Summary
Un passo-passo guida mirate a generare embrioni di zebrafish chimerico da trapianto allo stadio di blastula o gastrula.
Abstract
Uno degli strumenti più potenti utilizzati al fine di conoscere complessi processi di sviluppo è l'analisi degli embrioni chimerici. Una chimera è definito come un organismo che contiene cellule provenienti da più di un animale, mosaici sono un tipo di chimera in cui si mescolano le cellule da più di un genotipo, di solito wild-type e mutanti. In zebrafish, chimere può essere facilmente fatto con il trapianto di cellule da un embrione donatore in un embrione di ospitare allo stadio embrionale appropriato. Cellule del donatore etichettati sono generati mediante iniezione di un marker lignaggio, come ad esempio un colorante fluorescente, in embrione unicellulare palco. Cellule del donatore etichettati vengono rimossi da embrioni donatori e introdotto in embrioni di ospitare senza etichetta utilizzando un olio controllato pipetta di vetro montato sia su un composto o microscopio da dissezione. Cellule del donatore possono in alcuni casi essere mirate ad una specifica regione o tessuto dello sviluppo dell'embrione stadio di blastula o gastrula ospitare scegliendo un sito trapianto di embrione di accoglienza sulla base di consolidata mappe destino.
Protocol
Un passo-passo guida mirate a generare embrioni di zebrafish chimerico da trapianto allo stadio di blastula o gastrula.
Uno degli strumenti più potenti utilizzati al fine di conoscere complessi processi di sviluppo è l'analisi degli embrioni chimerici. Una chimera è definito come un organismo che contiene cellule provenienti da più di un animale, mosaici sono un tipo di chimera in cui si mescolano le cellule da più di un genotipo, di solito wild-type e mutanti. In zebrafish, chimere può essere facilmente fatto con il trapianto di cellule da un embrione donatore in un embrione di ospitare allo stadio embrionale appropriato. Cellule del donatore etichettati sono generati mediante iniezione di un marker lignaggio, come ad esempio un colorante fluorescente, in embrione unicellulare palco. Cellule del donatore etichettati vengono rimossi da embrioni donatori e introdotto in embrioni di ospitare senza etichetta utilizzando un olio controllato pipetta di vetro montato sia su un composto o microscopio da dissezione. Cellule del donatore possono in alcuni casi essere mirate ad una specifica regione o tessuto dello sviluppo dell'embrione stadio di blastula o gastrula ospitare scegliendo un sito trapianto di embrione di accoglienza sulla base di consolidata mappe destino.
Parte 1: iniezione embrioni di zebrafish a 1-cellula palco.
- Dechorionation enzimatica della 1-cella di embrioni palco.
Agli embrioni proteoliticamente dechorionate, incubare a 1-cellula stadio per ~ 1-5 'in mg / 0,5 ml soluzione pronasi come descritto nel libro Zebrafish 1. Moniter embrioni dechorionation da vicino e immergere in media embrioni (EM) con Pen / Strep 1 non appena il chorions cominciano a crollare visibilmente. Una volta liberati dal loro chorions, embrioni stadio di blastula e gastrula sono fragili e si attacca alla plastica o disintegrare se esposto all'aria. Quindi mantenere embrioni dechorionated immersi in Pen / Strep EM, trasferimento tra i piatti con un ampio tunnel di fuoco lucido pipetta di vetro, e mantenere in entrambe le agar rivestite piatti di plastica (1,2% di agarosio in Pen / Strep EM) o in autoclave vetro piastre Petri. - Iniettando embrioni dechorionated con pennarello lignaggio.
Preparare un piatto di iniezione con l'inserimento di un vetrino con un angolo di 45 gradi in tutta la parte più larga di una piastra di Petri tre quarti pieno di agarosio 1,2% made in Pen / Strep EM. La rimozione della diapositiva dopo la solidificazione agarosio lascia una depressione smussato. Trasferimento degli embrioni dechorionated nel trogolo di un piatto pieno di iniezione Pen / Strep EM. Iniettare volumi 1nl di marcatore lignaggio con una precisione calibrata al fuoco tirato iniezione pipetta di vetro e un impianto di iniezione a pressione, come descritto nel libro Zebrafish 1. Iniettare coloranti a basso peso molecolare traccianti lignaggio direttamente nel tuorlo di embrioni dechorionated tra il 1 - e 4-celle fasi. Una soluzione al 3% di destrano fluorescente è sufficiente per consentire la rilevazione di cellule del donatore-derivati in embrioni chimerici con diversi giorni di sviluppo. Quando il marcatore lignaggio è un mRNA che codifica per una proteina fluorescente (per esempio, GFP o RFP), iniettare direttamente nella cella del primo 1-cellula embrionale palco. - Iniezione non dechorionated embrioni con pennarello lignaggio.
