の準備アメフラシ感覚運動神経細胞の培養

Summary

の初代培養

Abstract

海洋軟体動物アメフラシカリの神経系は、約20,000のニューロンで構成される、比較的簡単です。ニューロンは、異なるサイズ、形状、位置や色素沈着で、大（直径最大1 mm）と識別可能であり、細胞体は、外部から動物の体全体に分散fiveペアの神経節に公開されています。これらのプロパティは、動物¹の特定の行動の根底に回路を描くために捜査官を許可している。感覚および運動ニューロン間のシナプス接続は、動物の鰓の離脱反射、動物は、サイフォンの触覚刺激に応答し、その鰓を撤回したシンプルな防衛反射の中心的なコンポーネントです。この反射は、感作、馴化と古典的条件を含む非結合と連合学習の形態を、受ける。シナプス可塑性の研究に特に有益である、感覚運動シナプスが十分に特徴付けられた刺激は動物^2,3の動作に直接の相関を持っている可塑性の形態を引き出す場所、文化の中で再構成することができる。具体的には、セロトニンのアプリケーションは、アプリケーションのプロトコルに応じて、シナプスの強化を生成する、（長期的なファシリテーション）分（短期促進）、時間（中間的なファシリテーション）または数日間続きます。対照的に、ペプチドトランスミッタFMRFamideのアプリケーションは、アプリケーションのプロトコルに応じて、シナプスの弱体化やうつ病を生成、日（長期不況）に数分から続くことができる。ニューロンの大サイズが特定のシグナル伝達カスケードと分子を標的とし、それによって変化の根底にある分子細胞生物学的なステップを識別するための発現ベクター、siRNAおよび他の化合物のマイクロインジェクションと一緒に日の期間にわたってシナプス強度の繰り返し鋭い電極の録音が可能シナプス伝達効率インチ

アメフラシの培養系のさらなる利点は、神経細胞が培養^4,5でシナプス-特異性を示すという事実に由来しています。このように、感覚ニューロンは、それ自体（autapses）でまたは他の感覚ニューロンとシナプスを形成しない、またかれらは、培養中の非標的同定された運動ニューロンとシナプスを形成してください。 varicosities、感覚および運動ニューロン間のシナプス接触部位は、光学顕微鏡レベルで検討する対象の運動ニューロンとのシナプス形成を（だけでなく、シナプスの形態変化）を許可する（直径2-6：ミクロン）に十分な大きさです。

このビデオでは、我々は彼らの神経節、神経節のプロテアーゼ消化、顕微解剖により結合組織の除去、感覚および運動ニューロンと除去の両方の識別を解剖、麻酔、成人および若年アメフラシを含む感覚運動ニューロンの培養を、準備の各ステップを示す顕微解剖によって各細胞型の、運動ニューロン、培養運動ニューロンとの接触を形成するために感覚神経の感覚神経や操作の追加のメッキ。

Protocol

準備（ソリューションの構成のためのプロトコルの終了時にソリューションを参照してください）

1. 培養皿を準備します。ポリ- L -リジン（ホウ酸ナトリウムで作られた）とマテックガラス底培養皿のよくコートガラス。完全によくガラスをカバーし、> 1時間（一晩放置することができます）に向けて出発するのに十分な追加。徹底的に人工海水（ASW）4-5回ですすぐことにより、ポリ- L -リジンを削除します。すすぎの最後を削除した後、2 50パーセントL15のMLS（塩を補充および2mMの最終濃度でL -グルタミンを含む）/ 50％の血リンパを追加。この培地は、プレーティング前の細胞に少なくとも1時間のための皿の中でその血リンパのコートディッシュことでなければなりません。
2. エタノールとツールとSylgardの皿をきれいに、DDH ₂ 0で、それらを徹底的に洗い、その後、文化のフードにUV光の下で> 1時間のためにそれらを置きます。
3. 神経細胞のマイクロダイセクションのための鋭い電極を準備します。 微小電極プラー（例えばブラウンP - 97をフレーミングサッタが）、1.5ミリメートル外径、0.86〜1.12ミリメートル内径と長さ100 mmのガラスピペット電極を引くの使用（例えば、システムカタログ＃628000午前、世界の精密機器TW150 - 4、1.55 / 1.12）。溶液中に配置された流体のない毛細管摂取がないことをそのような高抵抗の長いとうっすらと細かいチップを用いて電極を製造パラメータを使用してください。流体メニスカスの存在は、電極の先端が分離中にニューロンに損​​傷を与えることを意味します。サター電極の料理本は、電極のプログラムを設定するための優れたガイドラインを提供します。我々は、ボックスのフィラメントを使用し、ワンステップでは、文化の電極を生成するために引き出します。
4. 麻酔液（0.35M MgCl 2を）、培養培地（塩類および血リンパを添加したL15）、およびプロテアーゼ溶液を（1％プロテアーゼIX型、シグマ、1単位/ mg、10単位/ mlの最終濃度まで）の準備。
5. 動物：感覚ニューロンのとLFS運動ニューロンの単離のために成人の80〜100グラムアメフラシを使用。 L7運動ニューロンの単離のために幼若1〜4グラムアメフラシを使用してください。海水タンクから静かに動物を削除し、麻酔と文化の手順を開始する前に30分以上のために海水（ビーカー、バケツやビニール袋）に維持する。

