Подготовка Aplysia Сенсомоторной нейронов клеточных культур

Summary

Первичные культуры

Protocol

Подготовка (см. раздел решения в конце протокола состав растворов)

1. Подготовка культуры блюд. Пальто из стекла и Маттек со стеклянным дном культуры блюдо с поли-L-лизин (пр-во борат натрия). Добавьте достаточно, чтобы полностью покрыть стекло хорошо и оставить на> 1 час (можно оставить на ночь). Тщательно удалить поли-L-лизин, промыв в искусственной морской воде (ASW) 4-5 раза. После удаления последнего полоскания, добавьте 2 мл 50%-L15 (дополнен солями и содержащие L-глютамин в конечной концентрации 2 мМ) / 50% гемолимфы. Эта культура среда должна быть в блюдо, по крайней мере за один час до покрытия клеток так, чтобы гемолимфы пальто блюдо.
2. Очистите инструменты и Sylgard блюда с этанолом, ополосните их водой с DDH ₂ 0, а затем разместить их в течение> 1 час под УФ-светом в культуре капотом.
3. Подготовка резкое электродов для микродиссекции нейронов. Использование микроэлектрода съемник (например, Саттер Flaming Браун Р-97), потяните электродов стеклянную пипетку с 1,5 мм наружный диаметр, 0,86 до 1,12 мм, внутренним диаметром и длиной 100 мм (например, AM системном каталоге # 628000, Всемирный точных приборов TW150-4, 1,55 / 1,12). Используйте параметры, которые производят электрод с длинным и тонким кончиком тонкой такого высокого сопротивления, что не существует капиллярная приема жидкости при помещении их в раствор. Наличие жидкости мениск означает, что электрод может привести к повреждению нейронов при выделении. Поваренная книга Саттера электрод обеспечивает превосходное руководство по настройке электрода программ. Мы используем окно нити, и один шаг напряжение, чтобы генерировать культуру электродов.
4. Подготовка анестезии раствор (0,35 м MgCl2), питательной среды (L15 дополнен солями и гемолимфы), и протеазы раствором (1% протеазы типа IX, Sigma, 1 ед / мг, в конечной концентрации 10 ед / мл).
5. Животные: использовать взрослые 80-100 г Aplysia для изоляции сенсорных нейронов и LFS моторных нейронов. Использование несовершеннолетних 1-4 г Aplysia для изоляции L7 моторных нейронов. Удалить животных осторожно из морской воды танки, и поддерживать в морской воде (в стакан, ведро или полиэтиленовый пакет) не более чем за 30 минут до начала анестезии и культуры процедуры.