Preparare multi-iniezione e piatti di solidificazione 1,2% di agarosio in EM attorno uno stampo con pozzi o meno la stessa larghezza del diametro corion. Trasferimento non dechorionated embrioni in un multi-iniezione piatto ben riempito a metà con Pen / Strep EM. Rimuovere il liquido in eccesso. Così immobilizzato, gli embrioni possono essere iniettati con volumi 1nl di marcatore lignaggio come descritto sopra. - Raccolta embrioni iniettati per il trapianto.
Alza gli embrioni a bassa densità (40-50 embrioni per ogni piatto) in Pen fresco / EM Strep. Fase-match degli embrioni donatore e host utilizzati per i trapianti abbastanza da vicino. Per i trapianti fase scudo, obiettivo per i donatori di rimanere indietro rispetto al ospiti; notare che gli embrioni iniettati tendono ad essere leggermente ritardata. Incubare gli embrioni a differenti temperature, 25 ° C, 28 ° C e 31 ° C, di scaglionare il loro sviluppo e massimizzare la finestra di tempo in cui i trapianti possono essere eseguiti.
Parte 2: Rendere embrioni di zebrafish chimerico da trapianto.
- Trapianto in fasi blastula sulla stereomicroscopio
- Descrizione del dispositivo di trapianto di blastula
L'apparecchio utilizzato per il trapianto di cellule nella blastula zebrafish è costituito da un drive-controllato micrometro siringa Hamilton (10 l-50 l) attaccato da un rubinetto a tre vie ad un serbatoio di olio minerale e di un supporto micropipetta con una lunghezza di tubi flessibili . Dopo il montaggio del rig trapianto, si è riempito di olio minerale, avendo cura di eliminare tutte le bolle d'aria dal sistema. La presenza di una bolla d'aria sarà un impatto negativo sulla vostra capacità di controllo °e di aspirazione e di pressione. Utilizzare uno stereomicroscopio con ingrandimento piuttosto elevati e buone caratteristiche ottiche (l'ideale sarebbe almeno un ingrandimento 80x). Il posizionamento del supporto micropipetta e aghi può essere controllato da un micromanipolatore manuale Narishige, come per le iniezioni, tuttavia, se la base dello stereoscopio è troppo ampio per consentire un facile accesso con il micromanipolatore, poi un adattatore che si attacca al corpo del stereomicroscopio possono anche essere acquistati da Narishige. Il montaggio del micromanipolatore deve essere molto stabile al fine di evitare di trasferire le vibrazioni per l'ago di trapianto; una base magnetica funziona bene per questo scopo. - Preparare la pipetta trapianto
Aghi trapianto sono fatti da pipette di vetro capillari (vedi due opzioni nella tabella sottostante i reagenti) che sono attratti da un cero gentile su un elettrodo estrattore. Rompere la punta di off ago sotto un microscopio da dissezione utilizzando una lametta regolo nel punto in cui il diametro interno dell'ago è leggermente più grande rispetto alle cellule da trapiantare. Tenere la lametta con una leggera angolazione per creare una smussatura e fare la pausa più liscia possibile, senza bordi frastagliati. Per i trapianti fase blastula il diametro esterno dell'ago dovrebbe misurare circa 50-60 mm. - Embrioni di montaggio per il trapianto in stampi agar
Preparare piatti iniezione da galleggianti uno stampo di plastica con filari di sporgenze a forma di cuneo in piastre di Petri che è per metà piena di fuso 1,2% di agarosio in EM. Una volta che l'agarosio si è solidificato, rimuovere il modello, lasciando uno stampo agar che contiene righe di ogni forma triangolare pozzi appena sufficiente per contenere un embrione. Riempire lo stampo con trapianto Pen / Strep EM e caricare embrioni fase blastula individualmente in ciascun pozzetto con una pipetta di vetro lucido fuoco in modo che gli embrioni donatori sono posizionati in basso di una colonna e gli embrioni di accoglienza sono posti in basso nella colonna adiacente. - Trapianto di cellule
