Summary
Eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für gezielte chimären Zebrafischembryonen durch die Transplantation erzeugt an der Blastula oder Gastrula-Stadium.
Abstract
Eines der mächtigsten Werkzeuge verwendet werden, um Einblick in die komplexen Entwicklungsprozesse zu gewinnen ist die Analyse von chimären Embryonen. Eine Chimäre ist ein Organismus, der Zellen, die aus mehr als ein Tier enthält definiert; Mosaike sind eine Art von Chimären, in denen Zellen von mehr als einem Genotyp gemischt, sind in der Regel Wildtyp und Mutante. In der Zebrafisch, können Chimären leicht durch die Transplantation von Zellen eines Spenders Embryo in eine Host-Embryo in den entsprechenden embryonalen Stadium vorgenommen werden. Labeled Spender-Zellen werden durch Injektion von einer Linie Marker, wie zum Beispiel einem fluoreszierenden Farbstoff, in den ein-Zell-Stadium Embryos erzeugt. Labeled Spenderzellen sind vom Spender Embryonen entnommen und in unbeschrifteten Host Embryonen mit einem Öl-gesteuerte Glaspipette auf entweder eine Verbindung oder Präpariermikroskop montiert. Donor-Zellen können in einigen Fällen auf eine bestimmte Region oder Gewebe des sich entwickelnden Blastula oder Gastrula-Stadium Host Embryo durch die Wahl einer Transplantation vor Ort in den Host-Embryo auf etablierte Schicksal Karten basieren ausgerichtet sein.
Protocol
Eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für gezielte chimären Zebrafischembryonen durch die Transplantation erzeugt an der Blastula oder Gastrula-Stadium.
Eines der mächtigsten Werkzeuge verwendet werden, um Einblick in die komplexen Entwicklungsprozesse zu gewinnen ist die Analyse von chimären Embryonen. Eine Chimäre ist ein Organismus, der Zellen, die aus mehr als ein Tier enthält definiert; Mosaike sind eine Art von Chimären, in denen Zellen von mehr als einem Genotyp gemischt, sind in der Regel Wildtyp und Mutante. In der Zebrafisch, können Chimären leicht durch die Transplantation von Zellen eines Spenders Embryo in eine Host-Embryo in den entsprechenden embryonalen Stadium vorgenommen werden. Labeled Spender-Zellen werden durch Injektion von einer Linie Marker, wie zum Beispiel einem fluoreszierenden Farbstoff, in den ein-Zell-Stadium Embryos erzeugt. Labeled Spenderzellen sind vom Spender Embryonen entnommen und in unbeschrifteten Host Embryonen mit einem Öl-gesteuerte Glaspipette auf entweder eine Verbindung oder Präpariermikroskop montiert. Donor-Zellen können in einigen Fällen auf eine bestimmte Region oder Gewebe des sich entwickelnden Blastula oder Gastrula-Stadium Host Embryo durch die Wahl einer Transplantation vor Ort in den Host-Embryo auf etablierte Schicksal Karten basieren ausgerichtet sein.
Teil 1: Injektion von Zebrafisch-Embryos an der 1-Zell-Stadium.
- Enzymatische dechorionation von 1-Zell-Stadium Embryos.
Um proteolytisch dechorionate Embryonen, an der 1-Zell-Stadium für ~ 1-5 'in einer 0,5 mg / ml Pronase-Lösung wie in der Zebrafisch-Book 1 beschrieben inkubieren. Moniter dechorionation eng und tauchen Embryonen in Embryo Medium (EM) mit Pen / Strep 1, sobald das Chorion, sichtbar Zusammenbruch beginnen. Einmal aus ihrem Chorion veröffentlicht werden Blastula und Gastrula Embryonen empfindlich und werden auf Kunststoff-Stick oder zerfallen, wenn sie der Luft ausgesetzt. Deshalb halten dechorionated Embryonen in Pen / Strep EM getaucht, zwischen Gerichten mit einem Breitbild-Bohrung feuerpolierte Glaspipette, und entweder in Agar-beschichtete Kunststoff-Geschirr (1,2% Agarose in Pen / Strep EM) oder autoklaviert Glas Petrischalen aufrecht zu erhalten. - Injizieren dechorionated Embryonen mit Abstammung Marker.
