הכנת Aplysia חושי, מנוע תא תרבויות העצבית

Summary

תרבויות ראשונית של

Abstract

מערכת העצבים של רכיכה ימית Aplysia californica היא פשוטה יחסית, בהיקף של כ -20,000 נוירונים. הנוירונים הם גדולים (עד 1 מ"מ קוטר) לזיהוי, עם גדלים, צורות שונות, עמדות pigmentations, ואת גופי התא נחשפים מבחוץ בגרעיני five לזווג מופץ בכל רחבי הגוף של החיה. תכונות אלו אפשרו לחוקרים לשרטט את המעגלים החשמליים הבסיסיים התנהגויות ספציפיות החיה ^1. הקשר בין הנוירונים monosynaptic החושי והמוטורי היא מרכיב מרכזי של רפלקס הזימים-הנסיגה בשנת החיה, רפלקס הגנתי פשוט שבו החיה תיסוג הזימים שלו בתגובה לגירוי חוש המישוש של הסיפון. רפלקס זה עובר צורות של למידה בלתי אסוציאטיביים אסוציאטיבי, כולל רגישות, התרגלות ועל התניה קלאסית. תועלת מיוחדת ללימוד הפלסטיות הסינפטית, בסינפסה חושית מוטורית ניתן מחדש בתרבות, שם היטב מאופיין גירויים להפיק צורות פלסטיות כי יש מקבילות ישיר בהתנהגות של החיה ^2,3. באופן ספציפי, יישום של סרוטונין מייצרת חיזוק הסינפטי, בהתאם לפרוטוקול הבקשה, נמשך דקות (לטווח קצר סיוע), שעות (טווח ביניים סיוע) או ימים (לטווח ארוך סיוע). לעומת זאת, יישום FMRFamide את המשדר פפטיד מייצרת היחלשות דיכאון סינפטיים או, בהתאם לפרוטוקול הבקשה, יכול להימשך בין דקות יום (לטווח ארוך דיכאון). גודל גדול של נוירונים מאפשר הקלטה חזר אלקטרודה חדה של חוזק סינפטי על פני תקופות של ימים יחד עם microinjection של וקטורים הביטוי, siRNAs ותרכובות אחרות למקד מפלי איתות ספציפיים מולקולות ובכך לזהות את השלבים ביולוגי מולקולרית של התא העומדים בבסיס השינויים ביעילות סינפטית.

יתרון נוסף של מערכת התרבות Aplysia נובעת מהעובדה כי הנוירונים סינפסה להפגין-סגוליות בתרבות ^4,5. לפיכך, עצב סנסורי לא יוצרים סינפסות עם עצמם (autapses) או עם עצב סנסורי אחרים, ואין הם יוצרים סינפסות עם יעד שאינו הנוירונים המנוע מזוהה בתרבות. ורידים, אתרים של הקשר הסינפטי בין הנוירונים החושי והמוטורי, הם גדולים מספיק (2-7 מיקרון בקוטר) כדי לאפשר היווצרות הסינפסה (כמו גם שינויים במורפולוגיה הסינפטי) עם הנוירונים המנוע היעד להיחקר ברמה המיקרוסקופית אור.

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את כל שלב הכנת חושית מוטורית תרבויות נוירון, כולל הרדמה מבוגר ו Aplysia נעורים, לנתח הגרעינים שלהם, העיכול פרוטאז של הגרעינים, הסרת רקמת החיבור ידי microdissection, זיהוי של שני נוירונים החושי והמוטורי והסרה של כל סוג תא ידי microdissection, ציפוי של הנוירון המוטורי, תוספת של הנוירון מניפולציה חושית של neurite החושי כדי ליצור קשר עם תרבות מוטורית נוירון.

Protocol

אופן ההכנה (ראה סעיף פתרונות בסוף פרוטוקול להרכב של פתרונות)

