Summary
هذا هو أسلوب لتوليد اجنة gynogenetic الزرد مضاعفا (الأجنة التي الوراثية فقط المساهمة يأتي من الأم) من خلال منع الانتصافي الدرجة الثانية مباشرة بعد التسميد مع الحيوانات المنوية للضوء فوق البنفسجي المعطل. EP الأجنة ليست متماثلة اللواقح تماما بسبب إعادة التركيب خلال تقسيم الانتصافي الأولى ، ومع ذلك فهي متماثل في جميع مواضع التي لم يتم فصلها عن السنترومير من خلال إعادة التركيب.
Abstract
تغاير الزيجوت في حقيقيات النوى مضاعفا كثيرا ما يجعل الدراسات الجينية مرهقة. الأساليب التي تنتج ذرية صالحة ضعفاني متماثل مباشرة من الإناث متخالف يسمح فحص الإناث mutagenized F1 مباشرة عن الطفرات الضارة في الشاشة تسارع الوراثية إلى الأمام. Streisinger وآخرون.
Protocol
نظرة عامة على الضغط المبكر
ملاحظة : وصفات للعديد من الكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول مثل tricaine ، أسماك المياه المالحة ، وهانكس على شبكة الإنترنت في الفصل 10 من كتاب اسماك الزرد 3 ( http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html )
- انتاج أجنة التي التخصيب في المختبر باستخدام الحيوانات المنوية المعطل للأشعة فوق البنفسجية.
- على الفور نقل البويضات المخصبة إلى قارورة زجاجية (مع غطاء من البلاستيك المفاجئة) شغل حتى أسنانها مع الماء البيض. تغطية نهاية مفتوحة للفيال مع ورقة رقيقة من المطاط والمفاجئة الأعلى (الذي كان في قطع حفرة) على القارورة على المطاط.
- مكان القنينة في الصحافة الهيدروليكية وبمبلغ 1.4 دقيقة بعد الإخصاب زيادة الضغط على 8000 رطل (لاحظ أنه يتم معايرة مكابس عديدة لقراءة الضغوط التي تمارس على المكبس قطرها 2 بوصة ، ويجب أن يتم تحويلها إلى قراءات رطل)
- تبدأ في 6 دقائق بعد الإخصاب ، والإفراج عن الضغط تدريجيا على مدى فترة من 1 دقيقة.
إجراءات تفصيلية الضغط المبكر
- قبل يوم من التجربة
- في وقت متأخر بعد الظهر ، على أن تقلص منفصلة للذكور والإناث. ويمكن استخدام أي من الذكور منذ القديم انه لن تساهم المواد الجينية. وينبغي أن الإناث تبدو كبيرة والدهون في البطن. وينبغي أن ننظر الذكور الصفراء وشيق.
- عقد الإناث والذكور بين عشية وضحاها على حدة في خزانات حيث يمكن الوصول إليها بسهولة في الصباح.
- صباح التجربة
- إعداد هانكس الحل ؛ إضافة بيكربونات الصوديوم.
- تقديمهم للمنشأة السمكية : دلو الثلج ، هانكس ، Tricaine ، الموقت ، وأنابيب لجمع الحيوانات المنوية.
- تمييع Tricaine في أسماك المياه
- جمع الحيوانات المنوية
- إعداد قنينة حل واضح للهانكس على الجليد. أن تكون محشورة قياس ~ 50 ميكرولتر لكل من الذكور.
- تخدير 3 أو 4 ذكور في وقت واحد عن طريق الغمر في tricaine. ويمكن رفعها من مخدر مع ملعقة من البلاستيك.
- شطف في أسماك المياه وصمة عار "الرطب الجاف" على منشفة ورقية (مهم جدا : الماء ينشط الحيوانات المنوية).
- جبل الأسماك في حامل رغوة تحت stereomicroscope في التكبير المنخفضة مع البرنامج الموسع للتمنيع ، الإضاءة. فصل زعانف الحوض مع ملقط وموقف microcapillary في افتتاح مجرور.
- السكتة الدماغية جانبي السمك بلطف ولكن بحزم مع ملقط (ميليبور) على نحو سلس.
- كما حليبي الحيوانات المنوية تخرج من مسام الأعضاء التناسلية ، وأنه جمع في microcapillary باستخدام الشفط لطيف.
