Summary
في هذا الفيديو ، نبدي تهيج الجلد البشرة الاختبار (البشرة SIT) المتقدمة والتحقق من صحتها ل
Abstract
تم تطوير اختبار البشرة تهيج الجلد (البشرة SIT)
Protocol
أولا تكييف الأنسجة -- يوم 0
- عند تلقي عدة EPI - 200 - SIT البشرة ، والتحقق من جميع مكونات عدة من أجل النزاهة (لمزيد من التفاصيل انظر الجدول مجموعة محددة من الكواشف والمعدات).
- لكل أنسجة البشرة الثلاثة ، تعد واحدة عقيمة 6 - جيدا قبل لوحة مليئة 0.9 مل من مقايسة المتوسطة.
- تحت ظروف معقمة ، فتح كيس من البلاستيك يحتوي على لوحة تحتوي على 24 جيد للأنسجة البشرة وإزالة شاش معقم.
- استخدام ملقط معقم لإزالة كل الأنسجة التي تحتوي على إدراج البشرة ومكان إدراجها في لوحة 24 - جيدا فارغة. خلال هذه الخطوة ، وإزالة أي المتبقية الشحن agarose أن تلتزم الاطراف الخارجية للإدراج من جانب لطيف على الورق النشاف تصفية العقيمة.
- خلال الدقائق ال 5 المقبلة ، وفحص البصر الأنسجة. لا تستخدم الأنسجة التالفة أو الأنسجة التي تغطيها تماما مع السائل.
- به مسحة القطن غيض عقيمة ، بعناية الجافة على سطح الانسجة. ليس محاولة للمس الأنسجة مباشرة -- الآثار الشعرية هي كافية لإزالة الرطوبة من سطح الأنسجة.
- بعد تجفيف سطح الأنسجة ، ونقل ثلاثة من الأنسجة إلى الصف العلوي من لوحات 6 - جيدا قبل مليئة 0.9 مل من مقايسة المتوسطة. الإفراج عن أي فقاعات الهواء المحاصرين تحت إدراج.
- وضع لوحات تحتوي على 6 - جيدا يدرج في الحاضنة لمدة 60 ± 5 دقائق قبل الحضانة عند 37 ± 1 درجة مئوية ، ± 5 ٪ CO 2 1 ، 95 ٪ RH (الرطوبة النسبية).
- في نهاية ال 60 ± 5 فترة ما قبل الحضانة دقيقة ، نقل إدراج العلوي من الآبار في أقل من الآبار لوحة 6 - جيدا. وضع لوحات العودة إلى الحاضنة (37 ± 1 درجة مئوية ، ± 5 ٪ CO 2 1 ، 95 ٪ RH) ليلة ما قبل الحضانة (18 ± 3 ساعة).
- ضع بقية المتوسطة مقايسة في الثلاجة (5 ± 3 درجة مئوية). بعد ليلة وضحاها ما قبل الحضانة ، يمكن تطبيق اختبار المواد الكيميائية للأنسجة البشرة.
ملاحظة : يمكن اختصار هذا الإجراء قبل الحضانة في حالة الولادة في وقت متأخر الأنسجة (مثلا إذا الأنسجة تصل يوم الاربعاء بدلا من يوم الثلاثاء).
II. التعرض للمواد الكيميائية -- يوم 1
- تعد واحدة 6 - جيدا في لوحة الاختبار الكيميائية عن طريق ملء الصف العلوي فقط مع 0.9 مل لكل بئر من مقايسة المتوسطة.
- قبل حوالي 5 دقائق من التعرض للمواد الكيميائية المخطط ، وإزالة لوحات 6 - جيدا تحتوي على أنسجة قبل مكيفة من الحاضنة.
- تقييم السطح من الأنسجة وإزالة أي الرطوبة باستخدام نصائح القطن المعقم.
- تسمية جميع أغطية لوحة 6 بشكل جيد مع رموز أو أسماء مواد الاختبار.
- جرعة الأنسجة مع المواد الكيميائية الاختبار في فترات 1 دقيقة لتسهيل الشطف من المواد الكيميائية الاختبار بعد التعرض. لوحات مع الحفاظ على الأنسجة مداوي في هود عقيمة ، حتى يتم مداوي النسيج الماضي.
