体摄入量时，在溶液中的电极。流体半月板的存在，意味着在隔离，电极尖端会损害神经元。萨特电极食谱设立电极方案提供了出色的指引。我们用一个框丝，和一个单步拉来生成文化的电极。
4. 准备麻醉的解决方案（0.35M氯化镁），培养基（L15辅以盐和血淋巴），和蛋白酶溶液（1％蛋白酶类型第九，Sigma公司，1个单位/毫克，到终浓度为10单位/ ml）。
5. 动物：成人80-100克海兔感觉神经元的隔离和LFS的运动神经元。使用隔离L7运动神经元的少年1-4 克海兔。轻轻取出动物从海水中的坦克，并维持在海水中不超过30分钟（在烧杯中，桶或塑料袋），然后才开始麻醉和文化的过程。

文化程序

A.培养胸腔80-100克海兔感觉神经元

1. 清除神经节麻醉的动物：成年海兔 （80-100克）18号1.5寸毫针用60毫升注射器注入0.35米氯化镁_2。输入动物的脚在约35度的角度，并没有进入过深。我们的目标是不穿透五脏六腑注入到动物hemocoel。动物应该成为非常扩张和宽松的。
2. 解剖神经节：引脚与麻醉动物解剖盘，在头部和尾部的针（18号针头的工作以及为80-100克动物），脚朝上。用有齿镊保持脚和穿过皮肤和底层的结缔组织脚长度（从头部到尾部）用手术剪刀。引脚的双方。使用镊子和剪刀，切断食管，拉边给了暴露的神经节。用细镊子和罚款剪刀，剪出的胸腔踏板神经节（在胸膜神经节感觉神经元）。离开一个公平的神经，因为这使得更容易牵制蛋白酶处理后的神经节。
3. 蛋白酶消化，神经节：将神经节蛋白酶溶液（10 mg / ml的1个单位/毫克L15）在孵化器设定在34.5 ° C（34-35 ° C是可以）2小时和15分钟。使用精尖镊子转移和洗反潜神经节的三倍。保持在L15的神经节。需要注意的是蛋白酶孵育时间可以有所不同。的目的是为了让结缔组织可以很容易地删除。如果实在是太难了desheath不损坏的神经元的神经节，增加蛋白酶孵育时间。如果它是非常容易desheath的神经节，神经元是“软”，减少蛋白酶孵育时间。
4. Desheathing神经节：蛋白酶消化，神经节转移到60毫米或35mm菜含有sylgard和L15。下一个立体显微镜（外部卤素灯照明）查看，删除踏板节和牵制在正确的方向用昆虫针和罚款钳Sylgard菜胸膜神经节。用细镊子和一个万​​纳手术剪刀，小心地抬起结缔组织和削减它暴露的感觉集群。要小心不要过接触或损坏的神经元somata。从盘删除任何多余的结缔组织，并添加更多的介质，确保从未desheathed节暴露在空气中。感觉集群由约200聚集直径为40-50微米的神经元。设置PIN，使在很短的距离从gangl的“后”离子（视野范围内的）。
5. 神经元的分离：使用长，锋利的玻璃文化电极，拔出所确定的神经元的一个个感人只是偏离中心的细胞体（不刺穿），缓慢而稳定地拉动细胞SOMA，连同轴突，远离神经节。轻轻拍打对引脚逐出电极的神经元。
6. 电镀神经元：使用pipetman（P10）Sylgard菜转移到培养皿的单个神经元。在转移到塑料尖，使涂层与血淋巴提示神经元，吸管培养基（这可防止粘塑料的神经元）。非常谨慎，以避免暴露任何气泡或任何极端势力（即轻轻拿起，并从pipetteman移除神经元）的神经元。整个菜均匀分布的神经元。用锋利的电极轻轻伸直的过程，挖掘他们下到谷底。
7. 孵化：留在室温下不超过3个小时的菜在显微镜阶段。我们经常让他们在一夜之间。确保显微镜阶段，在此期间不受干扰。盖用铝箔，以防止光的阶段。轻轻将它们传输到18 ° C培养箱。
8. 文化应坚持的菜约3小时内，新突起的生长，应约6-12小时内可见。孤立的感觉神经元的增长达到3或4格高原。请注意，孤立的感觉神经元能源部没有形成autapses或与另一个化学突触，虽然他们形成电气间隙路口。

