Summary
يوصف بناء مكتبة fosmid مع الحمض النووي الجيني البيئية معزولة عن عمق التواصل الرأسي لالمضيق البحري ميتة موسميا. يتم اختيار مكتبة استنساخ الناتج إلى 384 لوحات وكذلك المحفوظة في التسلسل الوظيفي المصب والفرز من تطبيق نظام اختيار مستعمرة الآلي.
Abstract
الغالبية العظمى من الميكروبات في الطبيعة تبقى غير قابلة للوصول في الوقت الراهن لأساليب الزراعة التقليدية. على مدى العقد الماضي ، والثقافة المستقلة الجينومية البيئية (
Protocol
وقد تم تقسيم المكتبة Fosmid البناء في أربع خطوات رئيسية وفرعية مقسمة إلى عدة أجزاء (انظر Fig.1 لمحة عامة).
الخطوة الأولى (راجع "استخراج الحمض النووي من 0.22 ميكرومتر مرشحات Sterivex" بروتوكول [3])
الجزء 1 : انزيم تحلل الخلايا المحفزة
الجزء 2 : تنقية البيئة عن طريق الحمض النووي CSCL الطرد المركزي المتدرج الكثافة والانتعاش الحمض النووي
الجزء 3 : ضبط الجودة من الحمض النووي المستخرج من هلام إستشراد
الخطوة الثانية
الجزء 1 : خطوات تعديل الأنزيمية من الحمض النووي البيئية المستردة
يتم تضمين كافة الكواشف اللازمة للخطوة نهاية إصلاح الحمض النووي البيئية في أدوات إنتاج Fosmid pCC1 المكتبة من EPICENTRE. من الناحية المثالية ، ينبغي تعديل الحمض النووي الخاص الجينومية إلى 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر.
- أذاب كل الكواشف على الجليد ، والجمع بين ما يلي وبإيجاز أنبوب الطرد المركزي للحصول على كل السائل إلى أسفل :
- س الماء المعقم ميكرولتر
- 8 ميكرولتر 10X نهاية إصلاح العازلة
- 8 ميكرولتر 2.5 ملي مزيج dNTP
- 8 ميكرولتر 10 ملي ATP
- ما يصل الى 20 ميكروغرام المنفصمة ادخال الحمض النووي (~ 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر)
- 4 ميكروليتر مزيج انزيم نهاية إصلاح
- 80 ميكرولتر حجم رد الفعل الكلي
- يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 45 دقيقة حتى 60 دقيقة وحرارة المزيج تعطيل انزيم على 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة (في الوقت نفسه ، وإعداد جيل agarose المنخفضة للذوبان اللاحقة اختيار الحجم النهائي اصلاحها الحمض النووي ، أنظر أدناه).
الجزء 2 : حجم الاختيار من الحمض النووي الجينومي بواسطة نابض هلام إستشراد الميدان (PFGE)
- اعادة تعليق 1.5 غرام من agarose انصهار منخفضة في 150 مل من تاي 1.0X تشغيل العازلة والصغيرة إضافة شريط مغناطيسي. غطاء القارورة مع غلاف بلاستيكي microwavable وتغلي بسرعة في الميكروويف حتى يذوب تماما agarose. يحرك حتى يتم حل الباردة بما فيه الكفاية لتصب في علبة هلام (~ 60 درجة مئوية).
ملاحظة : لا تشمل بروميد إيثيديوم أو الذهب SYBR إما في هلام أو في المنطقة العازلة على التوالي. - تجميع علبة هلام للادلاء جل واختيار المشط التي سوف تعطيك مساحة كافية لتحميل كامل نهاية إصلاح مزيج خام في واحدة بئرين (80 ميكرولتر زائد مبلغ مناسب من العازلة تحميل).
- صب 2،2 لتر من تاي 1.0X الى غرفة الكهربائي وتشغيل الجهاز لتعميم العازلة تشغيل وتعيين جهاز التبريد إلى 14 درجة مئوية. وينبغي تشغيل المضخة في 70 دورة في الدقيقة لضمان التداول كافية من المنطقة العازلة على التوالي والحفاظ على المنطقة العازلة في 14 درجة مئوية.
- صب agarose ذاب في علبة الجل على السطح مرة واحدة وتعادل كذلك يتم تبريد عليه وتأكد من تجنب الفقاعات. ضمان agarose ذاب هو حتى على مشط هلام ، وإلا بإزالة المشط ووضعه مرة أخرى إلى agarose ذاب. مرة واحدة عزز الجل ، إزالة المشط وتحميل المدى المتوسط أنا دوري الدرجة الأولى علامة في البئر الرابعة للهلام. بثق agarose من المحاقن وهلام شريحة صغيرة من المكونات مع نهاية مشرط. وضع المكونات في الجزء الأمامي من البئر وختم مع agarose المنصهر. وضع الجل الى غرفة الكهربائي.