- لاختبار المواد الكيماوية السائلة ، الاستغناء عن 30 ميكرولتر من الحل مباشرة فوق النسيج ووضع شبكة من النايلون على سطح الانسجة. إذا لزم الأمر ، والموقف برفق باستخدام شبكة لمبة زجاجية برئاسة باستور ماصة. لا تضغط على سطح النسيج.
- لsemisolids الاختبار ، واستخدام ماصة الإزاحة الإيجابية للاستغناء 30 ميكرولتر مباشرة فوق النسيج. إذا كان من الضروري نشر هذه المادة الكيميائية مع ماصة باستور لتغطية سطح النسيج قدر الإمكان.
- بالنسبة للمواد الصلبة ، وقبل وقت قصير من تطبيق للمادة الاختبار ، ويبلل سطح النسيج مع 25 ميكرولتر من DPBS العقيمة. سيؤدي ذلك إلى تحسين الاتصال مع سطح النسيج الكيميائية الاختبار. ملء ملعقة 25 ملغ معايرة الطلب الحاد (أو أي وسيلة أخرى مناسبة) مع ما يقرب من 25 ملغ من مادة الاختبار ناعما الأرض. تطبيق اختبار الكيميائية الصلبة على سطح النسيج. إذا كان ذلك ضروريا ، واستخدام لمبة برئاسة باستور الماصة لإفراغ ملعقة تماما. يهز بلطف إدراج لتحسين انتشار الصلبة على السطح.
- للمواد الخاضعة للاختبار مع الاتساق شمعية ، في محاولة لتشكيل مسطح "كوكي مثل" قطعة حوالي 8 ملم في القطر ووضعه على قمة النسيج ، الذي كان سابقا مع المبللة DPBS العقيمة. لتحسين الاتصال بين مضمون الاختبار والأنسجة ، وتثقل على "كوكي" مع الفولاذ المقاوم للصدأ أو مساعدات من البلاستيك.
- كما تطبق DPBS سيطرة السلبية وSDS 5 ٪ حيث السيطرة الإيجابية على الأنسجة السيطرة.
- بعد الجرعات النسيج الماضي ، نقل عن لوحات لمدة 35 ± 1 دقيقة لترطيب الحاضنة (37 ± 1 درجة مئوية ، ± 5 ٪ CO 2 1 ، 95 ٪ RH).
- بعد 35 دقيقة ± 1 الحضانة عند 37 درجة مئوية إزالة جميع لوحات من الحاضنة. وضع لوحات في هود العقيمة وانتظر حتى اكتمال مدة 60 دقيقة عن التعرض للمواد الكيميائية في الأنسجة first مداوي.
- تبدأ بعد ذلك إجراء الغسيل باستخدام إدراج واحد في فترة زمنية دقيقة (لتغطية هذه الخسائره أن الوقت اجمالي التعرض لإدراج كل 60 دقيقة).
- استخدام زجاجة غسل لشطف الأنسجة مع DPBS العقيمة. ملء نسيج إدراج 15 مرة باستخدام دفق مستمر من DPBS وتفريغها (ملاحظة : للأنسجة مع شبكة من النايلون ، وغسل السطح الأنسجة 5 مرات وإزالة شبكة بعناية مع ملقط وأشار حاد بعد ذلك ، تواصل مع المتبقية يغسل 10).
- بعد 15 الشطف باستخدام زجاجة الغسيل ، ويغرق تماما إدراج 3 مرات في 150 مل DPBS ويهز لإزالة ما تبقى من مواد الاختبار.
- أخيرا ، شطف إدراج الأنسجة من الداخل مرة واحدة ومرة واحدة من الخارج مع DPBS العقيمة.
- إزالة أي فائض في DPBS من الأنسجة التي تهز بلطف إدراج ، والنشاف على الورق النشاف العقيمة.
- نقل إدراج الأنسجة نشف لوحة جديدة 6 - جيدا مسبقا قبل تجربة مليئة المتوسطة. يجب أن تتم جميع هذه الخطوات (14-18) ضمن 1 دقيقة لكل إدراجه.
- بعد شطف النسيج الماضي ، بعناية الجافة على سطح كل نسيج القطن المعقم مع مسحة الرؤوس.