文化手順

80〜100グラムアメフラシからA.の培養胸膜感覚ニューロン

1. 神経節の除去のために動物を麻酔：18ゲージ1.5インチの針と60mlのシリンジを使用して、成人アメフラシ （80〜100グラム）に0.35MのMgCl _2を注入。約35度の角度で動物の足を入力し、あまりにも深く入力しないでください。目標は、内臓を貫通することなく、動物の血体腔に注入することです。動物は非常に膨張したとリラックスになるはず。
2. 神経を解剖：頭部と尾部でのピン（18ゲージの針が80〜100グラムの動物のために働く）、と上に向けて足で、解剖皿に麻酔動物をピン。歯鉗子で足をホールドし、外科はさみで皮膚と下層の結合組織の足の全長（先頭から末尾）カットスルー。両側を突き止める。鉗子やハサミを使用して、食道を切断し、神経節を露出する側に引き出します。細かい鉗子と細かいハサミを使用して、胸膜ペダル神経節を（感覚ニューロンは、側神経節にある）切り取ります。これはそれが簡単にプロテアーゼ処理後の神経節を突き止めることができなくしていますので、神経のかなりの量を残す。
3. 神経節のプロテアーゼ消化：34.5でのインキュベーターセット内のプレースプロテアーゼ溶液の神経節（L15で1単位/ mgの10 mg / mlの）℃（34〜35℃で大丈夫です）2時間と15分のため。 ASW三回に神経を転送し、洗浄するために微細な先端の鉗子を使用する。 L15で神経をしてください。プロテアーゼのインキュベーション時間が異なることに注意してください。目的は、結合組織は簡単に削除できるようにすることです。それが神経細胞を損傷することなくdesheath核をするのが困難である場合、プロテアーゼのインキュベーション時間を増やします。それは、神経節desheathに非常に簡単で、神経細胞は"ソフト、"プロテアーゼのインキュベーション時間を短縮している。場合
4. 神経節をDesheathing：sylgardとL15を含む60 mmまたは35mmディッシュにプロテアーゼ消化神経を転送。ステレオ顕微鏡（外部ハロゲン照明付）での表示、削除する足神経節と虫ピンと微細な鉗子を使用して正しい向きにSylgard皿の側神経節を突き止める。細かい鉗子とヴァンナ外科ハサミで、慎重に結合組織を持ち上げて、感覚クラスタを公開するために、それをカット。これまでに触れたり、神経細胞のsomaの複数形を傷つけないように注意してください。皿から余分な結合組織を取り出して、空気にdesheathed神経節を公開することはないことに注意しながら、より多くの培地を加える。感覚クラスタは40〜50ミクロンの直径の約200クラスタ化されたニューロンで構成されています。 ganglから短い距離で"ポスト"を作るためにピンを設定します。イオン（視野内）。
5. 神経細胞の単離：長い、鋭いガラス文化の電極を使用するには、離れてから、軸索と一緒に、（自由に動けなくするしない）で、市内中心部から細胞体に触れるとゆっくりと着実に細胞体を引っ張り、いずれかによって識別されるニューロンを引き抜く神経節。ゆっくりと電極から神経細胞を取り除くために、ピンに対してタップ。
6. メッキのニューロンは：培養皿にSylgard皿から個々のニューロンを転送するpipetman（P10）を使用してください。プラスチック製の先端が血リンパでコー​​ティングされるように、先端に神経細胞、ピペットの培養液を転送する前に（これは、プラスチックに付着するから神経細胞を防ぎます）。し、気泡や、極端な力（すなわち、非常に穏やかに取るとpipettemanから神経細胞を取り除く）にニューロンを公開しないように細心の注意が払われています。皿全体に均等にニューロンを配布する。ストレートプロセス優しくする鋭い電極を使用し、底にそれらをタップします。
7. インキュベーション：3つ以上時間室温で顕微鏡のステージ上で料理を残す。我々は日常的にそれらを一晩おきます。顕微鏡のステージがこの期間中に摂動されていることを確認します。光から保護するために、アルミホイルでステージをカバー。ゆっくりと18℃インキュベーターに移す。
8. 文化は、約3時間以内にシャーレに付着する必要があり、新たな神経突起の成長は、約6-12時間以内に表示されるはずです。孤立した感覚ニューロンの成長は、DIV 3または4でプラトーに達する。彼らは形電気ギャップ結合を行うが、互いに孤立した感覚ニューロン雌ではないフォームのautapsesまたは化学シナプスことに注意してください。