ملاحظة : مقبض الخاص agarose هلام بعناية فائقة منخفضة ذوبان المواد الهلامية الفرامل بسهولة. معرفة ما اذا كان المخزن تشغيل هدأت إلى 14 درجة مئوية قبل البدء في تحميل الجل الخاص. إذا سدت تبدو الآبار الخاصة بك عن طريق agarose ، حاول في المرة القادمة التالية : قبل إزالة المشط من الجل ، إضافة 1-2 مل تاي عازلة حول المشط ، وهذا سيؤدي في ألطف الآبار. - في أول بئر ميكرولتر 5 حمولة λ HindIII هضم تليها 1 ميكرولتر من علامة التحكم في حجم fosmid (EPICENTRE و 100 نانوغرام / ميكرولتر). أضف 10 ميكرولتر من الماء المعقم لحجم علامة في أنبوب microcentrifuge فضلا عن مبلغ مناسب من المخزن التحميل. أكبر حجم يجعل من السهل تحميل هلام. مباشرة بجانب علامة fosmid تحميل الخاص نهاية إصلاح والمعطل للحرارة المزيج مع كمية مناسبة من المخزن التحميل. إغلاق الغطاء وبرنامج الضبط.
ملاحظة : نوصي حقا تحميل كميات مختلفة من السلالم الأخرى الحمض النووي لتحديد ما يقرب من كمية الحمض النووي أو لتصور مدى القص من الحمض النووي الخاص الجيني. علامات الحجم المثالي وλ الحمض النووي HindIII دايجست المدى المتوسط وأنا دوري الدرجة الأولى ماركر (سواء من NEB). - برنامج الضبط : استخدام خوارزمية السيارات إذا تم تجهيز نظام PFGE مع هذا. برنامج الإعداد تلقائيا بحساب تحتاج لفصل الحمض النووي لمجموعة وحجم معين. الإعدادات المستخدمة هي : الحمض النووي نطاق حجم 2-250 كيلو بايت ؛ عامل المعايرة : 1 ؛ الانحدار : [6 V / سم] ؛ وقت التشغيل : 12:00 ساعة ، وشملت الزاوية : 120 درجة ؛ الأولي وقت التبديل : 0.1 ثانية ؛ التحول النهائي مرة : 21.79 ثانية ؛ التعلية خطية = عامل.
- لتصور الحمض النووي الخاص ، صب 250 مل من تاي 1.0X العازلة في وعاء واضافة 25 ميكرولتر من الذهب SYBR 10.000X ؛ المزيج بلطف قبل وضع الجل الخاص في الحل. وصمة عار الجل الخاص لمدة 1 ساعة في الظلام والضوء SYBR الذهب الحساسة.
ملاحظة : التعامل مع الخاصgarose هلام بعناية فائقة والمواد الهلامية انصهار منخفضة الفرامل بسهولة.
الجزء 3 : الحمض النووي عن طريق الانتعاش وربط استخراج الهلام من الحمض النووي لاستعادة ناقلات الاستنساخ fosmid
يتم تضمين كافة الكواشف لهذا الجزء في إنتاج عدة EPICENTRE fosmid مكتبة.
- في الوقت نفسه بإعداد حمام الماء عند 70 درجة مئوية واحدة على 45 درجة مئوية لمدة الجل خطوة عملية الهضم.
- الجل الملون الخاص تأخذ جنبا إلى جنب مع أنبوب microcentrifuge tared الفارغة ومشرط معقم للtransilluminator الضوء الأزرق. تصور الخاص نهاية إصلاح الحمض النووي الجيني وحجم السيطرة علامة fosmid. المكوس شريحة هلام مع مشرط أن هاجرت مع وفوقها بقليل موقف علامة التحكم في حجم fosmid (المكوس شريحة الجل الذي هو 5-7 ملم واسعة) ونقل إلى شريحة أنبوب microcentrifuge tared. تشغيل المدى المتوسط أنا دوري الدرجة الأولى ماركر على الجل الخاص لأن هذا يساعدك على عدم قطع هلام عالية جدا.
ملاحظة : وضع التفاف البلاستيك على transilluminator الضوء الأزرق قبل وضع الجل الخاص على ذلك لمنع التلوث وعبر ارتداء النظارات عرض قبل تحول على ضوء أزرق. لا جل شرائح الاستهلاك حيث الحمض النووي الجيني هو أصغر من حجم السيطرة علامة fosmid لأن هذا سيؤدي إلى استنساخ خيالية غير المرغوب فيها.