- احتضان الأنسجة في حاضنة للال 24 ساعة القادمة ± 2 (37 ± 1 درجة مئوية ، ± 5 ٪ CO 2 1 ، 95 ٪ RH).
ملاحظة : يجب على كل فني الفحص يتم اختبار مواد الاختبار أكثر من 6 بما في ذلك ضوابط السلبية والإيجابية في تشغيل اختبار واحد (مجموعة) ، لتكون قادرة على اتباع بروتوكول كما هو موضح أدناه
III. تبادل المتوسطة -- يوم 2
- بعد 24 ± 2 ساعة بعد الحضانة ، ونقل يدرج في الجزء السفلي من لوحة 6 - جيدا ، قبل مليئة 0.9 مل من وسائل الإعلام. ويمكن جمع وسائل الاعلام من الصفوف العليا لتحليل نقاط النهاية إضافية (السيتوكينات ، chemokines الخ). تحليل نقاط النهاية الثانوية اختيارية.
- تواصل مع مرحلة ما بعد الحضانة (37 ± 1 درجة مئوية ، ± 5 ٪ CO 2 1 ، 95 ٪ RH) لمدة 18 ± 3 ساعات.
رابعا. MTT الفحص الاستمرارية -- يوم 3
- تسمية 24 - two جيدا لوحات تحمل أسماء أو رموز كيميائية. وسوف تكون لوحة واحدة لحضانة الأنسجة مع MTT والآخر للخطوة الاستخراج.
- إعداد الحل MTT التي تركز على ذوبان MTT (5 ملغ / مل) ، وتمييع فإنه مع مخفف MTT. تركيز المحلول النهائي MTT هو 1 ملغ / مل.
- ماصة 300 ميكرولتر من محلول MTT في كل بئر من 24 لوحة جيدا.
- إزالة لوحات 6 - جيدا من الحاضنة ، وصمة عار في أسفل يدرج على ورقة نشاف ، وتحويلها الى لوحة 24 - جيدا قبل مليئة MTT.
- مكان لوحة 24 بئرا في حاضنة (37 ± 1 درجة مئوية ، ± 5 ٪ CO 2 1 ، 95 ٪ RH) ، واحتضان لمدة 3 ساعات ± 5 دقائق. التقيد بدقة ± 5 3 ساعات فترة حضانة دقيقة لتجنب الانحراف بين قراءات مختلفة MTT.
- عند اكتمال MTT الحضانة ، واستخدام مضخة الشفط لنضح بلطف المتوسطة MTT من الآبار في كل شيء.
- الملء الآبار مع DPBS ونضح مرة أخرى. كرر هذا مرتين أخريين الشطف وتأكد من أن الأنسجة جافة بعد التطلع الماضي.
- يغسل بعد نقل إدراج لوحة 24 بئر جديدة. تزج يدرج بواسطة pipetting بلطف حل مستخلصة 2 مل (الأيزوبروبانول) في كل إدراج. وسوف ترتفع فوق مستوى الحواف العليا للإدراج ، وبالتالي غمرت تماما الأنسجة.
- ختم لوحة 24 - جيدا (على سبيل المثال مع Parafilm أو باستخدام حقيبة الختم) لمنع التبخر مستخلصة. استخراج MTT من الأنسجة لمدة لا تقل عن 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع لطيفة تهز شاكر على لوحة (~ 120 دورة في الدقيقة). ويمكن أيضا استخراج بين عشية وضحاها دون أن تهتز استخدامها.
- بعد فترة اكتمال الاستخراج ، يخترق إدراج بإبرة الحقن أو لمبة مطرز ماصة باستير والسماح للاستخراج لتشغيل في البئر الذي اتخذ من إدراج.
- رفض إدراج ثقب ماصة والحل في البئر صعودا وهبوطا ثلاث مرات حتى يصبح متجانس.
- لكل الأنسجة ، ونقل اثنين aliquots 200 ميكرولتر من الحل formazan الأرجواني في أسفل لوحة microtiter 96 - جيدا المسطحة. نقل التكرارات وفقا لتصميم لوحة الثابتة الواردة في جدول يرافق هذا البروتوكول الفيديو. للفراغات ، استخدم الأيزوبروبانول.
- قراءة الكثافة الضوئية (OD) مقتطفات من MTT في معمل لوحة 96 - جيدا باستخدام الطول الموجي من 570 نانومتر (540-580) من دون مرشح المرجعية.
