Summary
पर्यावरण जीनोमिक डीएनए के साथ एक मौसम hypoxic fjord के ऊर्ध्वाधर गहराई सातत्य से अलग fosmid पुस्तकालय के निर्माण में वर्णित है. परिणामस्वरूप क्लोन पुस्तकालय 384 अच्छी तरह प्लेटें में उठाया है और बहाव और अनुक्रमण के लिए एक स्वचालित कॉलोनी उठा प्रणाली के आवेदन से कार्यात्मक स्क्रीनिंग संग्रहीत.
Protocol
Fosmid पुस्तकालय निर्माण के चार मुख्य चरणों और कई भागों (एक सिंहावलोकन के लिए Fig.1 देख) में उप - विभाजित में बांटा गया है.
मैं चरण ([3] "0.22 सुक्ष्ममापी Sterivex फिल्टर से डीएनए निष्कर्षण" देख प्रोटोकॉल)
भाग 1: एनजाइम उत्प्रेरित सेल lysis
भाग 2: पर्यावरण डीएनए के CSCL घनत्व ढाल centrifugation और डीएनए वसूली द्वारा शुद्धीकरण
भाग 3: जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा निकाले डीएनए के गुणवत्ता नियंत्रण
द्वितीय चरण
भाग 1: बरामद पर्यावरण डीएनए के enzymatic संशोधन कदम
सभी कदम पर्यावरण डीएनए के अंत मरम्मत के लिए आवश्यक अभिकर्मकों pCC1 EPICENTRE से Fosmid लाइब्रेरी उत्पादन किट में शामिल हैं. आदर्श रूप में, अपने जीनोमिक डीएनए 0.5 μg / μl समायोजित किया जाना चाहिए.
- बर्फ पर सभी अभिकर्मकों पहले गला लें, निम्नलिखित गठबंधन और संक्षिप्त ट्यूब अपकेंद्रित्र नीचे सभी तरल:
- एक्स μl बाँझ पानी
- 8 μl 10X बफर अंत मरम्मत
- 8 μl 2.5 मिमी dNTP मिश्रण
- 8 μl 10 मिमी एटीपी
- 20 μg डालने डीएनए (~ 0.5 μg μl /) sheared
- 4 μl एंजाइम अंत मरम्मत मिश्रण
- 80 μl कुल प्रतिक्रिया मात्रा
- 45 मिनट की एक न्यूनतम 60 मिनट और गर्मी 70 में एंजाइम मिश्रण निष्क्रिय करने के लिए समय के लिए कमरे के तापमान पर सेते ° 10 मिनट (मतलब समय में, अंत मरम्मत के बाद आकार के चयन के लिए एक कम पिघलने agarose जेल तैयार के लिए सी डीएनए, नीचे देखें).
भाग 2: स्पंदित क्षेत्र जेल वैद्युतकणसंचलन (PFGE) द्वारा जीनोमिक डीएनए के आकार - चयन
- 1.0X TAE के 150 एमएल में कम पिघलने agarose के 1.5 ग्राम पुनः निलंबित बफर चल रहा है और एक छोटे चुंबकीय हलचल पट्टी को जोड़ने. फ्लास्क microwavable प्लास्टिक की चादर के साथ कवर और माइक्रोवेव में जल्दी उबालें जब तक agarose पूरी तरह से भंग है. समाधान हलचल जब तक यह काफी ठंड के लिए जेल ट्रे में डाल देना है (~ 60 डिग्री सेल्सियस).
नोट: ethidium या या तो जेल में या चल रहे बफर में SYBR गोल्ड ब्रोमाइड शामिल नहीं है. - जेल ट्रे इकट्ठा करने के लिए अपने जेल डाली और एक कंघी जो आप पर्याप्त जगह देने के लिए एक अयस्क दो कुओं (लोडिंग बफर के 80 μl अधिक उचित मात्रा) में पूरा मिश्रण अंत मरम्मत लोड करने के लिए चुन.
- वैद्युतकणसंचलन चेंबर में 1.0X TAE के 2.2 एल डालो और मशीन पर बारी के लिए चल बफर प्रसारित और 14 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा डिवाइस सेट पंप 70 rpm पर चलाने के लिए चल रहा है बफर के लिए पर्याप्त परिसंचरण सुनिश्चित करना चाहिए और 14 में बफर रखने डिग्री सेल्सियस
- पिघला agarose जेल ट्रे में एक अच्छी तरह से समतल सतह पर एक बार यह ठंडा है डालो और तुम बुलबुले से बचने सुनिश्चित करें. सुनिश्चित करें पिघला agarose जेल कंघी पर भी है, अन्यथा कंघी को हटाने और यह पिघल agarose में वापस डाल दिया. एक बार जेल जम है, कंघी को हटाने और एक midrange मैं जेल के चौथे कुएं में मार्कर PFG लोड. जेल सिरिंज से बाहर निकालना agarose और एक स्केलपेल के साथ अंत से एक छोटा सा प्लग टुकड़ा. अच्छी तरह से सामने प्लग प्लेस और पिघला हुआ agarose के साथ सील. जेल वैद्युतकणसंचलन कक्ष में रखें.