يمكنك قص وتخزين شرائح تحتوي على هلام أدنى أو أعلى DNA الوزن الجزيئي لبناء كامل الجينوم طلقات نارية أو المكتبات BAC ، على التوالي.
وقف أنا : يمكن تخزين شريحة هلام المستردة (ق) في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى عام واحد - وزن الأنابيب tared وحساب وزن شريحة هلام (ق). وسوف 1 ملغ من agarose الغلة ما يقرب من 1 ميكرولتر من agarose المنصهر.
- تذوب ذوبان agarose انخفاض تحتوي على الحمض النووي الخاص الجينومية في حمام الماء عند 70 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة (ونحن لا تضيف جيلاز العازلة). بعد ذاب تماما شريحة الخاص هلام ، أنبوب نقل بسرعة إلى 45 درجة مئوية.
ملاحظة : لا دوامة عينتك للمساعدة في حل لأن ذلك قد قص الحمض النووي الخاص. - إضافة 1 U (1μl) من إعداد أنزيم جيلاز لكل 100 ميكرولتر من agarose ذاب. في احتضان 45 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ثم إضافة المزيد من جيلاز (2-4 ميكرولتر) ، واحتضان لمدة ساعة إضافية. الحرارة تعطيل تحضير الإنزيم جيلاز عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
وضع أنبوب على الجليد لمدة 10 دقيقة ، وأجهزة الطرد المركزي في أنبوب في أقصى سرعة (13،000 دورة في الدقيقة) لمدة 15 دقيقة إلى أي جزيئات غير قابلة للذوبان بيليه. إزالة بعناية طاف العليا ونقله الى انبوب فالكون 15 مل ويضاف 3 مل من الماء المعقم في أنبوب.
ملاحظة : تجنب أي pipetting agarose مكعبات. ونحن إضافة المزيد من جيلاز المدرجة في هذه المجموعة ، نأذن أنزيم جيلاز اضافية التحضير بشكل منفصل. - نقل حل لالترا - 4 Amicon حدة تصفية الطرد المركزي مع Ultracel - 10 وتدور غشاء الأنبوب في 4000 لمدة 6-8 دقائق ز وتجاهل من خلال تدفق. أجهزة الطرد المركزي حتى يتم تخفيض المبلغ من حل على فلتر لحوالي 100 ~ 500 ميكرولتر. إضافة آخر 3 مليلتر من الماء المعقم في أنبوب فارغ الصقر من فوق ونقل حل للأنبوب Amicon وكرر الخطوة الطرد المركزي. يغسل مرة الثالثة مع 3 مل من الماء وتدفق من خلال تجاهل مرة أخرى. تقليل الحجم النهائي ل5-10 ميكرولتر.
ملاحظة : نستخدم الدوار الدلو المتأرجح للخطوة الطرد المركزي ، يكفي ان تضع وحدة التصفية Amicon الطرد المركزي في لأنبوب 50 مل فالكون ليثبت في مكانه أثناء الطرد المركزي. Amicon تصفية يحتفظ بأمان 50 ميكرولتر من حل على مرشح حتى بعد الطرد المركزي الموسعة. - نقل الحمض النووي حل ما تبقى من أنبوب Amicon الى Microcon قبل غسلها YM - 50 وحدة تصفية الطرد المركزي وشطف الأنبوب Amicon مع 50 ميكرولتر إضافية من الماء المعقم لاسترداد جميع الحمض النووي. أجهزة الطرد المركزي في Microcon YM - 50 وحدة تصفية الطرد المركزي في microcentrifuge 10000 ز في حين لا يزال قليلا مع تغطية تصفية السائل. تحقق كل دقيقة إذا لم يبق سوى كمية صغيرة من السائل على التصفية. بدوره الاتجاه الصعودي لأسفل واسترداد تصفية الحل عن طريق الحمض النووي خطوة الطرد الثانية في 1000 لمدة 3 دقائق ز في أنبوب microcentrifuge الطازجة. حجم الناتج ينبغي ألا يتجاوز 10-15 ميكرولتر في المجموع ، قد يكون خلاف ذلك الحمض النووي الخاص مخففة جدا في ربط الخطوة.
ملاحظة : يجب الحرص على عدم زيادة ونقصان الجهاز لاستكمال تصفية جفاف. إذا كان غشاء الخاص بك هو جاف ، ثم يضاف الماء 10-15 ميكرولتر على الغشاء ، تستنهض الهمم برفق لمدة 30 ثانية واستعادة الحمض النووي الخاص على النحو المبين أعلاه. - تحديد الحل الحمض النووي الناجم عن NanoDrop أو مقايسة PicoGreen.
- تعافى نهاية إصلاح الحمض النووي هو الآن على استعداد ليكون ligated لناقلات الاستنساخ pCC1 - fosmid. أذاب الحل التالي على الجليد وتأكد من ناقلات لادخال نسبة المولي هو 10:01.