Bereiten Sie eine Injektion Gericht durch Einsetzen einer Glasplatte in einem 45 Grad-Winkel über den breitesten Teil der Petrischale mit einem dreiviertel voll von 1,2% Agarose in Pen gemacht / Strep EM. Das Entfernen der Folie nach Agarose Erstarrung hinterlässt eine schräge Wanne. Transfer dechorionated Embryonen in die Mulde einer Injektion Gericht mit Pen / Strep EM gefüllt. Inject 1NL Bände Linie Marker mit einem präzise kalibrierten Feuer gezogen Glas-Pipette und einem Druck Injektion rig, wie in der Zebrafisch-Book 1 beschrieben. Inject Farbstoffe und niedermolekulare Linie Tracer direkt in das Eigelb dechorionated Embryonen zwischen dem 1 - und 4-Zellen-Stadium. Eine 3% ige Lösung von fluoreszierenden Dextran ist ausreichend für den Nachweis von Donor-abgeleiteten Zellen in chimären Embryonen durch mehrere Tage der Entwicklung zu ermöglichen. Wenn die Linie Marker einer mRNA codiert ein fluoreszierendes Protein (z. B. GFP oder RFP) ist, direkt in den Zellen des frühen 1-Zell-Stadium Embryos. - Injektion nicht dechorionated Embryonen mit Abstammung Marker.
Bereiten Sie Multi-Well-Injektion Gerichte durch Verfestigung 1,2% Agarose in EM um eine Form mit Brunnen in etwa die gleiche Breite wie das Chorion Durchmesser. Transfer nicht dechorionated Embryonen in einem Multi-Well-Injektion Gericht mit Pen halbgefüllten / Strep EM. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit. So immobilisiert, können Embryonen mit 1NL Bände Linie Marker injiziert werden, wie oben beschrieben. - Raising injizierten Embryonen für die Transplantation.
Raise Embryonen bei niedriger Dichte (40-50 Embryonen pro Schale) in frisches Pen / Strep EM. Stage-Match der Spender-und Host-Embryonen für die Transplantation verwendet ziemlich eng. Für Schild Bühne Transplantationen Ziel für die Geber auf, knapp hinter den Gastgebern lag; beachten Sie, dass injizierten Embryonen bis leicht verzögert werden neigen. Inkubieren Embryonen bei unterschiedlichen Temperaturen, 25 ° C, 28 ° C und 31 ° C, um ihre Entwicklung staffeln und maximieren Sie die Zeitfenster, über die Transplantation durchgeführt werden kann.
Teil 2: Making chimären Zebrafischembryonen durch Transplantation.
- Transplantation bei Blastula Etappen auf dem Stereomikroskop
- Beschreibung des Transplantats rig für Blastula
Die Vorrichtung zur Stammzelltransplantation in der Zebrafisch Blastula verwendet besteht aus einer Mikrometerschraube kontrollierte Hamilton-Spritze (10 l-50 l) durch einen Drei-Wege-Hahn mit einem Reservoir von Mineralöl und einer Mikropipette Halter befestigt durch eine Länge von Schläuchen . Nach der Montage der Transplantation rig, ist es mit Mineralöl gefüllt, wobei darauf zu achten alle Luftblasen aus dem System zu eliminieren. Das Vorhandensein einer Luftblase wird sich negativ auf Ihre Fähigkeit, th-Steuerunge Saug-und Druckseite. Verwenden Sie ein Stereomikroskop mit ziemlich hoher Vergrößerung und gute Optik (idealerweise mindestens 80-facher Vergrößerung). Die Positionierung der Mikropipette Halter und Nadel kann durch eine manuelle Narishige Mikromanipulator gesteuert werden, wie für Injektionen, aber wenn die Basis des Stereoskop ist zu breit, um einen einfachen Zugang mit dem Mikromanipulator erlauben, dann ist ein Adapter, der den Körper des beimisst Stereomikroskop können auch von Narishige erworben werden. Die Montage der Mikromanipulator müssen sehr stabil sein, um zu vermeiden übertragen Schwingungen auf die Transplantation Nadel; Magnetfuß eignet sich gut für diesen Zweck. - Vorbereitung der Transplantation Pipette