नोट: आपके agarose जेल बहुत ध्यान से कम पिघलने जैल ब्रेक के रूप में आसानी से संभाल. अगर चल रहा है बफर नीचे से 14 डिग्री सेल्सियस से पहले ठंडा है आप अपने जेल लोड हो रहा है शुरू की जाँच करें. यदि आपके कुओं agarose द्वारा अवरुद्ध देखो, निम्न अगली बार कोशिश: इससे पहले कि आप जेल से कंघी को हटाने, कंघी के आसपास 1-2 एमएल TAE बफर जोड़ने, यह अच्छे कुओं में परिणाम देगा. - पहले λ HindIII पचाने में की अच्छी तरह से लोड 5 μl fosmid नियंत्रण आकार मार्कर के 1 μl (EPICENTRE, 100 एनजी / μl) के द्वारा पीछा किया. बाँझ पानी के 10 μl एक microcentrifuge ट्यूब में आकार मार्कर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से लोड हो रहा है बफर का एक उचित मात्रा में जोड़ें. बड़ी मात्रा में यह आसान जेल लोड करने के लिए बनाता है. सीधे fosmid मार्कर के बगल में लोड अपने अंत की मरम्मत और गर्मी निष्क्रिय लोड हो रहा है बफर का एक उचित मात्रा के साथ मिश्रण. ढक्कन और सेटिंग्स प्रोग्राम बंद करें.
नोट: हम वास्तव में अन्य डीएनए सीढ़ी के विभिन्न मात्रा में लोड करने के लिए मोटे तौर पर डीएनए की मात्रा मात्रा ठहराना करने के लिए या अपने जीनोमिक डीएनए के बाल काटना की हद तक कल्पना की सलाह देते हैं. आदर्श आकार मार्कर λ डीएनए HindIII डाइजेस्ट और midrange मैं PFG मार्कर (ठोंग से दोनों) कर रहे हैं. - प्रोग्राम सेटिंग्स का उपयोग करें: ऑटो एल्गोरिथ्म यदि आपका PFGE इस प्रणाली के साथ सुसज्जित है. प्रोग्राम स्वचालित रूप से सेटिंग आप एक दिया आकार सीमा के डीएनए अलग की जरूरत है की गणना. डीएनए आकार सीमा 2-250 Kb; अंशांकन का पहलू:: इस्तेमाल किया सेटिंग्स रहे हैं 1, ग्रेडिएंट: समय [6 वी / सेमी]; चलाते समय: अंतिम स्विचन; 0.1 सेकंड: 12:00 बजे;:; शामिल कोण 120 ° प्रारंभिक स्विचन समय : 21.79 सेकंड; ramping कारक एक = रैखिक.
- अपने डीएनए कल्पना करने के लिए, एक कंटेनर में 1.0X TAE बफर के 250 एमएल डालना और 10.000X SYBR गोल्ड की 25 μl जोड़ने, धीरे मिश्रण से पहले आप समाधान में अपनी जेल जगह है. अंधेरे के रूप में SYBR गोल्ड संवेदनशील प्रकाश में 1 घंटे के लिए अपनी जेल दाग.
नोट: अपने एक संभालgarose जेल बहुत सावधानी के रूप में कम पिघलने जैल आसानी से ब्रेक.
भाग 3: जेल और बरामद डीएनए के निष्कर्षण ligation द्वारा fosmid क्लोनिंग सदिश डीएनए वसूली
इस भाग के लिए सभी अभिकर्मकों EPICENTRE उत्पादन fosmid पुस्तकालय किट में शामिल हैं.
- मतलब समय में 70 पर एक पानी स्नान तैयार डिग्री सेल्सियस और एक 45 ° सी जेल पाचन कदम के लिए.
- एक खाली tared microcentrifuge ट्यूब और नीले प्रकाश transilluminator के लिए एक बाँझ स्केलपेल के साथ अपने दाग जेल के साथ ले लो. कल्पना अपने अंत मरम्मत जीनोमिक डीएनए और fosmid नियंत्रण आकार मार्कर. एक स्केलपेल है कि साथ और थोड़ा ऊपर fosmid नियंत्रण आकार मार्कर की स्थिति (एक जेल उत्पाद टुकड़ा जो 5-7 मिमी चौड़ा है) चले गए और tared microcentrifuge ट्यूब टुकड़ा हस्तांतरण के साथ एक आबकारी जेल टुकड़ा. एक midrange मैं अपने जेल पर मार्कर PFG के रूप में इस मदद करता है आप बहुत अधिक जेल नहीं कटौती करने के लिए चलाएँ.
नोट: नीले प्रकाश transilluminator पर प्लास्टिक की चादर बिछाने से पहले आप इसे पर अपने जेल डाल पार संदूषण को रोकने के लिए और नीले प्रकाश पर बदल से पहले देखने चश्मा पहनने. उत्पाद जेल स्लाइस जहां जीनोमिक डीएनए fosmid नियंत्रण आकार मार्कर की तुलना में छोटे है के रूप में इस अवांछित chimeric क्लोनों में परिणाम होगा मत करो.
तुम में कटौती और पूरे जीनोम बन्दूक या बीएसी पुस्तकालयों, क्रमशः के निर्माण के लिए कम या अधिक आणविक वजन डीएनए युक्त जेल स्लाइस स्टोर कर सकते हैं.