Культура процедуры

А. Культивирование плевральной сенсорные нейроны от 80-100 г Aplysia

1. Анестезию животных для удаления ганглиев: Inject 0,35 М MgCl ₂ во взрослую Aplysia (80-100 г), используя 60 мл шприц с 18 калибра 1,5 дюйма иглы. Введите подножия животных под углом около 35 градусов, и не вводите слишком глубоко. Цель состоит в том, чтобы вводить в hemocoel животного, не проникая внутренних органов. Животное должно стать очень растянут и расслабленным.
2. Рассеките ганглиев: Pin анестезии животных на вскрытии блюдо, с контактный (18-иглы хорошо работать для животных 80-100 г) на голову и хвост, и ноги вверх. Держите ноги с зубчатыми щипцами и прорезать кожу и подлежащей соединительной ткани по всей длине стопы (от головы до хвоста) с хирургическими ножницами. Pin стороны вниз. Использование щипцы и ножницы, разрезать пищевода и тянуть в сторону, чтобы разоблачить ганглиев. Использование тонких щипцов и тонкие ножницы, вырезать плевральных ганглиев педали (сенсорных нейронов находятся в плевральной ганглиев). Оставьте изрядное количество нервов, так как это облегчает придавить ганглиях после протеазы лечения.
3. Протеазы пищеварения ганглиев: Место ганглиев протеазы раствор (10 мг / мл 1 ед / мг в L15) в термостат при 34,5 ° C (34-35 ° C в порядке) в течение 2 часов и 15 минут. Использование тонких кончик щипцов для передачи и мыть ганглиев ASW три раза. Имейте в ганглиях L15. Заметим, что время инкубации протеазы могут варьироваться. Это позволяет предоставлять соединительной ткани, которая будет легко удалить. Если это слишком трудно desheath ганглиев без повреждения нейронов, увеличение времени инкубации протеазы. Если она очень проста в desheath ганглиев, и нейроны "мягкие", сократить время протеазы инкубации.
4. Desheathing ганглиев: Трансфер протеазы-переваренной ганглиев на 60 мм или 35 мм блюдо с sylgard и L15. Просмотр в стерео-микроскопа (с наружного освещения галогенные), удалите педаль ганглиев и придавить плевральных ганглиев Sylgard блюдо в правильной ориентации использованием насекомых булавками и тонкой щипцами. С тонкой щипцы и ножницы хирургические Vanna, осторожно поднимите соединительной ткани и сократить его подвергать сенсорный кластер. Будьте осторожны и не когда-либо трогать или повреждение нейронов somata. Удалите излишки соединительной ткани с блюдом и добавить больше среде, убедившись, что никогда не подвергайте desheathed ганглия с воздухом. Сенсорных кластер состоит из примерно 200 кластерных нейронов 40-50 микрон диаметром. Установите булавку, чтобы сделать «пост» на небольшом расстоянии от ganglиона (в поле зрения).
5. Выделение нейронов: Использование длинные, острые электрода культуры стекло, вытащить определили нейронов один за другим, касаясь тела клетки недалеко от центра (не прокалывать) и медленно и неуклонно тянет ячейки сомы, вместе с аксона, от ганглия. Аккуратно крана против булавку, чтобы выбить нейроны от электрода.
6. Покрытие нейронов: Используйте pipetman (P10) для передачи отдельных нейронов с блюдом Sylgard к культуре блюдо. Перед передачей нейронов, пипетки культуральной среде в кончик так, чтобы пластиковый наконечник покрыта гемолимфы (это предотвращает нейроны от прилипания к пластик). Будьте особенно внимательны, чтобы не подвергать нейронов пузырьков воздуха или какому-либо крайних сил (т.е. очень осторожно взять и удалить нейроны от pipetteman). Распределите равномерно по всей нейронов блюдо. Используйте острый электрод, чтобы мягко прямо процессов и получают от них до самого дна.
7. Инкубация: Оставьте посуду на столике микроскопа при комнатной температуре в течение не менее 3 часов. Мы регулярно оставлять их на ночь. Убедитесь, что столик микроскопа является невозмущенной в этот период. Обложка сцене с алюминиевой фольгой для защиты от света. Аккуратно перенести их на 18 ° C инкубатора.
8. Культуры должны придерживаться блюдо в течение примерно 3 часов и новый рост аксонов должны быть видны в течение примерно часов 6-12. Рост изолированных сенсорных нейронов достигает плато DIV 3 или 4. Обратите внимание, что изолированные сенсорные нейроны лань не образуют autapses или химические синапсы друг с другом, хотя они и форму электрических контактов пробел.

