Preparazione del Aplysia Senso-motorio colture cellulari neuronali

Summary

Colture primarie di

Abstract

Il sistema nervoso del mollusco marino Aplysia californica è relativamente semplice, costituita da circa 20.000 neuroni. I neuroni sono di grandi dimensioni (fino a 1 mm di diametro) e identificabili, con dimensioni diverse, forme, posizioni e pigmentazioni, ed i corpi cellulari sono esposti esternamente in cinque gangli coppie distribuite in tutto il corpo dell'animale. Queste proprietà hanno permesso agli investigatori di delineare il circuito sottostante comportamenti specifici nell'animale ^1. Il collegamento monosinaptico tra i neuroni sensoriali e motori è una componente centrale della branchia-ritiro riflesso nell'animale, un semplice riflesso difensivo, in cui l'animale ritira la sua branchia in risposta alla stimolazione tattile del sifone. Questo riflesso subisce forme di apprendimento non associativo e associative, tra cui la sensibilizzazione, assuefazione e condizionamento classico. Di particolare beneficio per lo studio della plasticità sinaptica, il senso-motorie sinapsi possono essere ricostituita nella cultura, dove ben caratterizzato stimoli suscitare forme di plasticità che si correla direttamente nel comportamento dell'animale ^2,3. In particolare, l'applicazione di serotonina produce un potenziamento sinaptico che, a seconda del protocollo di applicazione, durata di minuti (a breve termine facilitazione), ore (medio termine facilitazione) o giorni (a lungo termine facilitazione). Al contrario, l'applicazione della FMRFamide trasmettitore peptide produce un indebolimento sinaptico o depressione che, a seconda del protocollo di applicazione, può durare da minuti a giorni (depressione a lungo termine). Le grandi dimensioni dei neuroni permette di ripetere la registrazione elettrodo affilato di forza sinaptica per periodi di giorni insieme con la microiniezione di vettori di espressione, siRNA e altri composti a target specifici cascate di segnalazione e le molecole e quindi identificare i passi molecolare e cellulare biologici che sono alla base delle modifiche di efficacia sinaptica.

Un ulteriore vantaggio del sistema cultura Aplysia deriva dal fatto che i neuroni dimostrare sinapsi-specificità nella cultura ^4,5. Così, i neuroni sensoriali non formano sinapsi con se stessi (autapses) o con altri neuroni sensoriali, né si formano sinapsi con i neuroni motori bersaglio individuato nella cultura. La varicosità, siti di contatto sinaptico tra neuroni sensoriali e motori, sono abbastanza grandi (2-7 micron di diametro) per permettere la formazione delle sinapsi (così come i cambiamenti nella morfologia sinaptica) con i neuroni motori obiettivo da studiare a livello microscopico luce.

In questo video, dimostriamo ogni fase della preparazione senso-motorio culture neurone, tra adulti e anestetizzare Aplysia giovanile, sezionare i loro gangli, la digestione dei gangli della proteasi, la rimozione del tessuto connettivo di microdissezione, l'identificazione di entrambi i neuroni motori e sensoriali e la rimozione di ogni tipo di cellula di microdissezione, placcatura del neurone motore, l'aggiunta del neurone sensoriale e la manipolazione dei neuriti sensoriali per formare il contatto con la cultura del motoneurone.

Protocol

Preparazione (vedi sezione soluzioni alla fine del protocollo per la composizione delle soluzioni)