मैं बंद करो: बरामद जेल टुकड़ा (एस) -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है एक वर्ष के लिए - Tared ट्यूबों वजन और जेल टुकड़ा (एस) के वजन की गणना. Agarose के 1 मिलीग्राम पिघला हुआ agarose के लगभग 1 μl निकलेगा.
- कम पिघलने एक पानी के स्नान में 70 डिग्री सी 10-15 मिनट के लिए (हम gelase बफर जोड़ नहीं है). पर अपने जीनोमिक डीएनए युक्त agarose पिगलो के बाद अपने जेल टुकड़ा पूरी तरह से पिघल रहा है, ट्यूब जल्दी हस्तांतरण से 45 डिग्री सेल्सियस
नोट: अपने नमूना भंवर के रूप में यह हो सकता है अपने डीएनए कतरनी भंग मदद नहीं करते. - 1 पिघला agarose के 100 μl प्रति GELase एनजाइम तैयार यू (1μl) जोड़ें. 1 घंटे के लिए 45 ° C पर सेते हैं और फिर अधिक GELase (2-4 μl) जोड़ सकते हैं और एक अतिरिक्त घंटे के लिए सेते हैं. 70 GELase एनजाइम तैयार निष्क्रिय हीट ° सी 10 मिनट के लिए.
10 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब प्लेस और 15 मिनट के लिए गोली किसी भी अघुलनशील कणों के लिए अधिकतम गति (13,000 rpm) ट्यूब अपकेंद्रित्र. ध्यान से ऊपरी सतह पर तैरनेवाला हटाने और यह एक 15 एमएल फाल्कन ट्यूब को हस्तांतरण और ट्यूब बाँझ पानी के 3 एमएल जोड़ने.
नोट: किसी भी pelleted agarose pipetting से बचें. जैसा कि हम और अधिक GELase की तुलना में किट, हम में आदेश अतिरिक्त GELase एनजाइम अलग तैयारी में शामिल जोड़ें. - Amicon अल्ट्रा 4-Ultracel-10 झिल्ली के साथ केन्द्रापसारक फ़िल्टर यूनिट समाधान स्थानांतरण और 4,000 g पर 6-8 मिनट के लिए ट्यूब और स्पिन के माध्यम से प्रवाह त्यागें. फिल्टर पर समाधान की राशि तक लगभग 100 से कम है अपकेंद्रित्र ~ 500 μl. खाली फाल्कन ट्यूब करने के लिए ऊपर से बाँझ पानी की एक और 3 एमएल जोड़ें Amicon ट्यूब के समाधान के हस्तांतरण और centrifugation कदम दोहराएँ. पानी की 3 एमएल के साथ एक तीसरी बार धो और प्रवाह के माध्यम से फिर से त्यागें. 100 μl - 50 के लिए अंतिम मात्रा कम करें.
नोट: हम centrifugation कदम के लिए एक झूलते बाल्टी रोटर का उपयोग, बस में एक 50 एमएल फाल्कन ट्यूब Amicon केन्द्रापसारक फिल्टर यूनिट centrifugation के दौरान जगह में इसे पकड़ के लिए जगह है. Amicon फिल्टर सुरक्षित रूप से फिल्टर पर समाधान का 50 μl विस्तारित centrifugation के बाद भी बरकरार रखती है. - Amicon ट्यूब से एक पूर्व धोया Microcon YM-50 केन्द्रापसारक फ़िल्टर यूनिट में शेष डीएनए समाधान और स्थानांतरण बाँझ पानी की एक अतिरिक्त 50 μl सभी डीएनए की वसूली के साथ Amicon ट्यूब कुल्ला. अपकेंद्रित्र Microcon YM 10,000 जी पर एक microcentrifuge में 50 केन्द्रापसारक फ़िल्टर यूनिट जब तक फ़िल्टर अभी भी थोड़ा तरल के साथ कवर किया गया है. हर मिनट की जाँच करें अगर केवल तरल पदार्थ की एक छोटी राशि फ़िल्टर पर छोड़ दिया है. फिल्टर उल्टा मुड़ें नीचे और एक ताजा microcentrifuge ट्यूब में 3 मिनट के लिए 1,000 g पर दूसरी centrifugation कदम के द्वारा अपने डीएनए समाधान की वसूली. परिणामस्वरूप मात्रा में कुल 10-15 μl अधिक नहीं होनी चाहिए, अन्यथा आपके डीएनए भी ligation चरण में पतला हो सकता है.
नोट: करने के लिए अपने फ़िल्टर डिवाइस नहीं स्पिन करने के लिए सूखापन पूरा करने के लिए सावधान रहना. यदि आपके झिल्ली सूखी है, तो झिल्ली पर 10-15 μl पानी जोड़ने के लिए, 30 सेकंड के लिए धीरे आंदोलन और ऊपर वर्णित के रूप में अपने डीएनए की वसूली. - यों NanoDrop या PicoGreen परख द्वारा अपने परिणामस्वरूप डीएनए समाधान.
- बरामद मरम्मत अंत डीएनए क्लोनिंग pCC1 fosmid वेक्टर ligated बनने के लिए तैयार है. बर्फ पर निम्नलिखित समाधान पहले गला लें, और सुनिश्चित करें कि वेक्टर दाढ़ अनुपात सम्मिलित है 10:01 है.
