このビデオでは、我々は表皮の皮膚刺激性試験(表皮SIT)のために開発および検証を実証する<em> in vitroで</em化粧品と医薬品成分を含む化学物質の>皮膚刺激性試験、。
表皮の皮膚刺激性試験(表皮SIT)を開発した<sup>(1,2,3)</sup>と検証<sup>(4,5)</sup>のための<em> in vitroで</em化粧品と医薬品成分を含む化学物質の>皮膚刺激性試験、。表皮のSITは、3Dを利用<em> in vitroで</em>再構築されたヒト上皮(RHE)モデルの表皮。このプロトコルで説明する手順では、GHSのカテゴリー2及び非刺激性物質の刺激性物質の区別を可能に<sup>(6)</sup>。試験はプレインキュベーション、60分露出、42時間のポストインキュベーションとMTT生存率アッセイから成る、4日間の期間の経過とともに行われます。組織の領収書と一晩プレインキュベーション(0日)した後、組織を局所的に液体、半固体、固体またはワックスすることができるテストの化学薬品(1日目)、にさらされている。三つの組織は、各被験物質のためだけでなく、ポジティブコントロール(5%水溶液。SDS溶液)、及びネガティブコントロール(DPBS)に使用されます。化学物質の曝露は、組織を37℃インキュベーター内に保持され、そのうち35分℃、60分間持続する被験物質は、広範な洗浄の手順で組織表面から削除されます。組織のインサートは、ブロットし、新鮮な培地に転送されます。 24時間の潜伏期間(2日目)後、培地を交換されます。培地は、サイトカインや関心のある他のエンドポイントのさらなる分析のために保存することができます。培地交換した後、組織を、さらに18時間インキュベートする。全体42hのポストインキュベーション(3日目)の終わりには、組織は、黄色のMTT溶液中に転送され、3時間インキュベートした。ミトコンドリア代謝を中心に形成された結果の青紫色のホルマザンの塩は、、イソプロパノールを使用して2時間抽出されます。抽出されたホルマザンの吸光度を分光光度計を用いて決定されます。化学物質は、陰性対照処置組織への相対的な組織の生存率が50%以下に下がっている場合刺激性として分類される。この手順は、EUの規制に沿って化学物質の危険有害性の特定とラベリングのためのin vivoでのウサギの皮膚刺激性試験での完全な代替として使用することができます<sup>(7)</sup>。
このビデオでは、我々は表皮の皮膚刺激性試験(表皮SIT)を開発し、化粧品及び医薬品成分を含む化学物質のin vitroでの皮膚刺激性試験のための検証を実証した。プロトコルからの逸脱が異なる結果を引き起こす場合があるので、このメソッドを実行するとき、それは、無菌条件下で動作するようにし、厳密に検証プロトコルに従うことが重要です。アッセイのいくつかの変形が可能である、しかし、プロトコルへの変更は、著者と直接相談する必要があります。
この方法の唯一の制限は、MTTのエンドポイントとの被験物質の干渉の可能性があります。直接MTTを減少させる色の被験物質または1つの(そしてそれによって細胞のミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ活性を模倣するには)MTTエンドポイントを妨げる可能性があります。しかし、これらの被験物質は、まだ(またはで)で組織を提示している唯一のMTT試験(すなわち42時間被験物質の暴露後の)被験物質の十分な量の時の場合の問題です。この万一の場合には、着色された試験物質や試験材料による(false)を直接MTTの還元により(本当の)代謝MTTの還元と貢献はで提供されるアッセイの標準操作手順で詳しく説明されている手順によって定量化することができるマテック株式会社
The authors have nothing to disclose.
著者らは、変性表皮SIT(5の多施設国際検証研究に参加するためBfRは(ドイツ)、BASF SE(ドイツ)、IIVS社(米国)、ゼットイン- LSL(オーストリア)でZEBETに感謝したいと思います)。