感覚ニューロン、運動ニューロン共培養のB.の準備

感覚ニューロンは、培養中のターゲットの運動ニューロンとシナプスを形成する。最も一般的に使用される運動ニューロンは、腹部神経節から、LFSの運動ニューロンとL7運動ニューロンです。 LFS運動ニューロンは成人（80〜100グラム） アメフラシから単離し、腹部神経節あたり約20 LFSの運動ニューロンが存在している。 L7運動ニューロンは、幼若（1-4 g）の動物から単離し、そして腹部神経節ごとに1つだけL7が存在しています。 LFS運動ニューロンは、直径40〜50ミクロンである腹部神経節の腹側表面上にサイフォンの神経の根に近いLE感覚ニューロンの間に散らばっている、とそれぞれの細胞体に微妙な濃い顔料のスポットによって特徴付けられる。 L7運動ニューロンは、直径100から150ミクロンであり、神経節の左側の中央の端に、神経節の背側表面上に存在しています。それはLFS運動ニューロンを使用するより経済的である一方、L7運動ニューロンの大きなサイズはいくつかの実験のために有利である。 L7の尾も腹部神経節の背側の左表面上L11運動ニューロンは、、、非標的運動ニューロンであり、効果的に感覚神経がfasciculates先のコントロールとして使用することができますが、化学シナプスを形成しない。