नोट: 0.5 μg pCC1 fosmid वेक्टर ~ 0.09 pmoles वेक्टर.
~ 40 Kb डालने ~ 0.009 pmoles डालने के डीएनए डीएनए के 0.25 μg
Ligation चरण में इस्तेमाल किया डीएनए की मात्रा बढ़ाने से उपयोगी हो सकता है यदि आप केवल कुछ fosmid क्लोन प्राप्त के बाद चढ़ाना ई. संक्रमित हो सकता है कोलाई कोशिकाओं परचयन प्लेटें.
नीचे दिए गए क्रम में अभिकर्मकों जोड़ें और संक्षिप्त ट्यूब नीचे सभी तरल अपकेंद्रित्र, ट्यूब नल और फिर स्पिन:- एक्स μl बाँझ पानी
- 1 μl 10X ligation फास्ट लिंक बफर
- 1 μl 10 मिमी एटीपी
- 1 μl वेक्टर pCC1 fosmid (0.5 μg / μl)
- एक्स μl केंद्रित डालने के डीएनए (0.25 μg)
- 1 μl फास्ट लिंक डीएनए ligase
- 10 μl कुल प्रतिक्रिया मात्रा
- कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए सेते हैं और 70 पर 10 मिनट के लिए एंजाइम को निष्क्रिय गर्मी डिग्री सेल्सियस
द्वितीय बंद करो: -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान ligation के मिश्रण या फेज पैकेजिंग कदम के लिए आगे बढ़ें.
नोट: एक एकल ligation प्रतिक्रिया 10 3 -10 6 क्लोन पर्यावरण डीएनए की गुणवत्ता पर निर्भर करता है उत्पादन होगा. क्लोन है कि विशेष कवरेज के लिए आवश्यक है की अनुमानित संख्या के आधार पर, आप ligation प्रतिक्रिया पैमाने पर कर सकते हैं. यदि ligation बढ़ाया है, तो फेज पैकेजिंग निकालने की राशि को बढ़ाया जाना चाहिए तदनुसार के रूप में नीचे वर्णित है.
चरण III के
भाग 1: वेक्टर डालने ligation उत्पाद के फेज - पैकेजिंग
- दो या तीन दिन पहले फेज पैकेजिंग लकीर इरादा बाहर एक सादे लेग थाली और 37 पर सेते रात खत्म पर EPI300-T1 आर चढ़ाना तनाव प्रदान डिग्री सेल्सियस एकल कालोनियों को प्राप्त करने के लिए. यह थाली और सील किया जा सकता है 4 बजे ° भविष्य के उपयोग के लिए सी संग्रहीत.
- पैकेजिंग प्रतिक्रिया टीका लगाना लेग शोरबा की 50 एमएल पहले दिन + 10 मिमी MgSO 4 चरण 1 में उत्पन्न की थाली के एक कॉलोनी के साथ (500 μl 1M 4 MgSO जोड़) . 225 rpm और 37 ° रातोंरात सी हिलाएँ.
- पैकेजिंग प्रतिक्रियाओं का दिन रातोंरात चरण 2 में तैयार संस्कृति के 5 एमएल के साथ ताजा 50 एमएल लेग + शोरबा 10 मिमी 4 MgSO टीका लगाना . 0.8 की एक 600 आयुध डिपो के लिए 37 ° C पर 1.0 से 1.0 के आगे बढ़ें और अधिक नहीं 600 आयुध डिपो ! स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर मापने इतनी है कि आप एक सटीक परिणाम प्राप्त करने से पहले अपने नमूना पतला. बर्फ पर या 4 में स्टोर कोशिकाओं डिग्री सेल्सियस जब तक आगे किया.
नोट: क्ष्क्ष्क्ष् बंद करो: संस्कृति 4 ° C में संग्रहीत किया जा सकता है 72 घंटा के लिए यदि आवश्यक हो, लेकिन एक ताजा बड़ा हो संस्कृति का उपयोग अत्यधिक की सिफारिश की है. - पिघलना, बर्फ पर, MaxPlax Lambda पैकेजिंग हर ligation प्रतिक्रिया के लिए, 1 ट्यूब अर्क पहले किया जाता है. विगलन 10-15 मिनट लग जाएगा. इस बीच, बर्फ पर 1.5 एमएल ट्यूब जगह पूर्व ठंडा हो.
नोट: बर्फ पर thawed फेज भी लंबी छुट्टी नहीं. अन्यथा फेज संक्रमण दक्षता छोड़ देंगे. - एक बार thawed तुरंत एक दूसरा पूर्व ठंडा 1.5 एमएल microfuge ट्यूब और बर्फ पर जगह के लिए प्रत्येक पैकेजिंग निकालने के 25 μl हस्तांतरण . 80 डिग्री सेल्सियस - शेष पैकेजिंग निकालने लौटें
नोट: सूखी बर्फ या किसी भी अन्य सीओ 2 स्रोत के साथ पैकिंग निकालने की दुकान नहीं है . - Ligation पर बर्फ thawed अर्क के प्रत्येक 25 μl करने के लिए प्रतिक्रिया के 10 μl जोड़ें. समाधान कई बार pipetting द्वारा मिक्स, हवाई बुलबुले शुरू करने से बचें. संक्षेप में ट्यूबों अपकेंद्रित्र ट्यूब के नीचे करने के लिए सभी तरल और 30 में 90 ° मिनट के लिए सी पैकेजिंग प्रतिक्रियाओं सेते हैं. ऊष्मायन बर्फ पर पैकेजिंग निकालने शेष पिघलना के 80 मिनट के बाद.