ملاحظة : 0.5 ميكروغرام pCC1 - fosmid ناقلات ~ 0.09 pmoles النواقل.
0.25 ميكروغرام من الحمض النووي ~ 40 كيلو بايت إدراج ~ 0.009 pmoles ادخال الحمض النووي
قد زيادة كمية الحمض النووي المستخدمة في ربط الخطوة تكون مفيدة إذا كان ينبغي عليك الحصول على عدد قليل من الحيوانات المستنسخة إلا بعد الطلاء fosmid المصابين E. على الخلايا القولونيةاختيار لوحات.
إضافة الكواشف وفقا للترتيب التالي وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة في الأنبوب للحصول على كل السائل إلى أسفل ، اضغط على أنبوب وتدور مرة أخرى :- س الماء المعقم ميكرولتر
- 1 ميكرولتر 10X العازلة ربط سريع وصله
- 1 ميكرولتر 10 ملي ATP
- 1 ميكرولتر pCC1 - fosmid ناقلات (0.5 ميكروغرام / ميكرولتر)
- س ميكروليتر DNA إدراج يتركز (0.25 ميكروغرام)
- 1 ميكرولتر يغاز DNA سريع لينك
- 10 ميكرولتر حجم رد الفعل الكلي
- يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة والحرارة تعطيل انزيم لمدة 10 دقيقة عند 70 درجة مئوية.
وقف ثانيا : تخزين الخليط في ربط -20 درجة مئوية أو الشروع في الخطوة بالعاثية التعبئة والتغليف.
ملاحظة : ربط رد فعل واحد وسوف تنتج 10 3 6 -10 استنساخ اعتمادا على نوعية من الحمض النووي البيئية. استنادا إلى العدد المقدر للاستنساخ ما هو مطلوب لتغطية معينة ، يمكنك توسيع نطاق التفاعل الربط. إذا تم تحجيم ربط ما يصل ، ثم يجب أن تقاس كمية استخراج التعبئة والتغليف وفقا لذلك حتى فج كما هو موضح أدناه.
الخطوة الثالثة
الجزء 1 : بالعاثية التعبئة والتغليف من الناتج ربط ناقلات إدراج
- يومين أو ثلاثة أيام متتالية قبل أن يقصد التغليف بالعاثية المقدمة من EPI300 - T1 سلالة R الطلاء على طبق LB عادي واحتضان أكثر من ليلة 37 درجة مئوية في الحصول على مستعمرات واحد. يمكن أن تكون مختومة هذا الطبق وتخزينها في 4 درجات مئوية لاستخدامها في المستقبل.
- قبل يوم من 50 مل عبوة تطعيم رد فعل مرق LB + 10 ملي MgSO 4 (إضافة 500 MgSO 1M ميكرولتر 4) مستعمرة واحدة مع واحدة من لوحة إنشاؤها في الخطوة 1. يهز نحو 225 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية خلال الليل.
- اليوم من ردود فعل التعبئة والتغليف تطعيم جديدة مرق LB 50 مل + 10 ملي MgSO 4 مع 5 مل من الثقافة بين عشية وضحاها أعد في الخطوة 2. تنمو بمعدل 37 درجة مئوية إلى 600 من OD 0،8-1،0 والتطوير التنظيمي لا يتجاوز 600 من 1.0! تمييع عينتك قبل القياس على معمل بحيث تحصل على نتيجة دقيقة. خلايا تخزين على الجليد أو على 4 درجات مئوية حتى استخدام إضافية.
ملاحظة : إيقاف ثالثا : قد تكون مخزنة الثقافة في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 72 ساعة إذا لزم الأمر ، واستخدام ولكن ثقافة جديدة نشأت من المستحسن بشدة. - ذوبان الجليد ، على الجليد ، قامت تغليف امدا مقتطفات MaxPlax ، 1 أنبوب لربط كل رد فعل من قبل. وسوف يستغرق ذوبان 10-15 دقيقة. وفي الوقت نفسه ، وضع أنبوب 1.5 مل على الجليد قبل أن تكون مبردة.
ملاحظة : لا تترك بالعاثية إذابة الجليد على فترة طويلة جدا. وإلا سوف بالعاثية كفاءة عدوى الهبوط. - إذابة مرة واحدة على الفور نقل 25 ميكرولتر من استخراج كل العبوة الثانية قبل مبردة أنبوب 1.5 مل microfuge ومكان على الجليد. عودة المتبقية استخراج العبوة -- 80 درجة مئوية.