B.感觉神经元运动神经元共同培养的制备

文化目标的运动神经元的感觉神经元形成突触。最常用的运动神经元LFS的运动神经元和L7的运动神经元从腹神经节。 LFS的运动神经元是孤立的成人（80-100克）， 海兔 ，有大约20 LFS的运动神经元，每腹神经节。 L7的运动神经元是从少年（1-4克）动物隔离，并有腹腔神经节的每一个L7的。 LFS的运动神经元，直径40-50微米，靠近腹腔神经节的腹面虹吸神经根感觉神经元的LE之间穿插，特点是每个SOMA一个微妙的暗色素斑。 L7的运动神经元是100-150微米，直径是背表面上的神经节，神经节左侧中间的边缘，目前。虽然这是L7的运动神经元的大尺寸更经济地使用LFS的运动神经元，是有利的一些实验。 L11的运动神经元也对背腹神经节，尾椎到L7的左侧面，是一个非靶运动神经元，并可以有效地控制感觉神经元fasciculates，但没有形成化学突触。

1. 麻醉动物，去除神经节。对于LFS的运动神经元，胸腔感觉神经元。 L7运动神经元，0.35米MgCl _2的少年海兔 （1-4克）用21号针头使用10毫升注射器注入。
2. 解剖腹腔神经节：如上所述（21表针使用动物幼仔）引脚麻醉动物解剖盘。用细镊子和罚款剪刀，剪出腹神经节。
3. 蛋白酶消化，神经节：这是做胸腔感觉神经元的描述，除了消化时间缩短为1小时45分钟，从少年（1-4克）动物神经节。
4. Desheathing神经节：35或60毫米菜含有sylgard和L15的蛋白酶消化，神经节转移。查看下一个立体显微镜（外部卤素灯照明），在神经节Sylgard菜用昆虫针和罚款钳在适当的方向。用细镊子和一个万​​纳手术剪刀，小心地抬起结缔组织和削减它暴露的神经细胞团体。为了隔离LFS运动神经元，针节，使腹面朝上，并用钳拉结缔组织鞘包含LFS desheath的运动神经元（在你的右边），揭露整个神经节半神经节的其余部分，从菜中删除任何结缔组织，并添加更多的L15。要隔离的7层或L11运动神经元，针的神经节，使背水面朝上，并用钳拉结缔组织鞘揭露L7和L11（你的左边）节的一半。要小心不要过接触或损坏的神经元somata。将一根针，使“邮报”在从神经节的短距离（视野内）。
5. 神经细胞的分离：删除描述了一个尖锐的电极为感觉神经元的神经元。 LFS的神经元是差异erentiated从邻近的LE他们somata一个小暗色素斑的基础上的感觉神经元。 L7的神经元可以有所区别，因为L11是L11的神经元首先从尾椎到L7，因为L11的细胞体是椭圆形的形状，而L7细胞体是通才，因为L11的轴突往往分为两个收盘跳转到该单元格身体。
6. 电镀神经元：使用pipetman（P10）Sylgard菜转移到培养皿中的单个神经元，感觉神经元中所述。
7. 感觉神经元的配对：让我们坚持至少1小时的运动神经元的培养皿中。然后添加一个pipetman孤立的感觉神经元，提供每一个镀金的运动神经元附近的感觉神经元。使用锋利的玻璃电极认真理顺感觉神经元轴突，哄的感觉细胞体内的运动神经元的位置，在距离等于或略高于感觉细胞轴突的长度，。使用玻璃电极，同轴感觉轴突接触到的运动神经元，轻轻使用的锥形电极一侧终于有了感觉轴突身体接触的运动神经元轴突。不要解除培养皿中，而是轻轻滑动盘沿显微镜阶段。
8. 留在室温不低于3小时，为感觉神经元转移到18 ° C培养箱显微镜舞台上的菜肴。
9. 文化应坚持的菜约3小时内，新突起的生长，应约6-12小时内可见。感觉神经元的形成与运动神经元谷氨酸突触非常迅速 - 只要细胞是贴壁，足以执行尖锐的电极记录（3-5小时），可以记录兴奋性突触后电位。突触连接继续增加，直到3格，然后直到DIV7稳定。神经元，应显示在第一个3天的文化精心制作的突起生长。

C.血淋巴的制备

淋巴是用来作为一个在海兔文化的生长因子（类似于使用哺乳动物细胞培养胎牛血清） 。它收集了从大（500克，1公斤）的动物，收集血淋巴（闲谈）的最佳时间是在春季（3月中旬至6月）。襁褓使只有一小部分动物暴露在一个一次性underpad的动物，清洁，皮肤用乙醇的部分，然后拿着它，而另一个人使用无菌刀片切口，暴露面积。到一个干净的烧杯中，使血淋巴鞘，确保它不接触动物的脏皮肤，挤出的动物。血淋巴中填充的动物hemocoel（即动物基本上是一个血淋巴囊）。重新包装的动物一次或两次，使一个新的切口，挤压，以收集尽可能多的血淋巴（收集在一个新的烧杯中，因此，如果它被污染，首先收集仍然是可用的）。从每个动物的血淋巴应分开存放（即不从不同的动物池血淋巴）。在2000年为10分钟XG旋转血淋巴去除血细胞。上清分装在10毫升分装，标签由动物和存储于-80 ° C。请注意，储存在-20 ° C的血淋巴的形式在介质中沉淀。每次培养基准备，必须使用的血淋巴中的一个新等分，等分应解冻前的准备中期。不要解冻后重新冷冻。