1. הכינו מאכלים תרבות. סמל זכוכית היטב צלחת זכוכית התחתונה תרבות Mattek עם פולי-L-ליזין (שנעשו borate נתרן). הוסף מספיק כדי לכסות לחלוטין את הזכוכית היטב לצאת> 1 שעות (אפשר להשאיר למשך הלילה). ביסודיות להסיר את פולי-L-ליזין על ידי שטיפה במי ים מלאכותי (ASW) 4-5 פעמים. לאחר הסרת האחרון לשטוף, להוסיף 2 MLS של 50% L15 (בתוספת מלחים המכיל L-גלוטמין בריכוז הסופי של 2 מ"מ) / hemolymph 50%. זה חייב להיות בינוני תרבות בצלחת למשך שעה אחת לפחות לפני תאים ציפוי כך מעילים hemolymph את המנה.
2. נקו את כלי ומנות Sylgard עם אתנול, לשטוף אותם ביסודיות עם DDH ₂ 0 ולאחר מכן למקם אותם על שעה 1> תחת אור UV במנדף התרבות.
3. הכן אלקטרודות חדה microdissection של נוירונים. בעזרת חולץ microelectrode (למשל סאטר Flaming בראון P-97), למשוך פיפטה אלקטרודות זכוכית בקוטר 1.5 מ"מ החיצוניות, 0.86-1.12 מ"מ קוטר פנימי 100 מ"מ אורך (למשל AM קטלוג מערכת # 628000; מכשירים העולם Precision TW150-4, 1.55 / 1.12). שימוש בפרמטרים המייצרים אלקטרודה עם קצה קנס ארוך ומדובלל של עמידות גבוהה כך שאין צריכת נימי של נוזל כאשר הניח פתרון. הנוכחות של המניסקוס נוזל כלומר קצה האלקטרודה יפגע נוירון במהלך הבידוד. בישול אלקטרודה סאטר מספק הנחיות מעולה להקמת תוכניות אלקטרודה. אנו משתמשים בתיבת נימה, וכן צעד אחד למשוך לייצר אלקטרודות תרבות.
4. הכן ההרדמה (0.35M MgCl2), בינוני תרבות (L15 בתוספת מלחים hemolymph), והפתרון פרוטאז (1% פרוטאז סוג IX, Sigma, 1 יחידה / מ"ג, לריכוז סופי של 10 יחידות / מ"ל).
5. בעלי חיים: להשתמש 80-100 גרם Aplysia מבוגר לבידוד של נוירונים חושית של נוירונים LFS המנוע. השתמש לנוער 1-4 גרם Aplysia עבור בידוד של L7 הנוירונים המנוע. הסר את החיות בעדינות את הטנקים ים, ולשמור במי ים (בדלי כוס, או שקית ניילון) לא יותר מ 30 דקות לפני תחילת ההרדמה נוהל תרבות.