Embrioni posizione nei pozzetti trapianto su un fianco; riposizionare con la pipetta trapianto, se necessario durante il trapianto, avendo cura di non forare il tuorlo. Posizionare il piatto sul palco in modo che quando l'ago entra in un trapianto di embrione, l'ago spinge l'embrione contro la parete di fondo del suo bene. Utilizzando il micromanipolatore, abbassare l'ago trapianto nel piatto con un angolo piuttosto ripido. Idealmente l'ago trapianto deve entrare l'embrione di circa 45 gradi. Una volta che la punta dell'ago è sotto la superficie del terreno embrione, disegnare una piccola quantità di media in embrione l'ago ruotando il disco micrometro controllo della siringa Hamilton. Per il controllo più preciso, l'interfaccia tra l'olio minerale e il mezzo embrione deve rimanere nella sottile, parte conica dello spillo, ma non troppo vicino alla fine. Delicatamente posizione l'embrione donatore con l'ago e quindi disegnare l'ago indietro e inserire il tappo blastula dell'embrione nella posizione desiderata. Un rapido, colpito duro penetra l'embrione senza causare a rotolare. Elaborare cellule del donatore lentamente e con attenzione in ago. Se le cellule vengono prese troppo in fretta, è probabile che al taglio. Anche evitare di prendere tuorlo fino al ago, che si legherà l'olio minerale, che poi uccidere le cellule. Dopo il numero di celle desiderato è occupato, invertire la pressione un po 'per fermare l'aspirazione e rimuovere l'ago dalla embrione. Portare l'embrione host in posizione spostando il piatto trapianto. Piccoli aggiustamenti alla posizione dell'embrione host può essere fatta con delicatezza girando con l'ago trapianto, fino a quando si fa attenzione a non toccare il tuorlo. Quando espellere le cellule del donatore in un embrione di accoglienza, evitare di introdurre una grande quantità di media embrione o di qualsiasi olio minerale, in quanto ciò potrebbe interferire con lo sviluppo o uccidere l'embrione. La posizione delle cellule lungo l'asse animale-vegetale influenza il loro contributo ad uno dei tre foglietti embrionali, endoderma, mesoderma ed ectoderma 2,3. Di conseguenza, le cellule trapiantate nei pressi del margine prima dell'inizio della gastrulazione darà luogo preferenzialmente a endoderma e mesoderma, mentre le cellule trapiantate verso il polo animale contribuirà a destini ectodermica, più comunemente ectoderma di superficie, proencefalo e gli occhi. Quindi un grado di targeting tessuto può essere realizzato anche in fasi blastula. Dopo il trasferimento di cellule sono state completate, il trasferimento del donatore-host coppie nei pozzetti agar rivestiti di un piatto ben 24 per sviluppare ulteriormente.
- Trapianto in fasi gastrula sul microscopio composto
- Descrizione del dispositivo di trapianto
Trasferimenti cellule eseguita su un beneficio microscopio composto dal controllo preciso di posizione dell'ago fornito da un tre assi olio idraulicomicromanipolatore. Questo micromanipolatore controlla i movimenti fini della pipetta trapianto, mentre l'aspirazione della pipetta è controllato da un micrometro-drive siringa Hamilton simile a quello utilizzato per i trapianti blastula. Un microscopio composto in posizione verticale con un palco fisso è preferibile per effettuare il trasferimento di cellule dal fuoco ad un microscopio non provoca l'embrione di muoversi rispetto alla pipetta. Tuttavia, se un regolabile in fase microscopio composto deve essere utilizzato, quindi il micromanipolatore può essere montato sul palco, piuttosto che al corpo del microscopio con lo stesso effetto. Adattatori che forniscono le opzioni per il montaggio del micromanipolatore a uno stadio o corpo di microscopi composti da una varietà di produttori sono disponibili anche presso Narishige. - Preparare la pipetta trapianto
Aghi trapianto sono essenzialmente come descritto sopra, per i trapianti stadio di gastrula l'apertura dell'ago ideale è 30-40 mm. Dopo la formazione scudo, lo strato avvolgente (EVL) diventa più aderente, rendendo difficile l'ago trapianto di penetrare l'embrione. Per facilitare l'ago ingresso, tirare una frecciata alla fine dell'ago con un microforge. In primo luogo, lisciare la punta dell'ago portandola vicino al filamento del microforge, poi girare l'ago in modo che il bordo dello smusso può mettersi in contatto con il filamento. Una volta che il bordo anteriore dei contatti ago il filo, tirarlo via rapidamente per creare un ardiglione o arpione. Per evitare di danneggiare le cellule, la sbavatura devono essere diritti e la punta dell'ago non dovrebbe curva - Embrioni di montaggio per il trapianto in metilcellulosa