Transplantation Nadeln sind aus Glas Kapillarpipetten (siehe zwei Optionen in Reagenzien Tabelle unten), die eine schonende Verjüngung auf einer Elektrode Abzieher gezogen sind. Break the Spitze der Nadel weg unter einem Binokular mit einer geraden Kante Rasierklinge an der Stelle, wo der innere Durchmesser der Nadel ist etwas größer als die Zellen transplantiert werden. Halten Sie die Rasierklinge in einem leichten Winkel an eine Schräge zu schaffen und den Bruch so glatt wie möglich, ohne gezackte Ränder. Für Blastulastadium Transplantationen der Außendurchmesser der Nadel gemessen werden sollte ca. 50-60 mm. - Montage Embryonen für die Transplantation in Agar Formen
Bereiten Injektion Gerichte, die von schwimmenden eine plastische Form mit Reihen von keilförmigen Vorsprünge in einer Petrischale, die mit geschmolzenem 1,2% Agarose in EM zur Hälfte gefüllt ist. Nachdem die Agarose erstarrt ist, entfernen Sie die Vorlage, so dass eine Agar-Form, die Reihen der dreieckförmigen Vertiefungen, die gerade groß genug, um einen Embryo zu halten enthält. Füllen Sie die Transplantation Form mit Pen / Strep EM und laden Blastulastadium Embryonen einzeln in jede Vertiefung mit einer feuerpolierten Glaspipette so dass der Spender Embryonen unten sind eine Spalte und dem Host-Embryonen nach der benachbarten Spalte platziert. - Transplantation von Zellen
Position Embryonen in der Transplantation Brunnen auf ihren Seiten; mit dem Transplantat Pipette als bei der Transplantation nötig neu zu positionieren, dabei nicht Punktion das Eigelb. Position der Schüssel auf der Bühne, so dass bei der Transplantation Nadel eines Embryos gelangt, schiebt die Nadel des Embryos gegen die Rückwand seines gut. Mit dem Mikromanipulator, senken Sie die Transplantation Nadel in die Schüssel auf einem relativ steilen Winkel. Idealerweise sollte die Transplantation Nadel sollte der Embryo in etwa einem 45-Grad-Winkel ein. Sobald die Spitze der Nadel ist unter der Oberfläche des Embryos Medium, zeichnen Sie eine kleine Menge von Embryos Medium in die Nadel durch Drehen der Mikrometerschraube Steuerung der Hamilton-Spritze. Für die meisten eine präzise Steuerung, sollte die Schnittstelle zwischen dem Mineralöl-und der Embryo Medium in den dünnen, konischen Teil der Nadel bleiben, aber nicht zu dem Ende nahe. Gently Position des Spenders Embryo mit der Nadel und ziehen Sie dann die Nadel wieder und geben Sie die Blastula Kappe des Embryos in die gewünschte Position. Eine schnelle, hart getroffen wird der Embryo, ohne dass es zu rollen eindringen. Erstellen Sie Spenderzellen langsam und vorsichtig in die Nadel. Wenn die Zellen zu schnell getroffen werden, sind sie wahrscheinlich zu scheren. Vermeiden Sie auch unter Eigelb in die Nadel, wie es der Mineralölindustrie, der dann töten die Zellen binden. Nachdem die gewünschte Anzahl von Zellen aufgenommen wird, umgekehrt der Druck etwas nach Saug stoppen und entfernen Sie die Nadel aus dem Embryo. Bringen Sie den Host-Embryo in die richtige Position, indem Sie die Transplantation Gericht. Kleine Änderungen an der Position des Host-Embryo kann durch leichtes Drehen Sie es mit der Transplantation Nadel, solange darauf geachtet wird, um nicht berühren das Eigelb gemacht werden. Wenn die Vertreibung der Spenderzellen in die Host-Embryo zu vermeiden Einführung einer großen Menge von Embryos Medium oder Mineralöl, da dies mit der Entwicklung stören könnten oder zu töten, den Embryo. Die Position der Zellen entlang der animal-vegetativen Achse Einflüsse ihren Beitrag zu einem der drei Keimblätter, Endoderm, Mesoderm und Ektoderm 2,3. Dementsprechend werden die Zellen in der Nähe der Marge vor Beginn der Gastrulation transplantiert entstehen bevorzugt an Endoderm und Mesoderm, während die Zellen auf den animalen Pol transplantiert ektodermalen Schicksale, am häufigsten Oberfläche Ektoderm, Vorderhirn und Augen beitragen. So ein gewisses Maß an Gewebe-Targeting kann auch bei Blastula Stufen erreicht werden. Nachdem die Zelle Transfers abgeschlossen sind, übertragen Sie die Donor-Host-Paare auf die Agar-beschichteten Wells einer 24-Well-Platte weiter zu entwickeln.