नोट: 30 डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन कदम के लिए एक पानी के बजाय हीटिंग ब्लॉक स्नान का उपयोग करें. - 90 मिनट पैकेजिंग प्रतिक्रिया के बाद पूरा हो गया है प्रत्येक प्रतिक्रिया ट्यूब पैकेजिंग निकालने के शेष 25 μl जोड़ने. 30 में अतिरिक्त 90 मिनट के लिए सेते प्रतिक्रियाओं डिग्री सेल्सियस के बाद 90 मिनट ऊष्मायन प्रत्येक पैकेजिंग ट्यूब में तैयार फेज कमजोर पड़ने बफर के 100 μl जोड़ने और धीरे मिश्रण.
नोट: यदि अपनी क्षमता के अंत में कम किया जाना चाहिए, अपने फेज अर्क बहुत पुराना हो सकता है या सूखी बर्फ या किसी भी अन्य सीओ 2 स्रोत से अवगत कराया गया है हो सकता है. हमारे अनुभव में, 30 ° C के बजाय कमरे (2 बार 90 मिनट) तापमान 30 पर 2 घंटे के लिए एक अंतिम अतिरिक्त ऊष्मायन द्वारा बाद में फेज पैकेजिंग सेल्सियस परिणामस्वरूप क्लोन की राशि में वृद्धि हुई. - क्लोरोफॉर्म की 5 μl प्रत्येक ट्यूब और धीरे से ट्यूब में 165 μl की कुल मात्रा में जिसके परिणामस्वरूप मिश्रण जोड़ें. एक चिपचिपा वेग क्लोरोफॉर्म अलावा के बाद फार्म का हो सकता है, इस लायब्रेरी के उत्पादन के साथ हस्तक्षेप नहीं करेगा. हालांकि यह रूप में के रूप में अच्छी तरह से कार्बनिक क्लोरोफॉर्म चरण वेग से बचने जब फेज कणों pipetting.
चतुर्थ बंद करो: इस बिंदु पर पैक फेज कणों 4 में कई दिनों डिग्री सेल्सियस के लिए भंडारित किया जा सकता है
नोट: सबसे अच्छा फेज संक्रमण दक्षता के लिए, हौसले से पैक फेज का उपयोग करें.
भाग 2: पुस्तकालय मेजबान ई. के संक्रमण कोलाई
- EPI300-T1 आर मेजबान कोशिकाओं (600 आयुध डिपो 0.8-1.0 =) EPI300-T1 फेज कणों के हर 10 μl के लिए आर कोशिकाओं के 400 μl के अनुपात में पैक फेज जोड़ें . हम पैक फेज कणों और तैयार EPI300-T1 आर मेजबान कोशिकाओं के 5 एमएल के 125 μl का उपयोग किसी भी क्लोरोफॉर्म pipetting से बचने के लिए. धीरे मिलाई और फिर 37 पर सेते ° C 30 मिनट के लिए.
नोट: सावधान रहना करने के लिए नहीं क्लोरोफॉर्म मेजबान कोशिकाओं के लिए जब आप फेज पैकेजिंग ट्यूब से फेज कण को हटाने के हस्तांतरण. यदि आप अनिश्चित हैं, तो पैक फेज कणों के कम ले लो.
भाग 3: चढ़ाना और titering
- चार छोटे + लेग 12.5 μg / एमएल chloramphenicol पेट्री डिश पर 5-7 निष्फल ग्लास मनकों जोड़ें.
- दो बार 50 μl और दो बार चार अलग प्लेटों पर EPI300-T1 अनुसंधान कोशिकाओं को संक्रमित फेज की 10 μl बिखरा हुआ है. भी सुनिश्चित प्रसार करने के लिए, फेज संक्रमित कोशिकाओं के 10 μl के साथ प्लेटों के लिए कुछ लेग शोरबा (~ 50 μl) जोड़ें. हिलाएँ थाली क्षैतिज समान रूप से बाहर फैल करने के लिए थाली पर कोशिकाओं. 15 मिनट के लिए थाली सूखी चलो और तब inverting थाली द्वारा मोती हटायें.
नोट: इन प्लेटों transformants की संख्या का निर्धारण करने के लिए और उपयुक्त कॉलोनी उठा कदम में आवश्यक dilutions के बहुत उच्च कॉलोनी घनत्व से बचने की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है. - प्लेटें उल्टा एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 16 से 24 घंटे के लिए नीचे कालोनियों फार्म जब तक 48 घंटे के लिए प्लेस. 24 घंटे के बाद प्लेटें जाँच करने के लिए पड़ोसी कालोनियों में बढ़ती के तेजी से बढ़ रहा है क्लोन को रोकने.