1. Preparare i piatti della cultura. Cappotto di vetro e di Mattek con fondo di vetro piatto cultura con poli-L-lisina (made in borato di sodio). Aggiungi sufficiente a coprire completamente il vetro bene e lasciare per> 1 ora (può essere lasciato tutta la notte). Rimuovere accuratamente la poli-L-lisina dal risciacquo in acqua di mare artificiale (ASW) 4-5 volte. Dopo aver rimosso l'ultimo risciacquo, aggiungere 2 ml di 50% L15 (integrato con sali e contenente L-glutammina ad una concentrazione finale di 2 mm) / 50% emolinfa. Questo terreno di coltura deve essere piatto per almeno un'ora prima di cellule placcatura in modo che i cappotti emolinfa il piatto.
2. Pulire gli strumenti e piatti Sylgard con etanolo, li lavare a fondo con DDH ₂ 0 e poi li posto per> 1 ora sotto una luce UV nel cappuccio cultura.
3. Preparare elettrodi forte per microdissezione dei neuroni. Con un estrattore microelettrodo (ad esempio Sutter Flaming Brown P-97), tirare elettrodi pipetta di vetro da 1,5 mm di diametro esterno, 0,86-1,12 mm di diametro interno e 100 mm di lunghezza (per esempio AM catalogo di sistema # 628000; Strumenti di precisione mondiale TW150-4, 1.55 / 1.12). Utilizzare i parametri che producono un elettrodo con una punta lunga e wispy multa di tale resistenza che non ci sia l'assunzione capillare di liquido, quando sono immessi in soluzione. La presenza di un menisco liquido significa che la punta dell'elettrodo si danno dei neuroni durante l'isolamento. Il libro di cucina elettrodo Sutter fornisce le linee guida eccellente per la creazione di programmi di elettrodi. Usiamo un filamento scatola, e un one-step tirare elettrodi per generare cultura.
4. Preparare la soluzione anestetica (MgCl2 0,35 m), terreno di coltura (L15 integrato con sali e emolinfa), e la soluzione di proteasi (1% della proteasi tipo IX, Sigma, 1 unità / mg, per una concentrazione finale di 10 unità / ml).
5. Animali: utilizzare adulti 80-100 g Aplysia per l'isolamento dei neuroni sensoriali e di LFS motoneuroni. Usa giovanile 1-4 g Aplysia per l'isolamento di L7 motoneuroni. Togliere delicatamente gli animali dalle vasche di acqua di mare, e mantenere in acqua di mare (in coppa, secchio o sacchetto di plastica) per non più di 30 minuti prima di iniziare l'anestesia e la procedura di cultura.