- Transplantation bei Gastrula Etappen auf dem zusammengesetzten Mikroskop
- Beschreibung des Transplantats rig
Zell-Transfers auf ein zusammengesetztes Mikroskop profitieren von der präzisen Steuerung der Nadelposition durch einen Drei-Achsen-ölhydraulische vorgesehen durchgeführtMikromanipulator. Dieser Mikromanipulator steuert die feinen Bewegungen des Transplantats Pipette, während der Saug-in die Pipette mit einem Mikrometer-Laufwerk Hamilton-Spritze, ähnlich dem für die Blastula Transplantation gesteuert wird. Eine aufrechte zusammengesetzte Mikroskop mit einer festen Phase ist bevorzugt, Durchführung Zelle überträgt seit konzentrieren einem solchen Mikroskop nicht zu den Embryo zu bewegen bezogen auf die Pipette. Allerdings, wenn eine einstellbare Stufen zusammengesetzte Mikroskop verwendet werden muss, dann ist die Mikromanipulator kann auf der Bühne statt, um den Körper des Mikroskops mit der gleichen Wirkung montiert werden. Adapter, die Optionen bieten für die Montage der Mikromanipulator auf die Bühne oder Körper der Verbindung von Mikroskopen von einer Vielzahl von Herstellern sind entweder ebenfalls aus Narishige zur Verfügung. - Vorbereitung der Transplantation Pipette
Transplantation Nadeln bestehen im wesentlichen wie oben beschrieben, für Gastrulastadium Transplantationen die ideale Nadel Öffnung ist 30-40 mm. Nach Schild Bildung, wird die umhüllende Schicht (EVL) mehr Anhänger, so dass es schwierig für die Transplantation Nadel auf den Embryo eindringen. Zur Erleichterung der Nadel Eintrag, ziehen einen Widerhaken am Ende der Nadel mit einem microforge. Erstens, glätten die Spitze der Nadel, indem es in der Nähe des Filaments der microforge, dann drehen Sie die Nadel so dass die Vorderkante der Fase kann Kontakt mit dem Filament zu machen. Sobald die Vorderkante der Nadel berührt den Faden, ziehen Sie es schnell weg, um einen Widerhaken oder Harpune zu schaffen. Zur Vermeidung von schädlichen Zellen, sollte die Widerhaken gerade sein und die Spitze der Nadel sollte nicht Kurve - Montage Embryonen für die Transplantation in Methylcellulose
Für zusammengesetzte Mikroskop Transplantationen, mount Embryonen auf eine Depression Folie in einer 3% igen Lösung von Methylcellulose (Sigma) in Embryo-Medium gelöst. Zunächst Abstrich eine vertikale Streifen von Methylcellulose in der Depression ein Glas Depression rutschen, dann Hochwasser mit einem großzügigen Betrag von Embryos Medium. Mit einem feuerpolierte pipet, Transfer von einem Spender und drei Schild-Stadium den Hosts unter der Oberfläche der EM auf die Depression gleiten auf der einen Seite der Methylcellulose. Wählen Spender Embryonen, die etwas jünger als die Gastgeber (30-50% epiboly) sind. Mit einer kleinen Schleife durch Verkleben der Enden eines kurzen Länge von 2-lb-Test Angelschnur in das Ende einer Kapillare aus, sanft rollen die Spender und Wirt Embryonen bis auf die Oberseite der Methylcellulose-Streifen und stopfen sie hinunter in die Methylcellulose bis zu sichern. Wenn die transplantierten Zellen zu einer bestimmten Domain, die Kenntnis der Schild Bühne Schicksal map 3,4 und die Position der Zielgewebe gegenüber dem Schild ist wichtig, damit Host-Embryonen richtig positioniert werden kann, ausgerichtet werden. Als Gastgeber Embryonen in die Methylcellulose platziert sind, rollen sie in Position, so dass der Zielregion ist oberste, da bei der Transplantation der Nadel wird der Embryo tangential eingeben, um die Spender-Zellen ohne Beschädigung der Dotter zu liefern. - Transplantation von Zellen