ملاحظة : لا تقم بتخزين استخراج التعبئة مع الثلج الجاف أو أي مصدر CO 2. - أضف 10 ميكرولتر من رد الفعل إلى ربط كل ميكرولتر 25 من مقتطفات إذابة على الجليد. مزيج من قبل pipetting الحل عدة مرات ، وتجنب إدخال فقاعات الهواء. أنابيب الطرد المركزي لفترة وجيزة للحصول على كل السائل إلى أسفل الأنبوب ، والتغليف احتضان ردود الفعل عند 30 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. بعد 80 دقيقة من دفء حضانة المتبقية استخراج التعبئة والتغليف على الجليد.
ملاحظة : استخدام حمام ماء بدلا من كتلة التدفئة للخطوة 30 درجة مئوية الحضانة. - بعد 90 دقيقة رد فعل التعبئة والتغليف اكتمال إضافة المتبقية البالغة 25 ميكرولتر من التعبئة والتغليف لاستخراج كل أنبوب التفاعل. ردود فعل لاحتضان 90 دقيقة إضافية حتى 30 درجة مئوية. بعد 90 دقيقة حضانة إضافة 100 ميكرولتر من الاحتياطي بالعاثية التخفيف أعدت في كل أنبوب التغليف والمزيج بلطف.
ملاحظة : إذا كانت لديك الكفاءة ينبغي أن تكون منخفضة في النهاية ، مقتطفات بالعاثية الخاصة بك قد تكون قديمة جدا أو تعرضوا لجليد جاف أو أي مصدر CO 2. في تجربتنا ، والتغليف فج في درجة حرارة الغرفة (2 مرات 90 دقيقة) بدلا من 30 درجة مئوية تليها الحضانة إضافي النهائي لمدة 2 ساعة على 30 درجة مئوية زيادة كمية الحيوانات المستنسخة الناتجة عن ذلك. - إضافة 5 ميكرولتر من كلوروفورم لكل أنبوب ، وأدى المزيج برفق في الحجم الإجمالي من 165 ميكرولتر في الأنبوب. قد يعجل لزج النموذج بعد إضافة كلوروفورم ، وهذا لن يتدخل مع إنتاج المكتبة. تجنب ولكن هذا فضلا عن التعجيل في المرحلة كلوروفورم العضوية عند pipetting الجزيئات فج.
وقف رابعا : عند هذه النقطة قد تكون مخزنة في جزيئات بالعاثية حزم لعدة أيام في 4 درجات مئوية.
ملاحظة : للحصول على كفاءة أفضل فج العدوى ، واستخدام حزم بالعاثية حديثا.
الجزء 2 : العدوى من E. استضافة المكتبة القولونية
- إضافة إلى حزم بالعاثية EPI300 T1 - R الخلايا المضيفة (OD 600 = 0،8-1،0) في النسبة من 400 ميكرولتر من الخلايا EPI300 R - T1 لكل ميكرولتر 10 من جسيمات فج. لتجنب أي pipetting كلوروفورم نستخدم 125 ميكرولتر من الجزيئات بالعاثية حزم و 5 مل من إعداد EPI300 T1 - R الخلايا المضيفة. المزيج برفق ثم احتضان في 37 دقيقة لمدة 30 درجة مئوية.
ملاحظة : يجب الحرص على عدم نقل كلوروفورم إلى الخلايا المضيفة عند إزالة الجسيمات من فج فج أنبوب التغليف. إذا كنت غير متأكد ، تستغرق أقل من الجسيمات بالعاثية تعبئتها.
الجزء 3 : التصفيحات وtitering
- إضافة 5-7 الخرز الزجاجي المعقم على أربعة LB الصغيرة + 12.5 ميكروغرام / مل أطباق بتري الكلورامفينيكول.
- انتشار مرتين 50 ميكرولتر ومرتين 10 ميكرولتر من فج المصابة EPI300 R - T1 الخلايا على أربع لوحات منفصلة. حتى لضمان الانتشار ، وإضافة بعض مرق LB (~ 50 ميكرولتر) لوحات مع ميكرولتر 10 من الخلايا المصابة فج. يهز أفقيا لوحة موزعة بالتساوي على خلايا على طبق من ذهب. السماح لوحة جافة لمدة 15 دقيقة ثم إزالة الخرزات التي بليت قلب.
ملاحظة : تستخدم هذه الصفائح لتحديد عدد وtransformants لحساب التخفيفات المناسبة اللازمة في مستعمرة خطوة لتجنب التقاط كثافة عالية جدا مستعمرة. - وضع لوحات رأسا على عقب في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 16 إلى 24 ساعة إلى 48 ساعة حتى شكل مستعمرات. الاختيار لوحات بعد 24 ساعة لمنع استنساخ سريع النمو المتزايد في المستعمرات المجاورة.