1. 神経節の除去のために動物を麻酔。 LFS運動ニューロンの場合は、のような胸膜感覚ニューロンについて記載はありません。 L7運動ニューロンの場合は、21ゲージ針で10mlの注射器を用いて幼若アメフラシ （1-4 G）に0.35MのMgCl _2を注入する。
2. （幼若動物のために21ゲージの針を使用して）上記のような解剖皿に麻酔動物をピン：腹部神経節を細かく分析。細かい鉗子と細かいハサミを用いて、腹部神経節を切り取る。
3. 神経節のプロテアーゼ消化は：これは、消化時間が幼若（1-4 g）の動物から神経節のための1時間45分に短縮されることを除いて、胸膜の感覚ニューロンで説明したように行われます。
4. 神経節をDesheathing：sylgardとL15を含む、35または60 mmディッシュにプロテアーゼ消化神経を転送。昆虫ピンと微細な鉗子を使用して正しい向きにSylgard皿に神経節に、ステレオ顕微鏡（外部ハロゲン照明付）の下に​​ダウンの表示。細かい鉗子とヴァンナ外科ハサミで、慎重に結合組織を持ち上げ、それが神経細胞体を公開するカット。 LFS運動ニューロンを分離するには、腹面が上を向くように神経節を固定し、ピンセットでLFS運動ニューロン（右手に）、desheath含む神経節の全体の半分を公開するために戻って結合組織鞘を引く神経節の残りの部分は、皿から任意の結合組織を除去し、より多くのL15を追加。 L7またはL11運動ニューロンを単離するために、背面が上を向くように神経節を固定し、ピンセットでL7とL11（左手に）の両方を含む神経節の半分を公開するために戻って結合組織鞘を引き出します。これまでに触れたり、神経細胞のsomaの複数形を傷つけないように注意してください。神経節から短い距離（視野内）で"ポスト"を作るためにピンを置きます。
5. 神経細胞の分離：のような感覚ニューロンで説明した鋭い電極とニューロンを削除します。 LFSのニューロンは、diffです彼らのsomaの複数形の小さな黒い色素スポットに基づいて隣接するLE感覚ニューロンからerentiated。 L11の軸索は細胞には2つの密接に分岐する傾向があるので、L7細胞体が丸くなるとしながらL11細胞体の形状がより多くの長方形であるため、L11は、L7の尾側なので、L7ニューロンは、最初のL11ニューロンと区別することができますボディ。
6. メッキのニューロンは：感覚神経のために説明されているように培養皿にSylgard皿から個々のニューロンを転送するpipetman（P10）を使用してください。
7. 感覚ニューロンとペアリング：運動ニューロンは、少なくとも1時間培養皿に付着してみましょう。その後、分離された感覚ニューロンは、メッキ運動ニューロンに隣接する各感覚神経を提供し、pipetmanを追加。鋭いガラス電極を使用すると、慎重に等しいか、感覚細胞の軸索の長さよりわずかに小さい距離で、感覚神経の軸索をまっすぐにし、運動ニューロンの隣に位置する感覚細胞の本体を同軸。ガラス電極を使用して、非常に静かに最終的に物理的に運動ニューロンの軸索に連絡して感覚神経軸索を持つようにテーパ状電極の側面を使用して、運動ニューロンと接触する感覚軸索を同軸。培養皿を持ち上げるのではなく、静かに顕微鏡のステージに沿って料理を滑空しないでください。
8. として感覚ニューロンで説明した3つ以上時間と18℃のインキュベーターへの転送のために室温で顕微鏡のステージ上で料理を残す。
9. 文化は、約3時間以内にシャーレに付着する必要があり、新たな神経突起の成長は、約6-12時間以内に表示されるはずです。感覚ニューロンは、非常に短時間で運動ニューロンをグルタミン酸シナプスを形成する - など、すぐに細胞が、興奮性後シナプス電位シャープ電極記録（3-5時間）を実行するための十分な接着なので記録することができます。シナプス接続はDIV 3日まで増加し続け、そしてDIV7まで、安定しています。神経細胞は、培養の最初の1〜3日中に精巧な神経突起伸長を示す必要があります。

血リンパのC.の準備

血リンパは、 アメフラシの培養中の成長因子（哺乳動物細胞培養におけるウシ胎児血清の使用に類似）として使用されます。それは大（500 G - 1 kg）の動物から採取し、（逸話的に）血リンパを収集するのに最適な時間帯は、春（6月中旬〜3月）中になっています。動物のごく一部が露出されるように、使い捨てunderpadで動物をおくるみ、エタノールで皮膚のその部分を清掃して別の人が露出面積の切開を行うために無菌のカミソリの刃を使用している間それを保持する。きれいなビーカーに血リンパのホヤが、それは動物の汚れた皮膚に接触しないことを確認するように動物を絞る。血リンパは、動物の血体腔を埋める（すなわち、動物は基本的に血リンパ嚢です）。 （それが汚れた場合は、最初のコレクションはまだ使用可能であるように、新しいビーカーに集める）新たな切開を行い、可能な限り多くの血リンパを集めるのは難しい絞る、一度か二度、動物をRewrap。各動物から体液が（すなわち、異なる動物からプール血リンパをしない）別々に保つ必要があります。血液細胞を除去するために10分間2,000 xgで血リンパを回転させる。 10mlのアリコートに分注し清、-80℃で動物と店舗別ラベル℃の-20℃で保存した血リンパは、培地中に沈殿物を形成することに注意してください。血リンパの新しいアリコートたびに培養液を調製し使用する必要があります、そしてアリコート培地を準備する直前に解凍してください。解凍後の再凍結はしないでください。