- इस बीच, अवशिष्ट 5 एमएल संक्रमण से 10 मिनट के लिए 4 में 3,500 ग्राम डिग्री सेल्सियस पर centrifugation द्वारा से अधिक छोड़ दिया कोशिकाओं फसल सतह पर तैरनेवाला त्यागें. ट्यूब 1 एमएल पौंड / 20% ग्लिसरॉल जोड़ें. पुन निलंबित सेल गोली और यह विभाज्य करने के लिए 100 μl 2 एमएल cryovial ट्यूबों में प्रत्येक. तुरंत रुक और -80 पर दुकान डिग्री सेल्सियस कदम उठा कॉलोनी में आगे उपयोग के लिए.
- अगले दिन, प्लेटों पर क्लोन की संख्या गिनती और टिटर निर्धारित. Fosmid क्लोनों की कुल राशि की गणना को सही कमजोर पड़ने कारक शामिल करने के लिए सुनिश्चित करें.
नोट: इस प्रक्रिया 10,000 में कुल 50,000 क्लोन - fosmid के बीच उत्पन्न, तथापि, और निकाले पर्यावरण डीएनए की गुणवत्ता, शुद्धता पर निर्भर करता है, ३,००० के बीच एक सीमा के ऊपर ८०००० fosmid क्लोन मनाया.
चरण चतुर्थ
भाग 1: अग्रवाल और अच्छी तरह प्लेटें तैयारी
- के रूप में प्लेटों में मीडिया डालो, 12.5 एमएल लेग प्रति μg chloramphenicol शामिल हैं:
- 25ml लेग अगर: 100X15mm पेट्री डिश
- 50ml लेग अगर: 150X15mm पेट्री डिश
- 245X245mm वर्ग bioassay प्लेट: 250ml लेग अगर
- अपने ग्लिसरॉल शेयर बर्फ पर तैयार fosmid क्लोन युक्त पहले गला लें. थाली आप अपने गणना टिटर पर आधारित का उपयोग करना चाहते हैं के लिए उचित मात्रा में फैल (ग्लिसरॉल शेयर तैयारी अतिरिक्त आपके ~ 5 गुना कोशिकाओं ध्यान केंद्रित). सेल के विकास के लिए ऊष्मायन समय 37 पर 24 घंटे डिग्री सेल्सियस
वी बंद करो: जब कालोनियों का गठन, एक महीने के लिए 4 ° C में सील अगर प्लेटें जब तक वे कदम उठा कॉलोनी में उपयोग किया जाता है दुकान.
नोट: कालोनियों बाहर फैल समान रूप से एक दूसरे से दूर पर्याप्त की जरूरत है और व्यास में लगभग 1 मिमी बढ़ने चाहिए. ग्लास मनकों का उपयोग करके कक्षों चढ़ाना कालोनियों के बीच एक अच्छा जुदाई उत्पन्न कर सकते हैं. एक 100X15mm पेट्री डिश में, आमतौर पर 150 ~ 250 कालोनियों उच्चतम रोबोट उठा दक्षता के लिए और 22 x 22 सेमी के लिए एक अच्छा घनत्व हैं, कोई 2,000 से अधिक कालोनियों प्राप्त होना चाहिए. - कॉलोनी उठा के दिनों में, 96 या 384 पौंड -80 में 12.5 एमएल शोरबा प्रति μg chloramphenicol के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पुस्तकालय भंडारण के लिए 20% ग्लिसरॉल के साथ पूरक शोरबा ° सी. के साथ अच्छी तरह से भरा प्लेटें तैयार खैर प्लेटें स्वचालित QFill3 थाली भरने प्रणाली के साथ भर रहे हैं के रूप में नीचे वर्णित है.
- आटोक्लेव कांच की बोतलों के 2 सेट (500 एमएल), lids और सिलिकॉन टयूबिंग. सुई विधानसभा और बढ़ते निकला हुआ किनारा सहित कई गुना नहीं, आटोक्लेव करो. एक Bunsen बर्नर लौ के पास या बनाने के लिए और एक बाँझ वातावरण रखने के हुड के भीतर QFill3 इकट्ठा.
नोट: सुनिश्चित करें कि सिलिकॉन टयूबिंग चुटकी वाल्व में चुटकी वाल्व उत्प्रेरक दबाव और वाल्व में पूरी तरह से टयूबिंग फिसलने द्वारा डाला जाता है. (अगले कॉलम के माध्यम वितरण के लिए एक ब्रेक की तरह यह काम करता है). - एक समय में ~ 50 एमएल ब्लीच का 1%, 2 हे DH autoclaved और 80% इथेनॉल, एक के माध्यम से गुजर द्वारा वितरण सुइयों जीवाणुरहित और अपशिष्ट समाधान को इकट्ठा करने के लिए मंच पर एक टिप बॉक्स ढक्कन जगह. नसबंदी के बाद, अन्य बोतल के ढक्कन, और सिलिकॉन टयूबिंग से मिलकर सेट करने के लिए बदल जाते हैं.
- ~ 300 एमएल मध्यम के साथ बोतल भरें. पर्याप्त मध्यम भागो के माध्यम से सफाई कदम से किसी भी शेष इथेनॉल छुटकारा पाने के लिए. एक बार टयूबिंग साफ किया जाता है, मंच पर एक 96/384 अच्छी तरह से थाली लोड. प्रेस "शुरू" करने के लिए अपनी थाली को भरने, हर अच्छी तरह से तैयार लेग शोरबा के 200 μl से भरा जाना चाहिए. साफ वितरण सुई के माध्यम से ~ 80% इथेनॉल के 50 एमएल चलाने.