- وفي الوقت نفسه ، حصاد الخلايا المتبقية اليسار أكثر من 5 مل العدوى عن طريق الطرد المركزي في 3500 ز لمدة 10 دقائق على 4 درجات مئوية. تجاهل طاف. LB إضافة 1 مل / الجلسرين 20 ٪ إلى الأنبوب. اعادة تعليق الخلية بيليه وقسامة إلى 100 لكل ميكرولتر في أنابيب 2 مل cryovial. تجمد على الفور وتخزينها في -80 درجة مئوية لاستخدامها مرة أخرى في مستعمرة اختيار الخطوة.
- اليوم التالي ، وحساب عدد من الحيوانات المستنسخة على لوحات وتحديد عيار. تأكد من تضمين عامل تخفيف الصحيحة لحساب المبلغ الإجمالي للfosmid - الحيوانات المستنسخة.
ملاحظة : هذا الإجراء يولد بين 10،000 و 50،000 fosmid - الحيوانات المستنسخة في المجموع ؛ لكن اعتمادا على جودة ونقاء من الحمض النووي المستخرج البيئية ، وهي تتراوح ما بين 3000 إلى 80000 استنساخ fosmid يلاحظ.
الخطوة الرابعة
الجزء 1 : آجار ، وإعداد لوحات جيدة
- صب سائل الإعلام في لوحات على النحو التالي ؛ تشمل 12.5 ميكروغرام لكل الكلورامفينيكول LB مل :
- 100X15mm طبق بتري : 25mL آغار LB
- 150X15mm طبق بتري : 50mL آغار LB
- لوحة مربعة 245X245mm الأحيائي : 250mL آغار LB
- تحسن الأسهم الخاصة بك تحتوي على الجلسرين استنساخ أعد fosmid على الجليد. انتشار المبلغ المناسب للوحة التي تريد استخدامها على أساس عيار الخاص المحسوبة (إعداد الأوراق المالية بالإضافة إلى الجلسرين يركز خلاياك ~ 5 مرات). فترة حضانة لنمو الخلايا هو 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
وقف الخامس : عندما شكلت المستعمرات ، وتخزين لوحات أجار مختومة في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد حتى يتم استخدامها في خطوة اختيار مستعمرة.
ملاحظة : يجب أن المستعمرات تنتشر بشكل متساو ، وهو ما يكفي بعيدة عن بعضها البعض ، ويجب أن ينمو حوالي 1 ملم في القطر. ويمكن طلاء الخلايا باستخدام الخرز الزجاجي إنشاء فصل جيدة بين المستعمرات. على طبق بيتري 100X15mm ، 150 ~ 250 المستعمرات عادة هي أعلى كثافة جيدة لاختيار الكفاءة والروبوت لمدة 22 سم 22 × ، ينبغي الحصول على أي مستعمرات أكثر من 2000. - في أيام قطف مستعمرة ، وإعداد 96 أو 384 لوحات مليئة جيدا مرق LB تستكمل مع الكلورامفينيكول ميكروغرام 12.5 في مرق مل كذلك الجلسرين 20 ٪ بالنسبة للتخزين في مكتبة -80 درجة مئوية. تمتلئ الصفائح بشكل جيد مع النظام الآلي لوحة QFill3 ملء كما هو موضح أدناه.
- الأوتوكلاف 2 مجموعات من نفايات وقوارير زجاجية (500 مل) ، والأغطية والأنابيب السيليكون. لا مشعب الأوتوكلاف ، بما في ذلك التجمع الإبرة وشفة في تصاعد مستمر. التجمع بالقرب من QFill3 بنسن لهب الموقد أو داخل غطاء لخلق والحفاظ على بيئة معقمة.
ملاحظة : تأكد من أن يتم إدخال أنبوب السيليكون في صمام قرصة قرصة عن طريق الضغط على صمام المنشط وانزلاق الأنبوب كاملا في الصمام. (وهذا يعمل مثل كابح للاستغناء المتوسطة إلى العمود التالي). - تعقيم الإبر الاستغناء بعبورها مل 50 ~ من المبيض بنسبة 1 ٪ ، تعقيمها درهم 2 O والايثانول 80 ٪ ، واحد في كل زمان ومكان غطاء مربع تلميح على منصة لجمع النفايات الحلول. بعد التعقيم ، وتغيير في مجموعة أخرى تتكون من أنابيب الزجاجة ، الغطاء والسيليكون.
- ملء زجاجة مع المتوسط ~ مل 300. يكفي تشغيل المتوسطة من خلال التخلص من أي الإيثانول المتبقية من الخطوة التنظيف. مرة واحدة يتم تنظيف الأنبوب ، تحميل 96/384 طبق بشكل جيد على المنصة. اضغط على "بدء" لتملأ صحنك ، وينبغي تعبئة كل جيدا مع 200 ميكرولتر من مرق LB المعدة. لتنظيف الإبر وصرفها ، وتشغيل ~ 50 مل من الايثانول 80 ٪ من خلال.