Per i trapianti microscopio composto, montare gli embrioni su un vetrino depressione in una soluzione al 3% di metilcellulosa (Sigma) disciolti in un mezzo embrione. In primo luogo, striscio una striscia verticale di metilcellulosa nella depressione di una diapositiva depressione bicchiere, poi diluvio con una generosa quantità di medio dell'embrione. Utilizzando un incendio lucidato pipetta, trasferimento da un donatore e tre scudo stadio ospita sotto la superficie del EM sulla diapositiva depressione su un lato la metilcellulosa. Scegliere gli embrioni donatori che sono leggermente più giovani degli ospiti (30-50% epiboly). Con un piccolo anello ottenuti incollando le estremità di un breve tratto di 2-lb lenza prova nel termine di un tubo capillare, ruotare delicatamente gli embrioni donatori e ospitare fino sulla parte superiore della striscia di metilcellulosa e roba giù in la metilcellulosa fino sicuro. Se le cellule trapiantate devono essere mirati a un determinato dominio, la conoscenza del destino fase shield map 3,4 e la posizione del tessuto bersaglio rispetto allo scudo è essenziale in modo che gli embrioni host può essere posizionato correttamente. Come gli embrioni di accoglienza sono inseriti nel metilcellulosa, rotolare in posizione in modo che la regione di destinazione è più in alto, dal momento che durante il trapianto l'ago entra tangenzialmente l'embrione per fornire le cellule del donatore, senza danneggiare il tuorlo. - Trapianto di cellule
Posizionare l'ago trapianto spostandolo sul piano focale dell'embrione. Riguarda in primo luogo l'embrione donatore con l'obiettivo 10x. Quindi spostare l'embrione di lato, e senza regolare piano focale, utilizzare i controlli del micromanipolatore per portare la punta dell'ago trapianto a fuoco. Posizionare il supporto micropipetta e ago con un angolo poco profondo, in modo che l'ago sia il più vicino a orizzontale, come il bordo della depressione sulla diapositiva permetteranno. Se un embrione è montato correttamente in metilcellulosa, non rotolerà come l'ago entra trapianto, a meno che l'embrione è troppo vecchio per consentire l'ago di penetrare facilmente. Lo strato avvolgente sembra inasprire l'età embrioni, quindi, i trapianti stadio di gastrula sono più eseguiti subito dopo la formazione di scudo. Dopo la fase di cupola, il tuorlo appena al di sotto delle cellule del cappuccio Blastoderm, che si assottiglia progressivamente con il procedere epiboly. Al fine di evitare di forare il tuorlo, l'ago deve entrare l'embrione ad un piano focale che è solo leggermente più profondo di quello del EVL. Quando si rimuove un gran numero di cellule dall'embrione donatore, spostare l'ago intorno come le cellule vengono ripresi, in modo da evitare accidentali succhiare tuorlo nella ago. Se le cellule da un embrione donatore devono essere trapiantato a più host, è meglio entrare il donatore con l'ago una sola volta in modo da minimizzare la possibilità di danni. Le cellule del donatore possono essere trasferiti nella posizione desiderata in un massimo di tre embrioni host. Durante il trasferimento di cellule provenienti da due o più embrioni di donatori in un embrione di accoglienza, è meglio prendere cellule da embrioni ciascuno dei donatori nel trapianto l'ago stesso prima del trapianto ad un embrione di accoglienza. Questo riduce al minimo i danni per l'embrione di accoglienza, e assicura che le cellule vengono trasferite alla stessa area dell'embrione, in modo che i loro comportamenti possono essere confrontati. Molto poco miscelazione oction tra le cellule del donatore nel trapianto l'ago, quindi, le cellule dovrebbero essere trasferiti in un singolo host quando più di un donatore viene utilizzato. Al fine di aumentare la probabilità che le cellule del donatore contribuirà al tessuto desiderato, espellere le cellule del donatore, mentre l'ago è in corso di elaborazione attraverso l'area di destinazione, al contrario di depositare le cellule in un singolo gruppo. Una volta che i trasferimenti delle cellule sono stati completati, posto l'intera diapositiva in una scatola Petri e inondazioni accuratamente con Pen / Strep EM. Nel corso delle prossime ore la metilcellulosa si dissolvono, liberando gli embrioni.