Cultura procedura

A. coltura neuroni pleurico sensoriali provenienti da 80-100 g Aplysia

1. Anestetizzare gli animali per la rimozione dei gangli: Iniettare 0,35 M MgCl ₂ in adulti Aplysia (80-100 g) utilizzando una siringa da 60 ml con un calibro 18 ago 1,5 pollici. Inserisci il piede dell'animale con un angolo di circa 35 gradi, e non entrare troppo in profondità. L'obiettivo è quello di iniettare nel hemocoel dell'animale senza penetrare gli organi interni. L'animale dovrebbe diventare molto disteso e rilassato.
2. Sezionare i gangli: Pin anestetizzato l'animale su un piatto da dissezione, con un perno (18-gauge aghi funzionano bene per gli animali 80-100 g) in testa e la coda, e il piede verso l'alto. Tenere il piede con una pinza dentata e tagliare la pelle ed il tessuto connettivo sottostante l'intera lunghezza del piede (dalla testa alla coda) con un paio di forbici chirurgiche. Pin i due lati verso il basso. Utilizzando una pinza e forbici, tagliare l'esofago e tirare a lato per esporre i gangli. Utilizzando una pinza fine e forbici, tagliare i gangli pleurico pedale (i neuroni sensoriali sono nei gangli della pleura). Lascia una buona dose di coraggio poiché questo rende più facile da definire i gangli dopo il trattamento della proteasi.
3. Digestione della proteasi di gangli: Posizionare i gangli della proteasi in soluzione (10 mg / ml di 1 unità / mg in L15) in un incubatore a 34,5 ° C (34-35 ° C va bene), per 2 ore e 15min. Utilizzando la punta fine pinze per il trasferimento e lavare i gangli in ASW tre volte. Tenere i gangli in L15. Si noti che il tempo di incubazione della proteasi può variare. Lo scopo è quello di permettere il tessuto connettivo di essere facilmente rimossi. Se è troppo difficile desheath gangli senza danneggiare i neuroni, aumentare il tempo di incubazione della proteasi. Se è estremamente facile da desheath i gangli ei neuroni sono "soft", ridurre il tempo di incubazione della proteasi.
4. Desheathing i gangli: Trasferimento alla proteasi digerito gangli ad un 60 mm o 35 millimetri piatto contenente sylgard e L15. Guarda sotto uno stereo-microscopio (con illuminazione alogena esterna), rimuovere il pedale gangli e definire con precisione i gangli della pleura nel piatto Sylgard con l'orientamento corretto utilizzando perni di insetti e una pinza sottile. Con la pinza fine e un paio di forbici chirurgiche Vanna, sollevare con attenzione il tessuto connettivo e tagliarlo per esporre il cluster sensoriale. Fare attenzione a non toccare mai il somata o danni neuronali. Rimuovere qualsiasi tessuto connettivo in eccesso dal piatto e aggiungere altri media, facendo attenzione a non esporre il ganglio desheathed all'aria. Il cluster sensoriale è costituito da circa 200 neuroni cluster di 40-50 micron di diametro. Impostare un pin per fare un "post" a breve distanza dal Ganglione (entro il campo visivo).
5. Isolamento dei neuroni: Uso lungo, affilato cultura elettrodo di vetro, estrarre il identificato neuroni uno per uno toccando il corpo cellulare appena fuori del centro (non impalare) e tirando lentamente e costantemente il soma cellulare, insieme con l'assone, lontano dal ganglio. Battere delicatamente contro il perno per sloggiare i neuroni dall'elettrodo.
6. Neuroni placcatura: Utilizzare un Pipetman (P10) per trasferire i singoli neuroni dal piatto Sylgard ad un piatto della cultura. Prima di trasferire i, i neuroni terreno di coltura pipetta nella punta in modo che la punta di plastica è rivestita con emolinfa (questo impedisce ai neuroni di attaccarsi alla plastica). Fare molta attenzione per evitare di esporre i neuroni di eventuali bolle d'aria o ad uno qualsiasi forze estreme (cioè molto gentilmente prendere e togliere i neuroni dalla pipetteman). Distribuire i neuroni in modo uniforme in tutto il piatto. Utilizzare un elettrodo appuntito per delicatezza direttamente i processi e li tocca fino in fondo.
7. Incubazione: Lasciare i piatti sul palco microscopio a temperatura ambiente per non meno di 3 ore. Noi abitualmente li lasciare per una notte. Assicurarsi che la fase di microscopio è imperturbabile durante questo periodo. Coprire il palco con un foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce. Delicatamente il trasferimento ad un 18 ° C incubatore.
8. Le culture dovrebbero aderire al piatto in circa 3 ore e la crescita dei neuriti nuovo dovrebbe essere visibile in circa ore 6-12. La crescita dei neuroni sensoriali isolate raggiunge un plateau di DIV 3 o 4. Si noti che isolato i neuroni sensoriali non doe autapses forma o sinapsi chimica tra di loro, anche se lo fanno giunzioni gap elettrico forma.

B. Preparazione del neurone sensitivo-motoria co-colture neuroni

Neuroni sensoriali forma sinapsi con i neuroni bersaglio motore in cultura. I neuroni motori più comunemente usati sono i motoneuroni LFS e le L7 motoneurone, dal ganglio addominale. I neuroni motori IFL sono isolati da adulti (80-100 g) Aplysia, e ci sono circa 20 i neuroni motori IFL al ganglio addominale. Il motore L7 neurone è isolato dal giovanile (1-4 g) gli animali, e c'è solo un L7 per gangli addominali. LFS motoneuroni sono 40-50 micron di diametro, si alternano tra i neuroni sensoriali LE vicino alla radice del nervo sifone sulla superficie ventrale dei gangli addominali, e sono caratterizzati da un punto sottile pigmento scuro in ogni soma. Il motore L7 neurone è di 100-150 micron di diametro ed è presente sulla superficie dorsale del ganglio, ai margini centro del lato sinistro del ganglio. Mentre è più economico da usare LFS motoneuroni, le grandi dimensioni del motore L7 neurone è vantaggioso per alcuni esperimenti. La L11 del motoneurone, anche sulla superficie dorsale sinistro del ganglio addominale, caudale a L7, è un neurone motore non bersaglio e può essere efficacemente utilizzato come controllo con cui il neurone sensoriale fasciculates ma non forma sinapsi chimiche.