תרבות נוהל

א pleural culturing עצב סנסורי 8-10 גרם Aplysia

1. להרדים את החיות להסרת הגרעינים: להזריק 0.35 M MgCl ₂ לתוך מבוגר Aplysia (8-10 גרם) באמצעות מזרק 60 מ"ל עם מחט מד 18 1.5 אינץ. הזן את כף הרגל של החיה בזווית של כ 35 מעלות, לא להיכנס עמוק מדי. המטרה היא להזריק לתוך hemocoel של החיה בלי לחדור לאיברים הפנימיים. החיה צריכה להיות נפוחה מאוד רגוע.
2. מנתחים את הגרעינים: פין החיה הרדים על צלחת לנתח, עם סיכה (18 מד מחטים לעבוד גם עבור חיות 80-100 גר ') בראש ואת הזנב, ואת כף הרגל כלפי מעלה. החזיקו את כף הרגל עם מלקחיים שיניים לחתוך דרך העור ורקמות החיבור שבבסיס באורך מלא של כף הרגל (מן הראש אל הזנב) עם מספריים כירורגיות. הצמד את שני הצדדים כלפי מטה. בעזרת מלקחיים ומספריים, לחתוך את הוושט ולמשוך לצד לחשוף את הגרעינים. בעזרת מלקחיים ומספריים בסדר בסדר, לחתוך את הגרעינים דוושת פלאורלי (נוירונים חושיים הם בגרעיני פלאורלי). השאירו כמות נכבדה של עצב מאז זה מקל להצמיד את הגרעינים לאחר הטיפול פרוטאז.
3. העיכול פרוטאז של הגרעינים: מניחים את הגרעינים בפתרון פרוטאז (10 מ"ג / מ"ל ​​יחידה 1 / מ"ג L15) בערכת באינקובטור ב 34.5 מעלות צלזיוס (34-35 מעלות צלזיוס זה בסדר) עבור 2 שעות ו 15 דקות. משתמש קצה בסדר מלקחיים להעביר לשטוף את הגרעינים ב ASW שלוש פעמים. שמור את הגרעינים ב L15. שים לב כי זמן דגירה פרוטאז יכול להשתנות. המטרה היא לאפשר את רקמת החיבור להסירו בקלות. אם זה קשה מדי desheath הגרעינים מבלי לפגוע נוירונים, להגדיל את זמן הדגירה פרוטאז. אם זה קל מאוד desheath הגרעינים, לבין הנוירונים הם "רכים", לצמצם את זמן הדגירה פרוטאז.
4. Desheathing הגרעינים: העברת פרוטאז-מתעכל הגנגליונים 60 מ"מ או 35 מ"מ מאכל המכיל sylgard ו L15. צפייה במיקרוסקופ, סטריאו (עם תאורת הלוגן חיצוני), להסיר את הגרעינים ואת דוושת להצמיד את הגרעינים pleural בצלחת Sylgard בכיוון הנכון באמצעות סיכות חרקים מלקחיים בסדר. בעזרת מלקחיים בסדר מספריים Vanna כירורגית, בזהירות להרים את רקמת החיבור ופצע אותו לחשוף את אשכול חושית. היזהר שלא לגעת בכלל או נזק somata עצביים. הסר את כל רקמת החיבור עודפי המנה ולהוסיף בינוני יותר, כדי לוודא שלא לחשוף את הגנגליון desheathed לאוויר. אשכול חושית כוללת של כ 200 נוירונים מקובצים בקוטר 40-50 מיקרון. הגדר סיכה לעשות "פוסט" במרחק קצר מן ganglיון (בתחום של השקפה).
5. בידוד של נוירונים: שימוש ארוך, אלקטרודה חד תרבות זכוכית, לשלוף את הנוירונים זיהו אחד אחד על ידי נגיעה בגוף התא ממש ליד מרכז (לא לדקור) ו לאט ובהתמדה משיכת סומה תא, יחד עם האקסון, הרחק גנגליון. לטפוח בעדינות על הפין כדי לסלק את הנוירונים של האלקטרודה.
6. נוירונים ציפוי: השתמש pipetman (P10) להעביר נוירונים בודדים מצלחת לצלחת Sylgard תרבות. לפני העברת נוירונים, תרבות בינוני pipet אל קצה, כך קצה פלסטיק מצופה hemolymph (זה מונע את הנוירונים של דבק פלסטי). קח בזהירות רבה, כדי למנוע חשיפת נוירונים לכל בועות אוויר או כל כוחות קיצוניים (כלומר בעדינות לקחת את ולהסיר את הנוירונים מפני pipetteman). הפץ את הנוירונים באופן שווה על פני הצלחת. השתמש אלקטרודה חד בעדינות ישר התהליכים ברז אותם לתחתית.
7. דגירה: השאר את הכלים על הבמה מיקרוסקופ בטמפרטורת החדר למשך לא פחות מ 3 שעות. אנו שגרתי להשאיר אותם בין לילה. ודא כי בשלב מיקרוסקופ הוא מוטרד בתקופה זו. מכסים את הבמה עם רדיד אלומיניום על מנת להגן מפני אור. בעדינות ולהעביר אותם ל 18 מעלות צלזיוס חממה.
8. תרבויות צריך לדבוק המנה בתוך כ 3 שעות וצמיחה neurite חדש צריך להיות גלוי בתוך כ 6-12 שעות. הצמיחה של עצב סנסורי המבודדת מגיע לרמה של DIV 3 או 4. שים לב, עצב סנסורי מבודד איילה לא autapses טופס או סינפסות כימיות אחד עם השני, למרות שהם עושים חשמל טופס צמתים הפער.

ב הכנת חושי נוירון-מנוע נוירון cocultures

עצב סנסורי טופס סינפסה עם מנוע נוירונים היעד בתרבות. הנוירונים המנוע הנפוץ ביותר הם מנוע נוירונים LFS לבין הנוירון המוטורי L7, מן הגנגליון הבטן. המנוע נוירונים LFS מבודדים מבוגר (80-100 גרם) Aplysia, ויש כ 20 נוירונים LFS מנוע לכל הגנגליון הבטן. L7 המנוע נוירון מבודד נעורים (1-4 גרם) בעלי חיים, יש רק אחד L7 לכל הגרעינים הבטן. LFS הנוירונים המנוע הם 40-50 מיקרון בקוטר, משובצים בין עצב סנסורי LE קרוב לשורש העצב סיפון על פני השטח הגחון של בגרעיני בטן, מאופיינים כתם פיגמנט עדין חשוך כל סומה. L7 הנוירון המוטורי הוא 100-150 מיקרון בקוטר נמצא על פני השטח הגבי של הגנגליון, על קצה באמצע בצד שמאל של הגנגליון. אמנם זה חסכוני יותר להשתמש LFS הנוירונים המנוע, גודל גדול של הנוירון המוטורי L7 הוא יתרון עבור כמה ניסויים. המנוע L11 נוירון, גם על פני השטח שמאל הגנגליון הגבי של הבטן, הזנב ל L7, הוא nontarget הנוירון המוטורי ניתן להשתמש ביעילות כביקורת שבה נוירון חושי fasciculates אבל לא בצורה סינפסות כימיות.