В. Подготовка сенсорного нейрона-двигательного нейрона cocultures

Сенсорные нейроны формируют синапсы с целевыми моторных нейронов в культуре. Наиболее часто используемые моторные нейроны являются LFS моторных нейронов и L7 двигательных нейронов, от брюшного ганглия. LFS моторных нейронов изолированы от взрослых (80-100 г) Aplysia, и Есть около 20 LFS моторных нейронов в брюшной ганглий. L7 двигательный нейрон изолирован от несовершеннолетних (1-4 г) животных, и есть только один L7 в брюшной ганглиях. LFS моторные нейроны являются 40-50 мкм в диаметре, перемежаются между LE сенсорных нейронов близка к корню сифон нерва на вентральной поверхности брюшной ганглиях, и отличаются тонким темное пятно пигмента в каждой сомы. L7 двигательных нейронов составляет 100-150 микрон в диаметре и находится на дорсальной поверхности ганглия, на середине края левой части ганглия. В то время как более экономично использовать LFS моторных нейронов, большой размер L7 двигательных нейронов является выгодным для некоторых экспериментов. L11 двигательных нейронов, а также на спинной левой поверхности брюшной ганглий, каудально L7, является нейрон nontarget двигателя и могут быть эффективно использованы в качестве контроля, с которым сенсорного нейрона fasciculates, но не образуют химические синапсы.

1. Анестезию животных для удаления ганглиев. Для LFS моторных нейронов, делай, как описано для плевральной сенсорных нейронов. Для L7 моторных нейронов, вводят 0,35 М MgCl ₂ в Aplysia несовершеннолетних (1-4 г), используя 10 мл шприц с 21-иглы.
2. Рассеките брюшной ганглиях: Pin анестезии животных на вскрытии блюдо, как описано выше (с использованием игл 21 калибр для несовершеннолетних животных). Использование тонких щипцов и тонкие ножницы, вырезать брюшной ганглиях.
3. Протеазы пищеварения ганглиев: Это делается, как описано в плевральной сенсорных нейронов, кроме того, что пищеварение время сокращается до 1 ч 45 мин для ганглиев из несовершеннолетних (1-4 г) животных.
4. Desheathing ганглиев: Трансфер протеазы-переваренной ганглиев на 35 или 60 мм блюдо с sylgard и L15. Просмотр в стерео-микроскопа (с наружного освещения галогенные), в ганглиях вниз в Sylgard блюдо в правильной ориентации использованием насекомых булавками и тонкой щипцами. С тонкой щипцы и ножницы хирургические Vanna, осторожно поднимите соединительной ткани и сократить его разоблачить тела нейронов. Чтобы изолировать LFS моторных нейронов, контактный ганглия так, что брюшной поверхности вверх, а вместе с пинцетом вытащить соединительной ткани оболочки обратно, чтобы разоблачить весь половины ганглия содержащие LFS моторных нейронов (справа), desheath Остальные части ганглия, удалите все соединительной ткани с блюдом и добавить больше L15. Чтобы изолировать L7 или L11 двигательных нейронов, контактный ганглия так, что спинной поверхностью вверх, а вместе с пинцетом вытащить соединительной ткани влагалища назад подвергать половины ганглия, содержащих как L7 и L11 (слева от Вас). Будьте осторожны и не когда-либо трогать или повреждение нейронов somata. Место булавку, чтобы сделать «пост» на небольшом расстоянии от ганглия (в пределах поля зрения).
5. Выделение нейронов: удаление нейронов с острым электродом, как описано для сенсорных нейронов. LFS нейроны разн.erentiated из соседних LE сенсорных нейронов на основе небольшого темного пятна пигмента в их somata. L7 нейрона может быть дифференцирована от нейрона L11-первых, потому L11 является каудально L7, L11, поскольку тело клетки более продолговатой формы в то время как L7 тела клетки круглее и потому, что аксон L11 имеет тенденцию филиала на два близких к ячейке тела.
6. Покрытие нейронов: Используйте pipetman (P10) для передачи отдельных нейронов с блюдом Sylgard к культуре блюдо, как описано для сенсорных нейронов.
7. Сопряжение с сенсорных нейронов: Давайте моторных нейронов придерживаться культуры блюдо, по крайней мере 1 час. Затем добавить изолированных сенсорных нейронов с pipetman, обеспечивая каждого сенсорного нейрона, прилегающих к покрытием двигательный нейрон. Используя острый стеклянный электрод тщательно выправить сенсорных аксонов нейронов, а также коаксиальный сенсорных клеток организма на позицию рядом двигательных нейронов, на расстоянии, равном или немного меньше, чем длина сенсорных аксонов клеток. Использование стеклянного электрода, коаксиальный сенсорных аксонов, чтобы вступить в контакт с двигательных нейронов, очень мягко использованием стороне конические электродов, наконец, имеют сенсорные аксон физически контакта аксона двигательного нейрона. Не поднимайте культуры блюдо, а скорее мягко скользят вдоль блюдо столик микроскопа.
8. Оставьте посуду на столике микроскопа при комнатной температуре в течение не менее 3 часов и трансфер в 18 ° C инкубатор, как описано для сенсорных нейронов.
9. Культуры должны придерживаться блюдо в течение примерно 3 часов и новый рост аксонов должны быть видны в течение примерно часов 6-12. Сенсорные нейроны формируют синапсы с глутаматергической моторных нейронов очень быстро - как только ячейки сторонником достаточно, чтобы выполнять резкие записи электрода (3-5 часов), возбуждающих постсинаптических потенциал может быть записан. Синаптические связи продолжает расти, пока DIV 3, а затем стабильным до DIV7. Нейроны должны показать сложный продукт аксонов в течение первых одного-трех дней в культуре.