1. Anestetizzare gli animali per la rimozione dei gangli. Per LFS motoneuroni, fare come descritto per pleurico neuroni sensoriali. Per L7 motoneuroni, iniettare 0,35 M MgCl ₂ in Aplysia giovanile (1-4 g) con una siringa da 10 ml con un ago da 21 gauge.
2. Sezionare i gangli addominali: Pin anestetizzato l'animale su un piatto sezionare come descritto in precedenza (con 21 aghi calibro di animali giovani). Utilizzando una pinza fine e forbici, tagliare i gangli addominali.
3. Digestione della proteasi di gangli: Questo è fatto come descritto per pleurico neuroni sensoriali, tranne che il tempo di digestione è ridotto a 1 ora e 45 min per gangli dal giovanile (1-4 g) gli animali.
4. Desheathing i gangli: Trasferimento alla proteasi digerito gangli di un piatto di 35 o 60 mm contenente sylgard e L15. Guarda sotto uno stereo-microscopio (con illuminazione alogena esterna), nei gangli giù nel piatto Sylgard con l'orientamento corretto utilizzando perni di insetti e una pinza sottile. Con la pinza fine e un paio di forbici chirurgiche Vanna, sollevare con attenzione il tessuto connettivo e tagliarla a esporre i corpi cellulari neuronali. Per isolare i neuroni motori IFL, perno del ganglio modo che la superficie ventrale è rivolta verso l'alto, e con una pinza tirare la guaina di tessuto connettivo per esporre tutta la metà del ganglio che contiene il motore IFL neuroni (a destra), il desheath parti rimanenti del ganglio, rimuovere qualsiasi tessuto connettivo dal piatto e aggiungere altri L15. Per isolare le L7 L11 o motoneurone, perno del ganglio modo che la superficie dorsale è rivolta verso l'alto, e con una pinza tirare la guaina di tessuto connettivo per esporre la metà del ganglio che contiene sia L7 e L11 (a sinistra). Fare attenzione a non toccare mai il somata o danni neuronali. Posizionare un pin per fare un "post" a breve distanza dal ganglio (entro il campo visivo).
5. Isolamento dei neuroni: rimuovere i neuroni con un elettrodo affilato come descritto per i neuroni sensoriali. I neuroni sono LFS differentiated dalla vicina LE neuroni sensoriali sulla base di una piccola macchia pigmento scuro nel loro somata. Il L7 neurone può essere differenziato dal neurone L11 in primo luogo perché la L11 è caudale di L7, L11 perché il corpo cellulare è più di forma oblunga, mentre la L7 corpo cellulare è più rotondo e perché l'assone L11 tende ad espandersi in due vicino alla cella corpo.
6. Neuroni placcatura: Utilizzare un Pipetman (P10) per trasferire i singoli neuroni dal piatto Sylgard ad un piatto della cultura come descritto per i neuroni sensoriali.
7. Abbinamento con i neuroni sensoriali: Lasciate che i neuroni motori aderire al piatto cultura per almeno 1 ora. Quindi aggiungere i neuroni sensoriali isolati con una Pipetman, offrendo ogni neurone sensoriale adiacente ad un neurone motore placcato. Utilizzando un elettrodo di vetro tagliente attentamente raddrizzare l'assone dei neuroni sensoriali, coassiale e il corpo delle cellule sensoriali ad una posizione vicino al neurone motore, ad una distanza uguale o leggermente inferiore alla lunghezza degli assoni delle cellule sensoriali. Utilizzando l'elettrodo di vetro, coassiale l'assone sensoriali per entrare in contatto con il neurone motore, molto delicatamente con il lato della elettrodo affusolato di avere finalmente l'assone sensoriale fisicamente contattare l'assone del neurone motore. Non sollevare il piatto di cultura, ma piuttosto dolcemente scivolare il piatto lungo il palco microscopio.
8. Lasciare i piatti sul palco microscopio a temperatura ambiente per non meno di 3 ore e il trasferimento ad un 18 ° C incubatore come descritto per i neuroni sensoriali.
9. Le culture dovrebbero aderire al piatto in circa 3 ore e la crescita dei neuriti nuovo dovrebbe essere visibile in circa ore 6-12. Neuroni sensoriali formano sinapsi glutammatergica con i neuroni motori molto rapidamente - non appena le cellule aderenti sono sufficienti per effettuare la registrazione tagliente elettrodo (3-5 ore), un post-sinaptica eccitatoria potenziale può essere registrato. Connettività sinaptica continua ad aumentare fino DIV 3, ed è poi stabile fino DIV7. I neuroni dovrebbe mostrare escrescenza elaborare dei neuriti durante i primi 1-3 giorni di coltura.