1. להרדים את החיות להסרת הגרעינים. עבור נוירונים LFS המנוע, לעשות כפי שתואר על עצב סנסורי פלאורלי. עבור L7 הנוירונים המנוע, להזריק 0.35 M MgCl ₂ לתוך נעורים Aplysia (1-4 גרם) באמצעות מזרק 10 מ"ל עם מחט 21-מד.
2. מנתחים את הגרעינים בטן: פין החיה הרדים על צלחת לנתח כמתואר לעיל (באמצעות 21 מחטים מד לבעלי חיים נעורים). בעזרת מלקחיים ומספריים בסדר בסדר, לחתוך את הגרעינים הבטן.
3. העיכול פרוטאז של הגרעינים: זה נעשה כפי שתואר על עצב סנסורי פלאורלי, פרט לכך את הזמן העיכול מצטמצם 45 דקות 1 שעה עבור הגרעינים מן נעורים (1-4 גרם) בעלי חיים.
4. Desheathing הגרעינים: העברת פרוטאז-מתעכל הגרעינים אל צלחת 35 או 60 מ"מ המכיל sylgard ו L15. צפייה במיקרוסקופ, סטריאו (עם תאורת הלוגן חיצוני), בגרעיני מטה בצלחת Sylgard בכיוון הנכון באמצעות סיכות חרקים מלקחיים בסדר. בעזרת מלקחיים בסדר מספריים Vanna כירורגית, בזהירות להרים את רקמת החיבור ופצע אותו לחשוף את גופי התא העצבי. כדי לבודד את המנוע נוירונים LFS, הסיכה הגנגליון כך את פני השטח הגחון הוא פונה כלפי מעלה, עם מלקחיים למשוך את נדן רקמת החיבור בחזרה לחשוף את המחצית כולה הגנגליון המכיל את המנוע LFS נוירונים (מימין), desheath החלקים הנותרים של הגנגליון, להסיר את כל רקמת החיבור של המנה ולהוסיף L15 יותר. כדי לבודד את L7 או L11 הנוירון המוטורי, הסיכה הגנגליון כך את פני השטח הגבי פונה כלפי מעלה, עם מלקחיים למשוך את נדן רקמת החיבור בחזרה לחשוף את מחצית הגנגליון המכיל גם L7 L11 ו (שמאלה). היזהר שלא לגעת בכלל או נזק somata עצביים. המקום סיכה לעשות "פוסט" במרחק קצר מן הגנגליון (בתחום של השקפה).
5. בידוד של נוירונים: הסר נוירונים עם אלקטרודה חדה כפי שתואר על עצב סנסורי. הנוירונים הם LFS הבדלerentiated מן השכנות נוירונים LE חושית על בסיס של מקום קטן פיגמנט כהה somata שלהם. הנוירון L7 ניתן להבדיל בין תא עצב L11 L11 הראשון כי הוא הזנב ל L7, כי הגוף L11 התא מלבני יותר בכושר, בעוד L7 גוף התא הוא עגול ומשום האקסון L11 נוטה לתוך סניף קרוב פעמיים עד התא גוף.
6. נוירונים ציפוי: השתמש pipetman (P10) להעביר נוירונים בודדים מצלחת לצלחת Sylgard תרבות כפי שמתואר על עצב סנסורי.
7. זיווג עם עצב סנסורי: תן את הנוירונים המנוע לדבוק המנה תרבות עבור שעה לפחות 1. ואז להוסיף את עצב סנסורי מבודד עם pipetman, אספקת כל נוירון סנסורי בסמוך נוירון מנוע מצופה. בעזרת כוס חד האלקטרודה בזהירות ליישר את האקסון נוירון חושי, ומשדלת את הגוף תא חושית למיקום ליד הנוירון המוטורי, במרחק שווה או מעט פחות מ אורך האקסון לתא חושית. באמצעות אלקטרודת הזכוכית, לפתות את האקסון חושית לבוא במגע עם הנוירון המוטורי, מאוד בעדינות בעזרת הצד של האלקטרודה קוני סוף סוף יש את האקסון החושית פיזית לפנות האקסון של הנוירון המוטורי. לא להרים את המנה תרבות, אלא להחליק בעדינות את המנה לאורך הבמה מיקרוסקופ.
8. השאירו את הכלים על הבמה מיקרוסקופ בטמפרטורת החדר למשך לא פחות מ 3 שעות והעברה 18 ° C חממה כפי שתואר על עצב סנסורי.
9. תרבויות צריך לדבוק המנה בתוך כ 3 שעות וצמיחה neurite חדש צריך להיות גלוי בתוך כ 6-12 שעות. עצב סנסורי טופס glutamatergic סינפסות עם נוירונים המנוע מהר מאוד - ברגע התא הם חסיד מספיק כדי לבצע הקלטה אלקטרודה חדה (3-5 שעות), מעוררות פוטנציאל פוסט סינפטי ניתן להקליט. קישוריות Synaptic ממשיכה לגדול עד DIV 3, אז היא יציבה עד DIV7. הנוירונים צריך להראות תוצאה neurite לפרט במהלך 1-3 הימים הראשונים בתרבות.