Discussion

海兔感觉运动文化的成功做好准备，有一个有点慢的学习曲线，因为它涉及到显微切割和操纵通过一个立体显微镜观察单个神经元的精细动作技能的发展。根据我们的经验，它需要大约1-3周的实践，获得健康的文化孤立的感觉神经元和一个额外的1-3周，以了解如何对感觉神经与运动神经元。我们经常准备在Labconco超净工作台文化，虽然有可能准备任何实验室的工作台或办公桌上，只要显微镜是在培养（震动或机械干扰，坚持防止神经元）泰然自若。由于神经元生长在海水中18 ° C，细菌和真菌污染是明显低于在哺乳动物细胞培养中常见的。一个最重要的文化准备的变量是动物的质量 ，海兔可以从厂商直接收集他们从太平洋（矫捷，或Marinus），或从迈阿密海水养殖设施，收集繁殖对大学购买从太平洋和海兔的增长，通过一个繁殖周期。因此，动物遗传异质性，而且，在从海洋中收集到的动物的情况下，他们在其环境的历史异质性。有一些季节性的质量获得从海兔的神经元，通常在八月发生的最糟糕的时期，而12月左右的另一个较低的保质期。另一个重要的变量是血淋巴。这是明智的，以测试不同批次的血淋巴，促进他们的成长能力和一组实验中使用的同一批次的血淋巴。

尽管困难的准备海兔的神经元文化，他们拥有一些独特而宝贵的优势，突触的形成和突触可塑性的研究。他们在文化形式的突触连接，可以通过监测天期间急剧电极记录。协议存在很好的特点，引出形式的可塑性，在动物的行为有明显的相似性。刺激可以洗澡或synapses6的子集，7，和文化的几何形状可以是多种多样的，这样一个感觉神经元接触一个单一的运动神经元，或分叉轴突接触的感觉神经元运动神经元，或两个感官神经元联系个人的运动神经元。注射的DNA，RNA，siRNA和其他试剂，可以在单个神经元改变分子和细胞生物学途径，结构和功能的神经元，突触传递和可塑性的影响可以用时间和空间分辨率监视。美国国立卫生研究院和Broad研究所接近海兔的基因组测序完成，这应

Materials

Solutions needed for culture 0.35 M MgCl2, stored at room temperature, used for anesthesia. Poly-L-lysine solution, Sigma: P-1524, MW >300,000, made in 0.1M Sodium Borate pH8.2 to 0.5mg/ml solution. Vortex well and filter sterilize through a 0.22 μm filter, store it at 4C°. Do not freeze-thaw. L-15 Medium powder (Leibovitz) (Sigma: L4386) supplemented with the salts as below to make 1 liter L-15 powder 13.8g NaCl 15.4 g D-Glucose 6.24 g MgSO4•7H20 6.45g KCl 350 mg NaHCO3 170 mg MgCl2•6H2O 5.49 g CaCl2•2H2O 1.43g HEPES 3.53g Add ddH20 to 1 liter. The pH should be about 7.4-7.5, add 10ml of 100X Pen/Strep solution, and filter-sterilize through a 0.22 μm filter. Store at 4C0 for no longer than 1 month. Protease digestion solution: 1% Protease IX (1unit/mg) is made in L15 (supplemented with salts as above) or in ASW immediately before use, filter-sterilized through a 0.22 μm Millipore. 5mls should be enough for the ganglia from two animals (make sure the ganglia are completely immersed in protease solution). Sigma has reported that they will discontinue selling Protease IX. A substitute protease is: Dispase II (Roche Applied Science catalog # 04942078001). Culture medium. Immediately prior to preparing cultures, thaw a 10 ml aliquot of hemolymph and mix it with 10 mls of L15 (supplemented with salts as above) to make 20mls culture medium. Add 200 μl of 200mM L- Glutamine, mix well and use for preparing cultures. This medium should be prepared fresh each time cultures are made. Artificial Seawater can be made from Instant Ocean (Aquarium Systems, Mentor, OH) or as follows: 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 30 mM MgCl2(6H2O), 20 mM MgSO4, 10 mM CaCl2(2H2O), 10 mM HEPES, with pH adjusted to 7.4.