С. Подготовка гемолимфы

Гемолимфы используется в качестве фактора роста в культуре Aplysia (аналогично использованию фетальной телячьей сыворотки в культуре клеток млекопитающих). Ее собирают из больших (500 г, 1 кг) животных, а лучшее время для сбора гемолимфы (анекдотически) является весной (середина марта по июнь). Игрушки для животных в одноразовых underpad так, что только небольшая часть животных подвергается, чистая, что часть кожи с этанолом, а затем, удерживая ее, а другой человек использует стерильные лезвия бритвы, чтобы сделать разрез в пораженном участке. Сожмите животное так, чтобы гемолимфы впрыскивает в чистый стакан, убедившись, что он не свяжется с грязной кожи животного. Гемолимфы заполняет hemocoel животного (т.е. животное в основном мешок гемолимфы). Перепаковать животное один или два раза, сделать новый надрез и отжать трудно собрать как можно больше гемолимфы насколько это возможно (собирать в новый стакан, так что если он становится загрязненным, первая коллекция еще годны к употреблению). Гемолимфы от каждого животного должны храниться отдельно (т.е. не бассейн гемолимфы из разных животных). Спиновые гемолимфы при 2000 мкг в течение 10 мин для удаления клеток крови. Алиготе супернатанта в 10 мл аликвоты, этикетка на животных и хранить при температуре -80 ° C. Обратите внимание, что гемолимфы хранить при температуре -20 ° С формы осадка в среду. Новые аликвоту гемолимфы должны быть использованы все средства временем культура готов, и аликвоту должна быть талой только до подготовки среды. Не замораживать после размораживания.

Discussion

Успешной подготовки Aplysia сенсомоторной культуры имеет несколько медленно обучения, так как она включает в себя развитие мелкой моторики связано с микродиссекции и манипулирование отдельными нейронами рассматривается через стерео-микроскопа. По нашему опыту, это занимает около 1-3 недель практики, чтобы получить здоровый изолированных сенсорных нейронов в культуре и дополнительные 1-3 недели, чтобы научиться паре сенсорных нейронов с двигательными нейронами. Мы регулярно готовить культур в Labconco чистом столе, хотя вполне возможно, чтобы подготовить их на любом лабораторном столе или на столе, пока микроскоп невозмущенной во время культивирования (любые колебания или механических нарушений предотвратить нейроны от присоединения). Так как рост нейронов в морской воде при 18 ° С, бактериальные и грибковые загрязнения значительно реже, чем в культуре клеток млекопитающих. Самая важная переменная в культуре препарата качества животного. Aplysia могут быть приобретены у поставщиков, которые собирают их прямо из Тихого океана (Alacrity или Маринус), или из Университета Майами марикультуры учреждение, которое собирает гнездящихся пар от Тихого океана, а затем растет Aplysia через один цикл размножения. Таким образом, животные, генетически разнородны, и, в случае животные собраны из океана, они также являются гетерогенными с точки зрения их экологической истории. Существует некоторая сезонность с качеством нейронов получены из Aplysia, с худший период обычно происходит в августе, и еще более низкое качество период вокруг декабря. Еще одна важная переменная гемолимфы. Это имеет смысл для тестирования различных партий гемолимфы для их роста, содействие созданию и использовать ту же партию гемолимфы на множество экспериментов.