- تجمع الحيوانات المنوية من الذكور في العديد من الجليد المالحة الباردة وهانك. الحيوانات المنوية من الذكور 50-10 كافية لتلقيح البيض عدة مئات. والحيوانات المنوية في لهانكس الباردة مواصلة تخصيب البيض بكفاءة لعدة ساعات أو حتى أيام. "مقلة العين" تركيز الحيوانات المنوية ، وجمع ما يكفي لجعل التعليق غائما.
- الأشعة فوق البنفسجية تعطيل الحيوانات المنوية
- ملء الجزء السفلي من طبق بيتري الزجاج مع الجليد.
- watchglass وضع على رأس الجليد في الطبق.
- باستخدام ماصة باستور ، ونقل الحيوانات المنوية من أنبوب الاختبار على وwatchglass. تأكد من الحصول على أكبر قدر من الحيوانات المنوية في ماصة ممكن دون تناول أي فقاعات من الهواء معها. أيضا ، لا فقاعة الحيوانات المنوية في watchglass كما كنت طردهم من ماصة. طرد الحيوانات المنوية في طبقة رقيقة حتى على الزجاج ووتش. تجاهل هذا ماصة.
- ضع طبق بيتري الى رابط العرضي للأشعة فوق البنفسجية
- بدوره على crosslinker لمدة 2 دقيقة
- باستخدام ماصة نظيفة وإزالة الحيوانات المنوية من watchglass وتحويلها إلى أنبوب إيبندورف ملحوظ الحيوانات المنوية للأشعة فوق البنفسجية ووضعت على الجليد.
- جمع البيض والإخصاب في المختبر
- تخدير ثلاث أو أربع إناث في وقت tricaine.
- شطف في أسماك المياه وصمة عار "الرطب الجاف" على منشفة ورقية. سوف تنتفخ المياه الزائدة من البيض ومنع الإخصاب.
- تضع الأنثى في طبق بتري 35 ملم مع البلاستيك والأصابع (وليس الرطب) رطب ، اضغط بلطف ولكن بحزم على البطن. إذا كانت مستعدة لوضع البيض ، وسوف يخرج بسهولة تامة.
- جمع البيض مع ملعقة والعودة الأنثى في الماء. البيض الجيدة هي مصفر اللون الشفاف ، بينما البيض التي بقيت في الأنثى طويلة جدا من البيض والمائي (أنظر أدناه). لضمان الحصول على البيض جيدا ، وجمع منها خلال الساعات الأولى بعد 2 تتسلط الأضواء على منشأة في الأسماك. إبقاء البيض مغطاة لمنع جفاف التدريجي.
- إضافة 30-50 ميكرولتر لتعليق الحيوانات المنوية للأشعة فوق البنفسجية إلى البيض ، ويحرك بلطف مع تلميح ماصة.
- فوريلاي إضافة حوالي 1 مل من أسماك المياه وبدء الموقت. وغادر لوضع البيض عند هذه النقطة يكون haploids.
- . الضغط المبكر ملاحظة : يجب أن يتم إنجاز خطوات خلال 90 ثانية AG التسميد!
- بدء الموقت في اللحظة التي يتم تفعيلها البيض عن طريق إضافة المياه
- انتظر لحظات قليلة ، وإضافة المزيد من الماء ، ودوامة البيض إلى وسط الطبق.
- باستخدام ماصة باستير قطع ومصقول ، ونقل البويضات المخصبة إلى قارورة الضغط.
- إذا لزم الأمر ، إضافة المزيد من الماء إلى البيض قارورة بحيث تفيض تقريبا ، مما أسفر عن حبة من الماء في الشفة من قوارير.
- مكان بارز المطاط على حبة من المياه وتأمين غطاء من البلاستيك المطاط.
- مكان القنينة (ق) رأسا على عقب في الاسطوانة الضغط ، إضافة المزيد من الماء البيض لاعادة ملء الاسطوانة. وضعت على رأس الاسطوانة بشكل آمن.
- وضع اسطوانة في الصحافة مع ما يصل المكبس وتطبيق £ 8000 / متر مربع. في.
- ترك اسطوانة في الصحافة حتى 6 دقائق بعد وقت التنشيط (لفترة ما مجموعه 4.5 دقيقة من الضغط).
- في 6 دقائق بعد التنشيط ، إزالة الاسطوانة من الصحافة ، وإزالة قارورة من الاسطوانة. الجافة بعناية قوارير لمنع تبريد للأجنة.
- إعادة الملء للاسطوانة والبيض مع الماء.
- تحضير القنينات المقبل عن طريق ملء جزئيا لهم المياه البيض حسب الحاجة.
- تكرار لجميع دفعات من البيض.