Preparazione C. emolinfa

Emolinfa viene utilizzato come un fattore di crescita nella cultura Aplysia (analogo per l'utilizzo del siero di vitello fetale in colture cellulari di mammifero). Si sono raccolti da grande (500 g-1 kg) gli animali, e il momento migliore per raccogliere emolinfa (aneddoticamente) è durante la primavera (metà marzo a giugno). Fasciare l'animale in un underpad usa e getta in modo che solo una piccola parte dell'animale è esposto, pulita quella porzione di pelle con l'etanolo, e poi tenerlo premuto mentre un'altra persona usa una lama di rasoio sterile di fare un'incisione sulla superficie esposta. Spremere l'animale in modo che l'emolinfa schizza in un bicchiere pulito, facendo attenzione che non si sporca contatto con la pelle dell'animale. L'emolinfa riempie la hemocoel dell'animale (cioè, l'animale è fondamentalmente un sacco di emolinfa). Rewrap l'animale una o due volte, fare una nuova incisione e spremere difficile raccogliere emolinfa il più possibile (raccogliere in un bicchiere nuovo in modo che se diventa contaminati, la prima collezione è ancora utilizzabile). Emolinfa di ciascun animale deve essere tenuto separatamente (cioè non emolinfa piscina da diversi animali). Gira la emolinfa a 2000 xg per 10 minuti per rimuovere le cellule del sangue. Aliquota del surnatante in aliquote da 10 ml, etichetta con animali e conservare a -80 ° C. Si noti che emolinfa conservati a -20 ° C costituisce un precipitato in mezzo. Una nuova aliquota di emolinfa deve essere utilizzato ogni volta terreno di coltura è preparato, e l'aliquota dovrebbe essere scongelati solo prima di preparare il mezzo. Non ricongelare dopo lo scongelamento.

Discussion

La preparazione di successo di Aplysia senso-motorie culture ha una curva di apprendimento un po 'lento, in quanto comporta lo sviluppo di abilità motorie associate a microdissezione e la manipolazione di singoli neuroni visto attraverso uno stereo-microscopio. Nella nostra esperienza, ci vogliono circa 1-3 settimane di pratica per ottenere sano neuroni sensoriali isolate nella cultura e settimane supplementari 1-3 per imparare a coppia neuroni sensoriali con i neuroni motori. Noi abitualmente preparare le culture in un banco Labconco pulito, anche se è possibile prepararli su qualsiasi banco di laboratorio o una scrivania, a condizione che il microscopio è imperturbabile durante la coltura (vibrazioni o disturbi meccanici evitare che i neuroni di aderire). Dal momento che i neuroni crescono in acqua di mare a 18 ° C contaminazioni, batteriche e fungine sono molto meno comuni che in colture cellulari di mammifero. La variabile più importante in preparazione della cultura è la qualità degli animali. Aplysia possono essere acquistati dai fornitori che li raccogliere direttamente presso l'Oceano Pacifico (Alacrity, or Marino), o da l'Università di Miami impianto di maricoltura, che raccoglie coppie nidificanti dal Pacifico e poi cresce Aplysia attraverso un ciclo di allevamento. Come tali, gli animali sono geneticamente eterogenea, e, nel caso degli animali raccolti dal mare, ma sono anche eterogenei in termini di storia ambientale. Vi è una certa stagionalità per la qualità dei neuroni ottenuti da Aplysia, con il peggior periodo di solito si verificano in agosto, e un altro periodo di qualità inferiore intorno a dicembre. Un'altra variabile importante è la emolinfa. E 'saggio per testare diversi lotti di emolinfa per la loro crescita, la promozione della capacità, e di utilizzare lo stesso lotto di emolinfa per una serie di esperimenti.