Position der Transplantation Nadel, indem Sie sie in die Brennebene des Embryos. Zunächst konzentrieren sich auf die Spender Embryo mit dem 10fach Objektiv. Dann bewegen Sie den Embryo an der Seite und ohne Anpassung der Brennebene, verwenden Sie die Bedienelemente des Mikromanipulator an die Spitze der Transplantation Nadel in den Mittelpunkt rücken. Position der Mikropipette Halter und Nadel in einem relativ flachen Winkel, so dass die Nadel möglichst nahe an horizontalen als Rand der Vertiefung auf der Folie ermöglichen. Wenn ein Embryo richtig in Methylcellulose montiert, wird es nicht rollen, wie die Transplantation Nadel tritt, es sei denn, der Embryo ist zu alt, damit die Nadel leicht durchdringen. Die umhüllende Schicht scheint zu verschärfen als Embryonen Alter, daher Gastrulastadium Transplantationen am besten direkt nach dem Schild Bildung durchgeführt. Nach Kuppel der Bühne, befindet sich das Eigelb knapp die Zellen des Blastoderms Kappe, die schrittweise verdünnt als epiboly ausgeht. Um zu vermeiden, piercing das Eigelb, sollte die Nadel der Embryo in einer Brennebene, die nur geringfügig tiefer als die der EVL in Kraft. Beim Entfernen einer großen Anzahl von Zellen vom Spender Embryo, bewegen Sie die Nadel in die Zellen aufgenommen wird, um nicht versehentlich Saugen Eigelb in die Nadel. Wenn Zellen von einem Spender Embryo zu mehreren Hosts transplantiert werden sollen, ist es am besten, den Spender mit der Nadel nur einmal eingeben, um die Möglichkeit eines Schadens zu minimieren. Der Spender-Zellen können dann an die gewünschte Stelle übertragen werden in bis zu drei Host-Embryonen. Bei der Übertragung von Zellen, die aus zwei oder mehr Spender Embryonen in einem Host Embryo, ist es am besten, um Zellen aus jedem der Spender Embryonen in die gleiche Transplantation Nadel nehmen, bevor die Transplantation sie an einen Host-Embryo. Dies minimiert Schäden an den Host-Embryo, und sorgt dafür, dass die Zellen auf den gleichen Bereich des Embryos transferiert werden, so dass ihr Verhalten verglichen werden kann. Sehr wenig Mischen ocKöter zwischen dem Spender-Zellen innerhalb der Transplantation Nadel, daher sollten die Zellen auf einem einzigen Host, wenn mehr als ein Spender übertragen werden. Um die Wahrscheinlichkeit, dass die Spenderzellen wird, um die gewünschte Gewebe beitragen zu erhöhen, die Vertreibung der Spenderzellen, während die Nadel durch den Zielbereich gezogen werden, wie zum Ablegen der Zellen in einem einzigen Klumpen entgegen. Sobald die Zelle Transfers abgeschlossen sind, setzen Sie die gesamte Folie in eine Petrischale und Flut vorsichtig mit Pen / Strep EM. Im Laufe der nächsten Stunden die Methylcellulose wird sich auflösen, die Freigabe der Embryonen.