ملاحظة : الاسطوانة سوف يعقد ما يصل الى 3 قوارير في وقت واحد ، لذا قد تحتاج إلى تأخير تلقيح البيض بضع دقائق لمعرفة ما إذا كان بالفعل الأخريات في tricaine إعطاء البيض. وهذا سيساعد على تسريع الأمور أكثر من خلال معالجة دفعات في وقت واحد. أيضا ، تذكر مرة واحدة يتم استخدام الصحافة لا تضع أي المزيد من السمك في tricaine حتى يتم الانتهاء من العلاج. السماح الأسماك على البقاء في التخدير وقتا طويلا ويمكن قتلهم. ثانيا ، إذا كنت ضغط الأسماك في حين يتم استخدام الصحافة ، والحصول على البيض ، فإنها قد تكون جافة جدا لتكون مجدية في الوقت الذي يمكن استخدامه للصحافة مرة أخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
فمن المهم للتأكد من أن الأجنة التي تنتجها هذه الطريقة هي diploids gynogenetic صحيحا. والضوابط ، وتوليد مخلب مضاعفا من البيض العادي (عن طريق الحفاظ على ادخار بعض الحيوانات المنوية دون تعطيل الأشعة فوق البنفسجية) ومجموعة من الأجنة فرداني (عن طريق الحفاظ على مخلب جانبا من البويضات المخصبة مع الحيوانات المنوية للأشعة فوق البنفسجية دون المرور عبر إجراءات EP). في آخر 1 يوم الأجنة فرداني التسميد يكون محور الجسم القصير ، غير النظامية والدماغ الجسيدة التشكل. Haploids هي غير قابلة للتطبيق بعد 2-3 أيام. وينبغي أن تبدو وكأنها diploids EP diploids طبيعية ، على الرغم من عدم انتظام بعض "وحوش الجيش الشعبي" قد تحدث. ينبغي براثن diploids EP حد كبير (70-90 ٪) قابلة للحياة. وجود haploids في مخلب ضعفاني EP يشير إلى وجود قصور في عملية EP (على سبيل المثال ، الصحافة بعدم الاستمرار الضغط). وجود diploids في مخلب فرداني يوحي ناقصة تعطيل الحيوانات المنوية (على سبيل المثال فشل في crosslinker).
وقد استخدمت diploids EP لتحديد الجينات السنترومير مسافات 1 إلى المسوخ التي تم تحديدها في الخريطة الجينية للأمام شاشات 4،6. إلى الأمام شاشات الأجنة ضعفاني EP هي وسيلة فعالة لتحديد الجينات المسؤولة عن العمليات على حد سواء في وقت مبكر والتنموية في وقت لاحق ويتم استخدامها اليوم 5،7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
تم تطوير أساليب التخصيب في المختبر وdiploids gynogenetic لالزرد ووكر Charline في مختبر جورج Streisinger في جامعة اوريجون في 1970s و 1980s. الطريقة الموضحة هنا هي من دون تغيير بروتوكولات Charline والتي تتوفر في كتاب الكامل في اسماك الزرد 3.
تم تطوير أساليب التخصيب في المختبر وdiploids gynogenetic لالزرد ووكر Charline في مختبر جورج Streisinger في جامعة اوريجون في 1970s و 1980s. الطريقة الموضحة هنا هي من دون تغيير بروتوكولات Charline والتي تتوفر في كتاب الكامل في اسماك الزرد 3.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | ||
| Watch glass | |||
| French Press | |||
| Pressure cylinder | |||
| Instant ocean | |||
| Pasteur pipettes | Cut off the narrow end, fire polish | ||
| UV cross-linker | |||
| microcapillaries |
References
- Streisinger, G. Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish. Genetics. 112 (2), 311-311 (1986).
- Streisinger, G. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-293 (1981).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).
- Johnson, S. L., Africa, D., Horne, S., Postlethwait, J. H. Half-tetrad analysis in zebrafish: mapping the ros mutation and the centromere of linkage group I. Genetics. 139 (4), 1727-1727 (1995).
- Beattie, C. E., Raible, D. W., Henion, P. D., Eisen, J. S. Early pressure screens. Methods Cell Biol. 237 (71), 2575-25 (1999).
- Johnson, S. L. Centromere-linkage analysis and consolidation of the zebrafish genetic map. Genetics. 142 (4), 1277-1277 (1996).
- Trede, N. S. Zebrafish mutants with disrupted early T-cell and thymus development identified in early pressure screen. Dev Dyn. 237 (9), 2575-2575 (1999).