ג הכנת Hemolymph

Hemolymph משמש כגורם גדילה בתרבות Aplysia (מקביל השימוש בסרום עגל עוברי יונקים בתרבית תאים). זה שנאספו (500 גרם, 1 ק"ג) בעלי חיים גדולים, הזמן הטוב ביותר לאסוף hemolymph (anecdotally) היא באביב (אמצע מרץ עד יוני). לעטוף את החיה underpad הפנויה, כך שרק חלק קטן של החיה היא חשופה, לנקות אותו חלק של העור עם אתנול, ולאחר מכן להחזיק אותו בשעה שאדם אחר משתמש סכין גילוח סטרילי לבצע חתך באזור חשוף. לסחוט את בעל החיים, כך מתיז hemolymph לתוך מבחנה נקייה, מוודא שזה לא קשר את העור מלוכלך של החיה. Hemolymph ממלא את hemocoel של בעל החיים (כלומר, החיה היא בעצם שק של hemolymph). Rewrap החיה פעם או פעמיים, לעשות חתך חדשים לסחוט קשה לאסוף hemolymph ככל האפשר (לאסוף בכוס חדשה, כך שאם הוא הופך להיות מזוהמים, את האוסף הראשון הוא עדיין שמיש). Hemolymph מבעל חיים אחד צריך להישמר בנפרד (כלומר, לא hemolymph בריכה מבעלי חיים שונים). ספין hemolymph XG ב 2000 ל 10 דקות להסיר את כדוריות הדם. Supernatant Aliquot ב 10 aliquots מ"ל, התווית על ידי בעלי חיים החנות ב -80 ° C. שים לב hemolymph המאוחסן -20 ° C ומהווה לזרז בינוני. Aliquot חדשה של hemolymph יש להשתמש בכל אמצעי תרבות זמן מוכן, ואת aliquot צריך להיות מופשר רק לקראת הכנת בינוני. אל refreeze לאחר ההפשרה.

Discussion

הכנה מוצלחת של Aplysia חושית מוטורית תרבויות יש עקומת למידה איטי במקצת, שכן הוא כרוך בפיתוח המוטוריקה העדינה קשורה microdissection ומניפולציה של נוירונים בודדים נצפים מבעד למיקרוסקופ, סטריאו. מניסיוננו, זה לוקח כ 1-3 שבועות של תרגול כדי להשיג בריא עצב סנסורי בודד בתרבות 1-3 שבועות נוספים כדי ללמוד כיצד זוג עצב סנסורי עם הנוירונים המנוע. אנו שגרתי להכין תרבויות ספסל Labconco נקי, אם כי אפשר להכין אותם על הספסל כל מעבדה או שולחן, כל עוד הוא מיקרוסקופ שאנן במהלך culturing (כל תנודות או הפרעות מכני למנוע את הנוירונים מפני הדבקות). מאז הנוירונים גדלים ים ב 18 ° C זיהומים, חיידקים ופטריות באופן משמעותי פחות נפוץ מאשר תרבית תאים של יונקים. המשתנה החשוב ביותר בהכנה תרבות היא איכות של החיה. Aplysia יכול לרכוש מיצרנים שאוספים אותם ישירות מן האוקיינוס ​​השקט (בלהיטות, או מרינוס), או מאוניברסיטת מיאמי מתקן חקלאות ימית, אשר אוספת זוגות רבייה מתוך השקט, ואז גדל Aplysia דרך מחזור אחד הרבייה. ככזה, בעלי החיים הם הטרוגניים מבחינה גנטית, וכן, במקרה של בעלי החיים שנאספו מן האוקיינוס, הם גם הטרוגנית מבחינת ההיסטוריה הסביבתית שלהם. יש כמה העונתיות לאיכות של נוירונים המתקבל Aplysia, עם התקופה הגרועה ביותר המתרחשים בדרך כלל באוגוסט, תקופה נוספת באיכות נמוכה יותר סביב דצמבר. עוד משתנה חשוב הוא hemolymph. רצוי לבחון קבוצות שונות של hemolymph על יכולתם לקדם צמיחה, ולהשתמש האצווה אותו hemolymph עבור קבוצה של ניסויים.