Figura 1: Microscopio set-up per fare gli embrioni chimerici. R: Una dissezione rig trapianto microscopio è costituito da un olio siringa Hamilton con un drive micrometro (a), collegato ad un serbatoio a bagno d'olio (b) e il trapianto pipetta (c) tramite un rubinetto a 3 vie (d). La pipetta trapianto è montato su un micromanipolatore grossa (e) che è attaccato ad una piastra base in metallo (non mostrato) attraverso una base magnetica (f). I trapianti vengono eseguiti sul palco di uno stereomicroscopio (g), dotato di illuminazione fondo per l'ottica ottimale. B: un microscopio rig composto trapianto consiste in un simile olio siringa Hamilton e micrometro unità (a, b) ma in questo caso la pipetta trapianto è montato su un supporto pipetta (c) la cui X, Y e Z i movimenti possono essere controllati o da un grossolano (d) o fine (e) micromanipolatore. In questo esempio, il micromanipolatore è montato sul corpo di un palco fisso microscopio, tuttavia è anche possibile montarlo sul palcoscenico di un microscopio normale. Gli embrioni, che sono immobilizzati in metilcellulosa su un vetrino depressione, vengono visualizzati utilizzando un obiettivo 10x (f). C: Trapianto stampo per immobilizzare gli embrioni per i trapianti stereomicroscopio. Dechorionated embrioni vengono eliminati singolarmente in pozzi fatta da questo stampo in fusione di agarosio in una capsula di Petri 90 millimetri. Le dimensioni dei pozzi sono mostrati.
Figura 2: Montaggio embrioni allo stadio di gastrula trapianti. R: la forma ideale di una pipetta di trapianto gastrula. Una smussatura con una punta acuminata aiuta a penetrare l'embrione. B: immobilizzare gli embrioni donatore e ospite in metilcellulosa. Una striscia di metilcellulosa è previsto nel pozzo di una diapositiva depressione e invaso da una generosa quantità di medio dell'embrione. Gli embrioni vengono aggiunti al mezzo embrione e sono rotolato sulla metilcellulosa utilizzando un ciclo di piccole dimensioni (C). DG Allargamento di embrioni in fig. 1B. D: L'embrione donatore è orientata per consentire facile accesso per la pipetta, poiché le cellule in questa fase sono ancora impegnati. EG: Scudo-stadio ospitare gli embrioni sono orientate in modo che la regione target è alto. Cellule trapiantate nelle regioni in scatola contribuirà a romboencefalo dorsale e craniale cresta neurale derivata dalla sinistra (E) e destro (G) i lati o al romboencefalo ventrale e del midollo spinale (F).
Figura 3: immagini rappresentative degli embrioni chimerici.
(AC) 18hpf embrioni chimerici generati dal trapianto in fase di scudo mostrato in vista dorsale, anteriore a sinistra. (A, B) Ordinamento funzioni per EphA4 recettore sulla superficie cellulare rivelato attraverso l'analisi di embrioni chimerici. Pannelli a sinistra: fusione di rodamina marcata (rhod.), le cellule del donatore (rosso) e transgenici GFP espresso in segmenti specifici romboencefalo (verde). (A), le cellule WT contribuire alla romboencefalo intera di un embrione di controllo chimerico. (B) EphA4-impoverito cellule del donatore sono esclusi dalla segmenti specifici nel romboencefalo di un host WT. (C), le cellule del donatore mirati per le diverse parti del tubo neurale nei scudo fase trapianti. Cellule del donatore (rosso) mirato al proencefalo / mesencefalo (pannello di sinistra) o romboencefalo / midollo spinale (pannello di destra) di un host WT contro-colorate con un anticorpo EfnB2a che segna il proencefalo, a metà romboencefalo confine e il segmento centrale della romboencefalo (verde). Barre di scala: 50 micron.