- إدخال النتائج في جدول بيانات لحساب التلقائي للنتائج (الشكل 1).
- هو المسمى والكيميائية اختبار "مهيجة" (R38 GHS أو الفئة 2) إذا كان بقاء الأنسجة في المئة التي تحددها فحص MTT هو <50 ٪ نسبة إلى السيطرة السلبية.
ملاحظة : MTT غير سامة ، لذا يجب التأكد من ارتداء القفازات الواقية عند التعامل معها. وهكذا MTT حماية لهاlutions من الضوء ، منذ MTT خفيفة حساسة. استخدام الحل MTT في غضون ساعات قليلة بعد إعداد لأنه يحط على مر الزمن.
خامسا جودة الفحص التحكم
البشرة قبول عدة EPI - 200 - SIT المعايير :
وينبغي في النماذج ري المختبر تقديم متسقة ، وبيانات ذات جودة عالية على مر الزمن ، وليس فقط أثناء عملية التحقق من صحة (8). المبادئ التوجيهية الموصى بها لضمان على المدى الطويل واستنساخ تجربة الأداء تشمل "توصيف كامل من الخلايا أو الأنسجة ، وأخذ العينات من كل الكثير... لمزيد من الأداء ، والاستخدام المنتظم للضوابط ومعايير للمواد الكيميائية لتوفير ضمان اتساق الأداء مقايسة" (9) . بالإضافة إلى معايير القبول مقايسة المبينة أدناه ، كل دفعة إنتاج البشرة ومراقبة الجودة اختباره من قبل الشركة المصنعة للمادة كيميائية ضد القياسي إضافية (تريتون 1 ٪ X - 100). الوقت التعرض اللازمة للحد من قابلية النسيج إلى 50 ٪ (ET - 50) لتحديد تريتون هو X - 100. عن البشرة ، وتراوحت في المتوسط سنويا ET - 50 القيم من 5.9 ساعة إلى 7.5 ساعة. وقد بلغ متوسط الكثير الكثير من السيرة الذاتية للأنسجة السيطرة السلبية (أي تقلب في بقاء خط الأساس) تحت 7.5 ٪ عن كل سنة منذ عام 1996. يجب أن تكون قيمة كل ET50 الكثير الإنتاج تندرج 2 الانحرافات المعيارية من المتوسط التاريخي تريتون X - 100 ET50 أنشئت في عام 1996 (أي ET - 50 = 6.7 ساعة ؛ قبول الحد الأدنى = 4.8h ؛ العلوي حد القبول = 8.7h) بغية لطرحه للاستخدام من قبل الشركة المصنعة.
EPI - 200 - SIT الفحص قبول المعيار 1 : التحكم السلبية :
وOD المطلقة للأنسجة السلبية (NC) التحكم (تعامل مع DPBS العقيمة) في اختبار MTT هو مؤشر على قابلية الأنسجة التي تم الحصول عليها في المختبر بعد الشحن والتخزين والإجراءات في ظل ظروف محددة للاستخدام. في مقايسة يفي بمعايير القبول إذا كان يعني OD 570 من الأنسجة غير NC ≥ ≤ 1.0 و 2.5.
EPI - 200 - SIT الفحص قبول المعيار 2 : التحكم ايجابي
يستخدم محلول 5 ٪ SDS (في O 2 H) والسيطرة الايجابية (PC) واختبار واحد مع المواد الكيميائية الاختبار. المتزامنة يعني أن جهاز الكمبيوتر لابد من اختبارها في كل تجربة ، ولكن لا يتطلب أكثر من جهاز كمبيوتر واحد في اختبار اليوم. وينبغي أن بقاء السيطرة الإيجابية تكون ضمن فاصل الثقة 95 ٪ من البيانات التاريخية. في مقايسة يفي بمعايير القبول إذا كان يعني بقاء الأنسجة PC أعرب كنسبة مئوية من الأنسجة السيطرة السلبية هي 20 ٪.