למרות הקושי של הכנת תרבויות Aplysia נוירונים, הם בעלי מספר יתרונות ייחודיים ובעלי ערך לחקור את היווצרות הסינפסה ואת הפלסטיות הסינפטית. הם יוצרים קשרים monosynaptic בתרבות שיכולה להיות במעקב על ידי הקלטה אלקטרודה חד לתקופות של ימים. פרוטוקולים מאופיין ובכן קיימים להפיק צורות פלסטיות כי יש הקבלות ברורות בהתנהגות של החיה. גירויים ניתן ליישם באמבטיה או תת של synapses6, 7 ו הגיאומטריה של תרבויות יכולים להיות מגוונים, כך שאף אחד נוירון הקשר חושית נוירון מנוע יחיד, או אחד נוירון סנסורי עם אנשי הקשר האקסון מפוצלת two הנוירונים המנוע, או שניים חושית נוירונים קשר הנוירון המוטורי בודדים. מסלולים ביולוגיים מולקולרית של התא יכולה להשתנות על ידי נוירונים בודדים microinjection של DNA, RNA, siRNA ו ריאגנטים אחרים, השפעות על המבנה ועל תפקוד עצבי, העברה סינפטית ו הפלסטיות ניתן לנטר עם רזולוציה של זמן ומרחב. NIH ו רחבה מכון מתקרבים להשלמת רצף של הגנום Aplysia, שאמור

Materials

Solutions needed for culture 0.35 M MgCl2, stored at room temperature, used for anesthesia. Poly-L-lysine solution, Sigma: P-1524, MW >300,000, made in 0.1M Sodium Borate pH8.2 to 0.5mg/ml solution. Vortex well and filter sterilize through a 0.22 μm filter, store it at 4C°. Do not freeze-thaw. L-15 Medium powder (Leibovitz) (Sigma: L4386) supplemented with the salts as below to make 1 liter L-15 powder 13.8g NaCl 15.4 g D-Glucose 6.24 g MgSO4•7H20 6.45g KCl 350 mg NaHCO3 170 mg MgCl2•6H2O 5.49 g CaCl2•2H2O 1.43g HEPES 3.53g Add ddH20 to 1 liter. The pH should be about 7.4-7.5, add 10ml of 100X Pen/Strep solution, and filter-sterilize through a 0.22 μm filter. Store at 4C0 for no longer than 1 month. Protease digestion solution: 1% Protease IX (1unit/mg) is made in L15 (supplemented with salts as above) or in ASW immediately before use, filter-sterilized through a 0.22 μm Millipore. 5mls should be enough for the ganglia from two animals (make sure the ganglia are completely immersed in protease solution). Sigma has reported that they will discontinue selling Protease IX. A substitute protease is: Dispase II (Roche Applied Science catalog # 04942078001). Culture medium. Immediately prior to preparing cultures, thaw a 10 ml aliquot of hemolymph and mix it with 10 mls of L15 (supplemented with salts as above) to make 20mls culture medium. Add 200 μl of 200mM L- Glutamine, mix well and use for preparing cultures. This medium should be prepared fresh each time cultures are made. Artificial Seawater can be made from Instant Ocean (Aquarium Systems, Mentor, OH) or as follows: 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 30 mM MgCl2(6H2O), 20 mM MgSO4, 10 mM CaCl2(2H2O), 10 mM HEPES, with pH adjusted to 7.4.