Несмотря на трудности подготовки Aplysia нейронных культур, они обладают рядом уникальных и ценных преимуществ для исследования формирования синапсов и синаптической пластичности. Они образуют моносинаптических связей в культуре, можно контролировать с помощью резкого записи электрода для периодов дней. Ну характеризуется протоколы существуют, которые вызывают формы пластичности, которые имеют четкие параллели в поведении животного. Стимулы могут быть применены к ванне или к подмножествам synapses6, 7 и геометрии культуры могут быть изменены так, что один сенсорные контакты нейрона одного нейрона двигатель, или одного сенсорного нейрона с раздвоенные контакты аксон две моторные нейроны, или два сенсорных нейронов контакт отдельного нейрона двигателя. Молекулярная и клеточная биологические пути могут быть изменены в отдельных нейронов микроинъекции ДНК, РНК, миРНК и других реагентов, а также воздействие на нейронные структуры и функции, синаптической передачи и пластичности можно контролировать с временным и пространственным разрешением. НИЗ и Broad Institute, близится к завершению из последовательности Aplysia генома, которая должна

Materials

Solutions needed for culture 0.35 M MgCl2, stored at room temperature, used for anesthesia. Poly-L-lysine solution, Sigma: P-1524, MW >300,000, made in 0.1M Sodium Borate pH8.2 to 0.5mg/ml solution. Vortex well and filter sterilize through a 0.22 μm filter, store it at 4C°. Do not freeze-thaw. L-15 Medium powder (Leibovitz) (Sigma: L4386) supplemented with the salts as below to make 1 liter L-15 powder 13.8g NaCl 15.4 g D-Glucose 6.24 g MgSO4•7H20 6.45g KCl 350 mg NaHCO3 170 mg MgCl2•6H2O 5.49 g CaCl2•2H2O 1.43g HEPES 3.53g Add ddH20 to 1 liter. The pH should be about 7.4-7.5, add 10ml of 100X Pen/Strep solution, and filter-sterilize through a 0.22 μm filter. Store at 4C0 for no longer than 1 month. Protease digestion solution: 1% Protease IX (1unit/mg) is made in L15 (supplemented with salts as above) or in ASW immediately before use, filter-sterilized through a 0.22 μm Millipore. 5mls should be enough for the ganglia from two animals (make sure the ganglia are completely immersed in protease solution). Sigma has reported that they will discontinue selling Protease IX. A substitute protease is: Dispase II (Roche Applied Science catalog # 04942078001). Culture medium. Immediately prior to preparing cultures, thaw a 10 ml aliquot of hemolymph and mix it with 10 mls of L15 (supplemented with salts as above) to make 20mls culture medium. Add 200 μl of 200mM L- Glutamine, mix well and use for preparing cultures. This medium should be prepared fresh each time cultures are made. Artificial Seawater can be made from Instant Ocean (Aquarium Systems, Mentor, OH) or as follows: 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 30 mM MgCl2(6H2O), 20 mM MgSO4, 10 mM CaCl2(2H2O), 10 mM HEPES, with pH adjusted to 7.4.