EPI - 200 - SIT الفحص قبول المعيار 3 : الانحراف المعياري (SD)
ومن المتوقع أن تهيج البشرة من صلاحية يعني تحديد يوم 3 الأنسجة واحد ، وبالتالي فإن تنوع النسيج يعيد ينبغي أن تكون منخفضة بشكل مقبول. في مقايسة يفي بمعايير القبول إذا SD المحسوبة من الفردية viabilities الأنسجة 3 ٪ من تعامل مماثل يعيد هو <18 ٪.
ممثل النتائج
Discussion
في هذا الفيديو ، لقد أثبتنا في تهيج الجلد البشرة الاختبار (البشرة SIT) المتقدمة والمصادق عليها في المختبر اختبار الجلد تهيج للمواد الكيميائية ، بما في ذلك مكونات مستحضرات التجميل والصناعات الدوائية. عند تنفيذ هذا الأسلوب ، فإنه من المهم للعمل في ظروف معقمة ومتابعة صارمة لبروتوكول التحقق ، لأن الانحراف عن البروتوكول قد يسبب نتائج مختلفة. بعض التعديلات للمقايسة ممكنة ، ومع ذلك ، ينبغي أن تناقش تعديلات على بروتوكول مباشرة مع المؤلفين.
والقيد الوحيد لهذه الطريقة هو احتمال حدوث تدخل من المواد الخاضعة للاختبار مع نقطة النهاية MTT. ويجوز للاختبار مادة ملونة أو أحد أن يقلل من MTT مباشرة (وبالتالي يحاكي نشاط نازعة من الميتوكوندريا الخلوية) تتداخل مع نقطة النهاية MTT. ومع ذلك ، فإن هذه المادة المختبرة هي مشكلة فقط إذا في وقت الاختبار MTT (أي 42 ساعة بعد التعرض للمادة الاختبار) كميات كافية من المواد الخاضعة للاختبار لا تزال موجودة على (أو في) الأنسجة. في حالة من هذا الحدث غير المحتمل ، و(صحيح) خفض MTT الأيضية ومساهمة من قبل اختبار المواد الملونة أو (كاذبة) خفض MTT المباشر للمواد الاختبار يمكن قياسها كميا بواسطة إجراء وصفه بالتفصيل في عملية إجراء الفحص القياسية التي توفرها شركة ماتيك
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر لZEBET في BFR (ألمانيا) ، BASF SE (ألمانيا) ، IIVS شركة (الولايات المتحدة) ، Zet LSL - (النمسا) للمشاركة في موضوع الوسط الدراسي التحقق الدولية للSIT البشرة التعديل (5 ).
References
- Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I. ngrid, Traue, D., Slawik, B., Spielmann, H. Optimization of the EpiDerm Test Protocol for the upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests. ALTEX. 21, 107-114 (2004).
- Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D., Spielmann, H. EpiDerm Skin Irritation Test Protocol - Assessment of the performance of the optimized test. ATLA. 33, 351-367 (2005).
- Kandárová, H., Hayden, P., Klausner, M., Kubilus, J., Kearney, P., Sheasgreen, J. In Vitro Skin Irritation Test: Improving the Sensitivity of the EpiDerm Skin Irritation Test Protocol.Accepted for publication. ATLA. , Forthcoming (2009).
- Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovi, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H. The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test. ATLA. 35, 559-601 (2007).
- Follow-up validation of the modified EpiDerm Skin Irritation Test (SIT): results of a multicentre study of twenty reference test substances. Liebsch, M., Gamer, A., Curren, R., Frank, J., Genschow, E., Tharmann, J., Remmele, M., Bauer, B., Raabe, H., Barnes, N., Hilberer, A., Wilt, N., Lornejad-Schäfer, M. R., Schäfer, C., Spiller, E., Hayden, P., Kandárová, H. 15th Congress on Alternatives to Animal Experimentation, 2008 September 19-21, Linz Austria, , (2008).
- United Nations. Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals (GHS). , Second revised edition, UN. New York and Geneva. (2007).
- ESAC. Statement on the Scientific Validity of In-Vitro Tests for Skin Irritation Testing. , ESAC. (2008).
- Gupta, K., Rispin, A., Stitzel, K., Coecke, S., Harbell, J. Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Issues and answers. Regul Toxicol Pharmacol. 43, 219-224 (2005).
- Rispin, A., Stitzel, K., Harbell, J., Klausner, M. Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Current practice. Regul Toxicol Pharmacol. 45, 97-103 (2006).