ملاحظة : تأكد من هو المسمى صحنك جيدا قبل التعبئة.
الجزء 2 : إعداد مستعمرة الروبوت قطف
- نحن نستخدم استنساخ اختيار الروبوت QPix2 ميلانحبال إلى دليل المستخدم ليالي. يجب أن يكون المستخدمون على دراية التعامل مع الروبوت ، وكيفية إعداد كل شيء لضمان أعلى كفاءة قطف.
- لخلق بيئة معقمة حول استنساخ مجال قطف ، بدوره على ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة. في حين أن ضوء الأشعة فوق البنفسجية على ، وإعداد 500 مل من المبيض بنسبة 1 ٪ ، 500 مل من العقيمة O 2 درهم و 500 مل من الايثانول 80 ٪. عندما تغلق ملء ضوء الأشعة فوق البنفسجية تصل قبالة الأدراج كما وصفت. تصب دائما في الحلول الأدراج حل المسمى بشكل صحيح. من الخلف إلى الأمام في ملء التبييض 1 ٪ ، ثم تعقيمها درهم 2 O و 80 ٪ من الإيثانول في الدرج الأمامي. تأكد من أنها كاملة. لا يمكن التقاط الإبر أن تغسل بشكل صحيح من دون حل غسل كافية.
ملاحظة : رصد 80 ٪ من الإيثانول مع مرور الوقت. سوف تتبخر ، وتحتاج إلى وتصدرت أعلى. - بعد إعداد المعلمات لاختيار الأمثل ، ووضع لوحات أجار أعدت مع الحيوانات المستنسخة fosmid وكذلك بين لوحات وظيفة في مجال العمل Q - PIX. تأكد من أن كنت قد اتخذت كل لوحة تغطي قبالة!
- لوحات ينبغي مشددة ضد الزاوية الأمامية اليمنى ، ولذا فإنه لا يمكن أن تتحرك خلال قطف. ثم أغلق اللوحة الأمامية.
ملاحظة : هذا أمر مهم للغاية! - حالما يتم تعيين كافة معلمات الإجراء يمكن أن يبدأ قطف. عندما يتم الانتهاء من جميع قطف شطف فرش والصواني مع الماء منزوع الأيونات ووضع على مقاعد البدلاء لتجف. تنظيف أي انسكابات التي قد حدث ، والقضاء عليها من الداخل Q - بيكس مع الايثانول 80 ٪.
الجزء 3 : الحضانة ليلة وضحاها وتخزين مكتبة
- ضمان أن يتم تسمية كافة لوحات الأسهم الجلسرين ، ووضعها في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. ترك مذكرة حول الحاضنة التي تحتوي على التاريخ ، وعدد من لوحات المحتضنة ، والوقت من الحضانة ، والوقت لإزالة والأحرف الأولى الخاص بك.
- لتخزين وقت طويل ، وضع حضانات نمت بين عشية وضحاها الى الثلاجة -80 درجة مئوية.
ممثل النتائج :
قدمت بروتوكول يصف الإجراء كيفية إنشاء المكتبة البيئية fosmid لالتقاط المحتوى الجيني للمجتمع الميكروبية في موطن معين. ينبغي لهذا البروتوكول إنشاء مكتبة fosmid وهو ممثل إلى المحتوى الجيني للعينات البيئة ، وينبغي تمكين القارئ لتعديل وتحسين خطوات حاسمة إذا كانت كمية استنساخ fosmid حصلت في نهاية الإجراء بأكمله منخفض جدا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ووصف الإجراء كيفية بأكبر قدر من الكفاءة إنشاء مكتبة واسعة مع إدراج fosmid الحمض النووي الجيني المستمدة من عينة المياه الساحلية. يوصف أعلى المصب استخراج الحمض النووي الجيني في بروتوكول منفصل [3].