Nonostante la difficoltà di preparare culture Aplysia neuroni, possiedono una serie di vantaggi unici e preziosi per lo studio della formazione di sinapsi e la plasticità sinaptica. Essi formano connessioni monosinaptico nella cultura che possono essere monitorati registrando elettrodo affilato per periodi di giorni. Esistono protocolli ben caratterizzati che provocano forme di plasticità che si sono chiari paralleli nel comportamento dell'animale. Gli stimoli possono essere applicati al bagno o di sottoinsiemi di synapses6, 7, e la geometria delle culture può essere variata in modo che uno dei contatti neurone sensitivo un neurone motore singolo, o un neurone sensoriale con un assone contatti sdoppiati due neuroni motori, sensoriali o due neuroni contattare un singolo neurone motore. Vie biologiche molecolari e cellulari può essere alterata in singoli neuroni da microiniezione di DNA, RNA, siRNA e altri reagenti, e gli effetti sulla struttura e la funzione neuronale, trasmissione sinaptica e la plasticità può essere monitorato con risoluzione temporale e spaziale. Il NIH e Broad Institute sono in fase di completamento del sequenziamento del genoma Aplysia, che dovrebbe

Materials

Solutions needed for culture 0.35 M MgCl2, stored at room temperature, used for anesthesia. Poly-L-lysine solution, Sigma: P-1524, MW >300,000, made in 0.1M Sodium Borate pH8.2 to 0.5mg/ml solution. Vortex well and filter sterilize through a 0.22 μm filter, store it at 4C°. Do not freeze-thaw. L-15 Medium powder (Leibovitz) (Sigma: L4386) supplemented with the salts as below to make 1 liter L-15 powder 13.8g NaCl 15.4 g D-Glucose 6.24 g MgSO4•7H20 6.45g KCl 350 mg NaHCO3 170 mg MgCl2•6H2O 5.49 g CaCl2•2H2O 1.43g HEPES 3.53g Add ddH20 to 1 liter. The pH should be about 7.4-7.5, add 10ml of 100X Pen/Strep solution, and filter-sterilize through a 0.22 μm filter. Store at 4C0 for no longer than 1 month. Protease digestion solution: 1% Protease IX (1unit/mg) is made in L15 (supplemented with salts as above) or in ASW immediately before use, filter-sterilized through a 0.22 μm Millipore. 5mls should be enough for the ganglia from two animals (make sure the ganglia are completely immersed in protease solution). Sigma has reported that they will discontinue selling Protease IX. A substitute protease is: Dispase II (Roche Applied Science catalog # 04942078001). Culture medium. Immediately prior to preparing cultures, thaw a 10 ml aliquot of hemolymph and mix it with 10 mls of L15 (supplemented with salts as above) to make 20mls culture medium. Add 200 μl of 200mM L- Glutamine, mix well and use for preparing cultures. This medium should be prepared fresh each time cultures are made. Artificial Seawater can be made from Instant Ocean (Aquarium Systems, Mentor, OH) or as follows: 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 30 mM MgCl2(6H2O), 20 mM MgSO4, 10 mM CaCl2(2H2O), 10 mM HEPES, with pH adjusted to 7.4.