Discussion

それは、ステレオ顕微鏡を通して見た個々の神経細胞のマイクロダイセクションと操作に関連付けられている細かい運動能力の開発を含んでいるので、 アメフラシ感覚運動文化の成功の準備は、やや遅い学習曲線を持っています。我々の経験では、それは運動ニューロンと感覚ニューロンをペアリングする方法については、文化と追加の1〜3週間で健康な分離感覚神経を得るために練習の約1-3週間かかります。それは限り顕微鏡など、あらゆる実験台や机の上にそれらを準備することは可能ですが我々は日常的に、Labconcoクリーンベンチでの文化を準備する（任意の振動または機械的な障害が付着するのニューロンを防ぐ）培養中にかき乱されないさ。神経細胞は18 ° Cで海水で成長するので、細菌および真菌汚染は大幅に哺乳動物細胞の培養に比べて一般的な未満です。文化の準備で最も重要な変数は、動物の品質です。 アメフラシはどちら太平洋（アラク、またはマリナス）、または繁殖のペアを収集するマイアミの養殖施設、大学から直接収集するベンダーから購入することができます太平洋から、その後に1つの繁殖サイクルを通してアメフラシを育てます 。このように、動物は、遺伝的に異質であり、そして、海から採取された動物の場合には、彼らは彼らの環境履歴の面でも不均一です。最悪の時期は通常月に発生するとアメフラシから得られた神経細胞の品質にはいくつかの季節、、、12月前後を含めた他の品質の低い期間があります。もう一つの重要な変数は、血リンパです。それは彼らの成長促進能力のために血リンパの異なるバッチをテストするために、そして一連の実験のために体液の同じバッチを使用するのが賢明です。

アメフラシ神経細胞の培養を準備することの難しさにもかかわらず、彼らは、シナプス形成とシナプス可塑性の研究にユニークで貴重な多くの利点を持っている。彼らは日の期間のシャープ電極記録によって監視することができる文化の中で単シナプス接続を形成する。十分に特徴付けられたプロトコルは、動物の行動に明確な類似点を持っている可塑性の形態を引き出すことが存在する。刺激は7、お風呂にまたはsynapses6のサブセットに適用することができます、そして文化の形状は、1つの感覚ニューロンの連絡先単一運動ニューロン、または分岐軸索のコンタクトワン感覚ニューロン2個のモータニューロン、または感覚twoように変化させることができるニューロンは、個々の運動ニューロンに連絡してください。分子細胞生物学的経路は、DNA、RNA、siRNAおよび他の試薬の微量注入することで、個々のニューロンに変更することができ、神経細胞の構造と機能、シナプス伝達と可塑性への影響は、時間的および空間分解能でモニターすることができます。 NIHおよびブロード研究所は、必要アメフラシのゲノムのシーケンシングの完了を、近づいています

Materials

Solutions needed for culture 0.35 M MgCl2, stored at room temperature, used for anesthesia. Poly-L-lysine solution, Sigma: P-1524, MW >300,000, made in 0.1M Sodium Borate pH8.2 to 0.5mg/ml solution. Vortex well and filter sterilize through a 0.22 μm filter, store it at 4C°. Do not freeze-thaw. L-15 Medium powder (Leibovitz) (Sigma: L4386) supplemented with the salts as below to make 1 liter L-15 powder 13.8g NaCl 15.4 g D-Glucose 6.24 g MgSO4•7H20 6.45g KCl 350 mg NaHCO3 170 mg MgCl2•6H2O 5.49 g CaCl2•2H2O 1.43g HEPES 3.53g Add ddH20 to 1 liter. The pH should be about 7.4-7.5, add 10ml of 100X Pen/Strep solution, and filter-sterilize through a 0.22 μm filter. Store at 4C0 for no longer than 1 month. Protease digestion solution: 1% Protease IX (1unit/mg) is made in L15 (supplemented with salts as above) or in ASW immediately before use, filter-sterilized through a 0.22 μm Millipore. 5mls should be enough for the ganglia from two animals (make sure the ganglia are completely immersed in protease solution). Sigma has reported that they will discontinue selling Protease IX. A substitute protease is: Dispase II (Roche Applied Science catalog # 04942078001). Culture medium. Immediately prior to preparing cultures, thaw a 10 ml aliquot of hemolymph and mix it with 10 mls of L15 (supplemented with salts as above) to make 20mls culture medium. Add 200 μl of 200mM L- Glutamine, mix well and use for preparing cultures. This medium should be prepared fresh each time cultures are made. Artificial Seawater can be made from Instant Ocean (Aquarium Systems, Mentor, OH) or as follows: 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 30 mM MgCl2(6H2O), 20 mM MgSO4, 10 mM CaCl2(2H2O), 10 mM HEPES, with pH adjusted to 7.4.