حيث بلغ الإنتاج fosmid مكتبة هي متعددة الخطوات ، العملية ، خطة على الأقل أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع في الوقت المناسب لإجراء العملية برمتها بما في ذلك جميع الخطوات الأربع المقدمة. استخراج الحمض النووي الجيني هي الخطوة الأكثر أهمية وجميع تيار أسفل الخطوات تعتمد على نوعية وكمية من الحمض النووي المستخرج الجينومية ؛ النظر في ذلك الإنفاق على ما يكفي من الوقت لهذه الخطوة والعمل بعناية. الجودة ومراقبة كمية من الحمض النووي المستخرج الخاص مهم جدا. يمكن أن يحدث أن عدد الحيوانات المستنسخة fosmid منخفضة خاصة إذا كان هذا هو أول مكتبة كنت تسير على القيام بها. وبناء مكتبة fosmid في حد ذاته على التوالي إلى الأمام ، هو سبب فشل أساسا من نوعية غير كافية و / أو كمية من الحمض النووي المستخرج الخاص الجينومية وتنقيته. لإعادة النظر في استخراج الحمض النووي الجيني وإيلاء اهتمام خاص إلى الخطوات المتبعة في تنقية والحمض النووي استرداد البناء الخاص اذا المكتبة لم يكن ناجحا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدي أي شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
نود أن نشكر المؤسسة الكندية للإبداع ، ومعارف كولومبيا البريطانية وصندوق التنمية الوطنية للعلوم والهندسة مجلس البحوث (NSERC) من كندا لدعم الدراسات الجارية على المناطق المنخفضة من الأوكسجين مياه المحيطات والمناطق الساحلية المفتوحة. ودعمت طن متري والزمالات التي SL من مركز تولا مؤسسة ممولة للتنوع وتطور الميكروبية (CMDE). كما تلقى دعم MT الزمالة من جمعية الألمانية للبحوث (DFG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Step II | |||
| CopyControl™ Fosmid Library Production Kit | Epicentre Biotechnologies | CCFOS110 | sufficient to generate 9-10 fosmid libraries |
| SeaPlaque Agarose | Cambrex | 50100 | |
| stirring hot plate | Corning | PC-420D | |
| 1.0X TAE running buffer | |||
| CHEF Mapper XA pulsed field electrophoresis system including cooling module and variable speed pump | Bio-Rad | ||
| λ DNA-HindIII Digest | New England Biolabs | N3012S | |
| MidRange I PFG Marker | New England Biolabs | N3551S | |
| 10,000X SYBR Gold | Invitrogen | S11494 | |
| microwavable plastic wrap | Saran premium wrap | ||
| Safe Imager transilluminator | Invitrogen | S37102 | |
| GELase Agarose Gel-Digesting Preparation | Epicentre Biotechnologies | G09100 | |
| scalpel | Fisher Scientific | 08-927-5D | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | EMD Millipore | UFC801024 | |
| Microcon YM-30 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | 42410 | |
| nuclease free water | Ambion | AM9932 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit *2000 assays*# | Invitrogen | P7589 | |
| digital dry block heater | VWR international | 12621-088 | |
| water bath | VWR international | 14231-854 | |
| centrifuge | Beckman Coulter Inc. | Avanti J-E | |
| centrifuge rotor | Beckman Coulter Inc. | JA 5.3 | |
| table top centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| microcentrifuge tubes, 1.7 mL, clear | Axygen Scientific | MCT-175-C | |
| 15 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 430052 | |
| Step III | |||
| LB broth | Fisher Scientific | BP 1426-2 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| phage dilution buffer | 10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2 | ||
| cryogenic vials | Fisher Scientific | 430488 | |
| Step IV | |||
| 96 well plate with lid | Fisher Scientific | CS003370(3370) | |
| 384 well plate with lid | Fisher Scientific | 07201157(3680) | |
| Petri dishes 100 O.D. x 15mm H | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Petri dishes 150 Dia. x 15mmH | Fisher Scientific | 08-757-14 | |
| BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mm | VWR international | CABD351040 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| LB broth | Fisher Scientific | BP 1426-2 | |
| Difco Agar | BD Biosciences | 214530 | |
| glass beads | Fisher Scientific | 10-310-1 | |
| QFill3 | Genetix | X3050 | |
| Bleach | Javex | ||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 430052 | |
| QPix colony picker | Genetix | QPix2 | |
| picking head (E. coli) | Genetix | X4006 |
References
- Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J.
- Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
- Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation. J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).
- Stein, J. L., Marsh, T. L., Wu, K. Y., Shizuya, H., DeLong, E. F. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J. Bacteriol. 178, 591-599 (1996).
- Béjà, O., Suzuki, O., Koonin, M. T., Aravind, E. V., Hadd, L., Nguyen, L. P. A., Villacorta, R., Amjadi, M., Garrigues, C., Jovanovich, S. B., Feldman, R. A., DeLong, E. F. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ. Microbiol. 2, 516-529 (2000).
- DeLong, E. F., Preston, C. M., Mincer, T., Rich, V., Hallam, S. J., Frigaard, N. -U., Martinez, A., Sullivan, M. B., Edwards, R., Brito, B. R., Chisholm, S. W., Karl, D. M. Community genomics among stratified microbial assemblages in the Ocean's interior. Science. 311, 496-503 (2006).
- Hallam, S. J., Putnam, N., Preston, C. M., Detter, J. C., Rokhsar, D., Richardson, P. M., DeLong, E. F. Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics. Science. 305, 1457-1462 (2004).