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Discussion
La facilità con cui il trapianto può essere usato per produrre chimere mirata è una delle grandi potenze del pesce zebra come modello vertebrato. Una modifica di questo protocollo non sopra descritto permette l'analisi della funzione del gene materno per i geni con ruolo essenziale nello sviluppo zigotico. Dal momento che questi pesci mutanti non possono sopravvivere fino all'età adulta, è necessario trasferire la linea germinale mutante in un altro modo wild-type embrione di accoglienza, la creazione di "cloni germinale" di cellule mutanti. Generazione germinale mosaici implica il trapianto di cellule germinali primordiali da un donatore mutante ad una wild-type embrione ospite. A differenza di tutte le altre linee cellulari nell'embrione, il lignaggio delle cellule germinali è specificato molto presto nello sviluppo da parte l'eredità di determinanti materni 5,6. Così, la prima sfida di fare mosaici linea germinale è identificare le cellule germinali primordiali (PGC) in embrione donatore. In fasi midblastula il PGC risiedono lungo il margine di 7,8, in modo da far salire 50-100 cellule casuale dal margine di un lignaggio marcato embrione donatore risultati frequentemente nel trasferimento di PGC. Quando trasferite al polo animale di un embrione ospitare senza etichetta, le cellule germinali primordiali migrano attivamente verso la gonade presuntiva, dove possono essere identificato in modo inequivocabile a 24 ore di sviluppo dalla loro posizione caratteristica, di grandi dimensioni, e la ritenzione colorante a causa del loro basso tasso di proliferazione 9-11. Nel frattempo, donatore-derivate non-PGC acquisirà il destino determinata dalla loro posizione nel paese ospitante: in primo luogo proencefalo e gli occhi se fossero trapiantati al polo animale blastula. Iniettando l'embrione host con Morpholinos che abbattere il gene vicolo cieco effettivamente eliminare gli germinale host in una cella-autonoma modo, così che anche un solo donatore-derivati PGC può ripopolare l'intera linea germinale 10,12 (CM, osservazione personale). Più recentemente, una linea transgenica che permette PGC da visualizzare in embrioni vivi durante le fasi di blastula è stato sviluppato 13. Quando attraversò nel mutante la cui funzione materna deve essere determinato, questo transgene, combinato con il Morpholinos vicolo cieco, farà trapianti germinale facile perché PGC singolo può essere identificata e trapiantato in una linea germinale-impoverito ospite.
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Acknowledgments
Grazie ai membri del laboratorio Moens utile per l'ingresso durante la stesura di questo articolo. HK è post-doctoral fellow supportato da NIH / NICHD concedere # 5R01HD037909-08. CBM è un investigatore con l'Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Injection rig | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | Foot pedal can be ordered separately |
| Pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | protease type XIV” |
| Pen-Strep | Sigma-Aldrich | P4458 | 100x stock |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M-0387 | |
| Fluorescent dextrans | Molecular Probes, Life Technologies | various | Eg. lysine-fixable rhodamine dextran (D7162) |
| Injection pipettes (1.2mmx0.94mmx10cm) | Sutter Instrument Co. | BF120-94-10 | |
| Transplant pipette option 1 | World Precision Instruments, Inc. | TW100-4 | |
| Transplant pipette option 2 | VWR international | #53508-400 | |
| micromanipulator | Narishige International | UMJ-3FC (?) | |
| Micromanipulator magnetic stand | Narishige International | GJ-1 | |
| Transplant apparatus | Sutter Instrument Co. | MI-10010 | |
| Fine micromanipulator | Narishige International | MMO-203 | |
| Depression slides | Fisher Scientific | 12560A | |
| Agar molds for injection and transplants | AL-AN Mfg, Inc. | ||
Reagents: Recipes for many of the reagents used for these procedures are found in The Zebrafish Book, which is available in full online at http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Recipes are provided there for preparation of Fish Water, Embryo Medium with and without antibiotics, pronase for dechorionating, fluorescent dextrans, and methyl cellulose. |
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References
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. , 3rd Ed, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M. Cell lineage and developmental potential of cells in the zebrafish embryo. Trends Genet. 4, 68-74 (1988).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. Origin and organization of the zebrafish fate map. Development. 108, 581-594 (1990).
- Woo, K., Fraser, S. E. Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system. Development. 121, 2595-2609 (1995).
- Raz, E. Primordial germ-cell development: the zebrafish perspective. Nat Rev Genet. 4, 690-700 (2003).
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- Weidinger, G. Regulation of zebrafish primordial germ cell migration by attraction towards an intermediate target. Development. 129 (1), 25-36 (2002).
- Ciruna, B. Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germ-line replacement. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14919-14924 (2002).
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