Abbildung 1: Mikroskop Set-up für die Herstellung von chimären Embryonen. A: A Präpariermikroskop Transplantation Rigg besteht aus einem mit Öl gefüllten Hamilton-Spritze mit einer Mikrometerschraube (a) zu einem mit Öl gefüllten Behälter (b) und die Transplantation Pipette (c) über eine 3-Wege-Hahn (d) verbunden. Die Transplantation Pipette auf eine grobe Mikromanipulator (e), die zu einer Grundplatte aus Metall (nicht dargestellt) über einen magnetischen Fuß (f) angebracht ist. Transplantationen sind auf der Bühne ein Stereomikroskop (g) mit Boden-Beleuchtung für optimale Optik ausgestattet ist. B: ein zusammengesetztes Mikroskop Transplantation Rigg besteht aus einem ähnlichen ölgefüllten Hamilton Spritze und Mikrometerschraube (a, b), aber in diesem Fall das Transplantat Pipette befindet sich auf einem Pipettenhalter (c), deren X, Y und Z Bewegungen gesteuert werden montiert entweder durch ein grobes (d) oder gut (e) Mikromanipulator. In diesem Beispiel ist der Mikromanipulator auf den Körper eines Fixed Stage-Mikroskop montiert ist, ist es jedoch auch möglich, ihn auf der Bühne eines normalen Mikroskop zu montieren. Die Embryonen, die in Methylcellulose auf eine Depression gleiten immobilisiert sind, visualisiert mit einem 10fach Objektiv (f). C: Transplant Form zur Immobilisierung von Embryonen für Stereomikroskop Transplantationen. Dechorionated Embryonen sind einzeln in Vertiefungen durch Gießen dieser Form in Agarose in einem 90mm-Petrischale gemacht gesunken. Die Abmessungen der Brunnen gezeigt.
Bild 2: Montage Embryonen für die Gastrula-Stadium Transplantationen. A: Idealform eines Gastrula Transplantation Pipette. Eine Fase mit einer scharfen Spitze Hilfsmittel bei der Durchdringung des Embryos. B: Immobilisierung Spender und Wirt Embryonen in Methylcellulose. Ein Streifen von Methylcellulose ist in der Vertiefung einer Depression gleiten gelegt und überflutete mit einem großzügigen Betrag von Embryos Medium. Die Embryonen werden auf den Embryo zugesetzt und sind auf die Methylcellulose mit einer kleinen Schleife (C) gerollt. DG Erweiterung der Embryonen in Abb.. 1B. D: Der Spender Embryo orientiert sich am einfachsten Zugang für die Pipette zu ermöglichen, da die Zellen in diesem Stadium noch nicht gebunden. Beispiel: Shield-Stadium Host Embryonen sind so ausgerichtet, dass der Zielregion oberste ist. Zellen in den boxed Regionen verpflanzt wird dorsal Hinterhirn und kranialen Neuralleiste von links (E) und rechts (G) Seiten oder das ventrale Hinterhirn und Rückenmark (F) abgeleitet beitragen.
Abbildung 3: Repräsentative Bilder von chimären Embryonen.
(AC) 18hpf chimären Embryonen durch Transplantation am Schild der Bühne in dorsaler Ansicht gezeigt generiert, anterior nach links. (A, B) Sortierfunktionen für Zelloberflächenrezeptor EphA4 durch die Analyse von chimären Embryonen ergab. Left-Panels: merge von Rhodamin-markierten (rhod.) Spenderzellen (rot) und transgenen GFP in bestimmten Segmenten Hinterhirn (grün) zum Ausdruck gebracht. (A) WT-Zellen dazu beitragen, die gesamte Hinterhirn einer Kontrolle chimären Embryos. (B) EphA4 verarmten Spender-Zellen werden aus einzelnen Segmenten im Hinterhirn eines WT-Host ausgeschlossen. (C) Spenderzellen zu verschiedenen Teilen des Neuralrohrs in Schild-Stufen-Transplantationen ausgerichtet. Donor-Zellen (rot) gezielt auf das Vorderhirn / Mittelhirn (linkes Bild) oder Hinterhirn / Rückenmark (rechts) eines WT-Host gegengefärbt mit einem EfnB2a Antikörper, der das Vorderhirn Marken-, Mittel-Hinterhirn-Grenze und das mittlere Segment der Hinterhirn (grün). Maßstab: 50 um.