नोट: सुनिश्चित करें कि आपकी अच्छी तरह से थाली भरने से पहले लेबल है.
भाग 2: कॉलोनी उठा रोबोट सेटअप
- हम रोबोट QPix2 एसी उठा क्लोन का उपयोग कर रहे हैंउपयोगकर्ता पुस्तिका के मुताबिक. उपयोगकर्ता परिचित अपने रोबोट से निपटने और कैसे उच्चतम उठा दक्षता की गारंटी करने के लिए सब कुछ सेट करना चाहिए.
- क्लोन उठा क्षेत्र के चारों ओर एक बाँझ माहौल बनाने के लिए, 30 मिनट के लिए यूवी प्रकाश पर बारी. जबकि यूवी प्रकाश पर है, 1% ब्लीच के 500 एमएल, बाँझ DH 2 हे और 500 एमएल 80% इथेनॉल के 500 एमएल तैयार करते हैं. जब यूवी प्रकाश बन्द हो जाता है बंद ट्रे भरने के रूप में लेबल. हमेशा सही ढंग से लेबल समाधान ट्रे में समाधान डालना. ब्लीच में 1% से वापस सामने करने के लिए भरने, तो DH 2 हे और सामने ट्रे में 80% इथेनॉल autoclaved. सुनिश्चित करें कि वे पूरा कर रहे हैं. उठा सुई पर्याप्त धोने के समाधान के बिना ठीक से नहीं धोया जा सकता है.
नोट: मॉनिटर समय पर 80% इथेनॉल. यह लुप्त हो जाना और सबसे ऊपर की जरूरत होगी. - इष्टतम चुनने के लिए पैरामीटर की स्थापना के बाद, fosmid क्लोन और क्यू Pix काम क्षेत्र में पदों के बीच अच्छी तरह से प्लेटों के साथ तैयार अगर प्लेटें जगह है. सुनिश्चित करें कि तुम ले लिया है सभी प्लेट बंद को शामिल किया गया!
- प्लेट्स सही सामने कोने के खिलाफ तंग किया जाना चाहिए, ताकि इसे उठा दौरान कदम नहीं कर सकते हैं. फिर सामने पैनल बंद.
नोट: यह अत्यंत महत्वपूर्ण है! - एक बार सभी मापदंडों सेट कर रहे हैं उठा प्रक्रिया शुरू कर सकते हैं. जब सब उठा पूरा हो गया है ब्रश और ट्रे विआयनीकृत जल और सेट के साथ पीठ पर सूखी कुल्ला. कि हुई हो सकती है किसी भी फैल साफ है, और नीचे 80% इथेनॉल के साथ क्यू Pix के अंदर पोछ लो.
भाग 3: ओवरनाइट ऊष्मायन और पुस्तकालय का भंडारण
- सुनिश्चित करें कि सभी ग्लिसरॉल स्टॉक प्लेटों में चिह्नित कर रहे हैं, और 37 ° सी इनक्यूबेटर में उन्हें 24 घंटे के लिए जगह है. इनक्यूबेटर पर एक नोट है जिसमें दिनांक, प्लेटों की संख्या incubated, ऊष्मायन के समय, हटाने के लिए समय और अपने इनीशियल्स छोड़ो.
- भंडारण के लिए लंबे समय -80 ° सी फ्रीजर में उगाई रातोंरात incubations डाल दिया.
प्रतिनिधि परिणाम:
प्रस्तुत कैसे प्रक्रिया के लिए एक पर्यावरण fosmid पुस्तकालय के लिए एक भी निवास स्थान में एक माइक्रोबियल समुदाय की आनुवंशिक सामग्री पर कब्जा उत्पन्न प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. इस प्रोटोकॉल एक fosmid पुस्तकालय जो नमूना पर्यावरण की आनुवंशिक सामग्री के लिए प्रतिनिधि है और पाठक को संशोधित करने के लिए और महत्वपूर्ण कदम अनुकूलन सक्षम अगर fosmid पूरी प्रक्रिया के अंत में प्राप्त क्लोन की राशि बहुत कम है चाहिए बनाना चाहिए.
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Discussion
एक प्रक्रिया में वर्णित है कि कैसे सबसे अधिक कुशलता से एक बड़ी सम्मिलित करने के लिए जीनोमिक डीएनए के साथ एक तटीय पानी का नमूना से प्राप्त fosmid पुस्तकालय उत्पन्न करने के लिए. अप स्ट्रीम जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण एक अलग [3] प्रोटोकॉल में वर्णित है.