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Discussion
Die Leichtigkeit, mit der Transplantation verwendet werden, um gezielte Chimären hergestellt werden können, ist eine der großen Mächte der Zebrafisch als Modell Wirbeltiere. Eine Modifikation dieses Protokoll nicht oben beschrieben ermöglicht die Analyse der mütterlichen Genfunktion für Gene, die mit wesentlichen Rollen in zygotischen Entwicklung. Da diese Mutanten Fische können nicht bis ins Erwachsenenalter überleben, ist es notwendig, die Mutante Keimbahn in einen ansonsten Wildtyp-Host-Embryo-Transfer, die Schaffung von "Keimbahn-Klone" von mutierten Zellen. Generieren Keimbahn Mosaiken beinhaltet Verpflanzung primordialen Keimzellen aus einer Mutante Spender zu einem Wildtyp-Host-Embryo. Im Gegensatz zu allen anderen Zelllinien im Embryo, ist die Keimzelle Linie sehr früh in der Entwicklung durch die Vererbung von mütterlicher Determinanten 5,6 angegeben. So ist die erste Herausforderung, Keimbahn-Mosaiken Identifizierung der primordialen Keimzellen (PGC) in den Spender Embryo. Am midblastula Stufen der PGCs entlang des Randes 7,8 befinden, so Kommissionierung bis 50-100 random Zellen aus dem Rand einer Linie markierte Spender Embryo führt häufig bei der Übertragung von PGCs. Wenn das Tier Pol einer unbeschrifteten Host Embryo übertragen, die primordialen Keimzellen aktiv an der mutmaßlichen Gonade, wo sie eindeutig nach 24 Stunden der Entwicklung kann durch ihre charakteristische Position, Größe und Farbe Zurückbehaltungsrecht aufgrund ihrer langsamen proliferative Rate identifiziert migrieren 9-11. Inzwischen Donor-abgeleitete, nicht PGCs wird das Schicksal durch ihre Lage in der Host bestimmt zu erwerben: in erster Linie Vorderhirn und Augen, wenn sie der Blastula animalen Pol transplantiert wurden. Injektion der Host-Embryo mit Morpholinos, dass Knock-down der Sackgasse Gen effektiv zu beseitigen Host Keimbahn in einer Zelle-autonome Weise, so dass auch einem einzigen Spender-derived PGC kann die gesamte Keimbahn 10,12 (CM, eigene Beobachtung) neu zu besiedeln. In jüngerer Zeit hat eine transgene Linie, die PGCs in lebenden Embryos visualisiert werden während der Blastula Stufen ermöglicht wurde 13 entwickelt. Wenn überquerte in der Mutante, deren mütterliche Funktion zu bestimmen ist, wird dieses Transgen, mit der Sackgasse Morpholinos, machen Keimbahn Transplantationen facile, weil einzelne PGCs können identifiziert und verpflanzt in eine Keimbahn-abgereicherten Host.
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Acknowledgments
Dank den Mitgliedern des Moens Labor für hilfreiche Eingang beim Schreiben dieses Artikels. HK ist Postdoktorand von NIH / NICHD gewähren # 5R01HD037909-08 unterstützt. CBM ist ein Ermittler mit dem Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Injection rig | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | Foot pedal can be ordered separately |
| Pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | protease type XIV” |
| Pen-Strep | Sigma-Aldrich | P4458 | 100x stock |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M-0387 | |
| Fluorescent dextrans | Molecular Probes, Life Technologies | various | Eg. lysine-fixable rhodamine dextran (D7162) |
| Injection pipettes (1.2mmx0.94mmx10cm) | Sutter Instrument Co. | BF120-94-10 | |
| Transplant pipette option 1 | World Precision Instruments, Inc. | TW100-4 | |
| Transplant pipette option 2 | VWR international | #53508-400 | |
| micromanipulator | Narishige International | UMJ-3FC (?) | |
| Micromanipulator magnetic stand | Narishige International | GJ-1 | |
| Transplant apparatus | Sutter Instrument Co. | MI-10010 | |
| Fine micromanipulator | Narishige International | MMO-203 | |
| Depression slides | Fisher Scientific | 12560A | |
| Agar molds for injection and transplants | AL-AN Mfg, Inc. | ||
Reagents: Recipes for many of the reagents used for these procedures are found in The Zebrafish Book, which is available in full online at http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Recipes are provided there for preparation of Fish Water, Embryo Medium with and without antibiotics, pronase for dechorionating, fluorescent dextrans, and methyl cellulose. |
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References
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- Kimmel, C. B., Warga, R. M. Cell lineage and developmental potential of cells in the zebrafish embryo. Trends Genet. 4, 68-74 (1988).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. Origin and organization of the zebrafish fate map. Development. 108, 581-594 (1990).
- Woo, K., Fraser, S. E. Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system. Development. 121, 2595-2609 (1995).
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- Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells. Development. 124, 3157-3165 (1997).
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- Ciruna, B. Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germ-line replacement. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14919-14924 (2002).
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