उत्पादन fosmid पुस्तकालय के रूप में एक multistep प्रक्रिया, योजना सहित सभी चार चरणों प्रस्तुत पूरी प्रक्रिया के लिए समय में कम से कम दो से तीन सप्ताह है. जीनोमिक डीएनए के निष्कर्षण सबसे महत्वपूर्ण कदम है और सभी स्ट्रीम नीचे कदम निकाले जीनोमिक डीएनए की गुणवत्ता और मात्रा पर निर्भर है, इसलिए इस कदम के लिए पर्याप्त समय खर्च करने पर विचार और ध्यान से काम. गुणवत्ता और अपने निकाले डीएनए की मात्रा पर नियंत्रण बहुत महत्वपूर्ण है. यह कि fosmid क्लोनों की संख्या कम है हो सकता है खासकर अगर यह पहली पुस्तकालय आप करने जा रहे हैं कर सकते हैं. से ही fosmid पुस्तकालय निर्माण के रूप में सीधे आगे है, असफलता मुख्य रूप से अपर्याप्त गुणवत्ता और / या अपने निकाले और शुद्ध जीनोमिक डीएनए की मात्रा की वजह से है. जीनोमिक डीएनए फिर से निकालने और शोधन और डीएनए वसूली में शामिल कदम पर विशेष ध्यान देना यदि आपकी लायब्रेरी का निर्माण सफल नहीं था पर विचार करें.
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Disclosures
मैं खुलासा नहीं किया है.
Acknowledgments
हम तटीय और खुले समुद्र के पानी के कम ऑक्सीजन क्षेत्रों पर चल रहे अध्ययन का समर्थन करने के लिए अभिनव, ब्रिटिश कोलंबिया नॉलेज डेवलपमेंट फंड और राष्ट्रीय विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल () NSERC के लिए कनाडा फाउंडेशन धन्यवाद देना चाहूंगा. मीट्रिक टन और SL तुला नींव वित्त पोषित माइक्रोबियल विविधता और इवोल्यूशन (कमोडोर) के लिए केंद्र से फैलोशिप द्वारा समर्थित थे. मीट्रिक टन ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) से भी फैलोशिप समर्थन प्राप्त है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Step II | |||
| CopyControl™ Fosmid Library Production Kit | Epicentre Biotechnologies | CCFOS110 | sufficient to generate 9-10 fosmid libraries |
| SeaPlaque Agarose | Cambrex | 50100 | |
| stirring hot plate | Corning | PC-420D | |
| 1.0X TAE running buffer | |||
| CHEF Mapper XA pulsed field electrophoresis system including cooling module and variable speed pump | Bio-Rad | ||
| λ DNA-HindIII Digest | New England Biolabs | N3012S | |
| MidRange I PFG Marker | New England Biolabs | N3551S | |
| 10,000X SYBR Gold | Invitrogen | S11494 | |
| microwavable plastic wrap | Saran premium wrap | ||
| Safe Imager transilluminator | Invitrogen | S37102 | |
| GELase Agarose Gel-Digesting Preparation | Epicentre Biotechnologies | G09100 | |
| scalpel | Fisher Scientific | 08-927-5D | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | EMD Millipore | UFC801024 | |
| Microcon YM-30 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | 42410 | |
| nuclease free water | Ambion | AM9932 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit *2000 assays*# | Invitrogen | P7589 | |
| digital dry block heater | VWR international | 12621-088 | |
| water bath | VWR international | 14231-854 | |
| centrifuge | Beckman Coulter Inc. | Avanti J-E | |
| centrifuge rotor | Beckman Coulter Inc. | JA 5.3 | |
| table top centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| microcentrifuge tubes, 1.7 mL, clear | Axygen Scientific | MCT-175-C | |
| 15 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 430052 | |
| Step III | |||
| LB broth | Fisher Scientific | BP 1426-2 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| phage dilution buffer | 10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2 | ||
| cryogenic vials | Fisher Scientific | 430488 | |
| Step IV | |||
| 96 well plate with lid | Fisher Scientific | CS003370(3370) | |
| 384 well plate with lid | Fisher Scientific | 07201157(3680) | |
| Petri dishes 100 O.D. x 15mm H | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Petri dishes 150 Dia. x 15mmH | Fisher Scientific | 08-757-14 | |
| BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mm | VWR international | CABD351040 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| LB broth | Fisher Scientific | BP 1426-2 | |
| Difco Agar | BD Biosciences | 214530 | |
| glass beads | Fisher Scientific | 10-310-1 | |
| QFill3 | Genetix | X3050 | |
| Bleach | Javex | ||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 430052 | |
| QPix colony picker | Genetix | QPix2 | |
| picking head (E. coli) | Genetix | X4006 |
References
- Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J.
- Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
- Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation. J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).
- Stein, J. L., Marsh, T. L., Wu, K. Y., Shizuya, H., DeLong, E. F. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J. Bacteriol. 178, 591-599 (1996).
- Béjà, O., Suzuki, O., Koonin, M. T., Aravind, E. V., Hadd, L., Nguyen, L. P. A., Villacorta, R., Amjadi, M., Garrigues, C., Jovanovich, S. B., Feldman, R. A., DeLong, E. F. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ. Microbiol. 2, 516-529 (2000).
- DeLong, E. F., Preston, C. M., Mincer, T., Rich, V., Hallam, S. J., Frigaard, N. -U., Martinez, A., Sullivan, M. B., Edwards, R., Brito, B. R., Chisholm, S. W., Karl, D. M. Community genomics among stratified microbial assemblages in the Ocean's interior. Science. 311, 496-503 (2006).
- Hallam, S. J., Putnam, N., Preston, C. M., Detter, J. C., Rokhsar, D., Richardson, P. M., DeLong, E. F. Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics. Science. 305, 1457-1462 (2004).
