Summary
Это видео-статья описывает, шаг за шагом, как обрабатывать сперму для достижения хорошего качества флуоресценции
Abstract
Анеуплоидии являются наиболее частыми хромосомных аномалий у человека. Большинство из этих нарушений в результате ошибки во время мейоза gametogenic процесса в родителях. В человеческих самцов, эти ошибки могут привести к производству сперматозоидов с числовым хромосомных аномалий, которые представляют повышенный риск передачи этих аномалий в потомстве.
По этой причине методика флуоресценции в гибридизация (FISH) на ядрах сперматозоидов стал протокол широко включены в контексте клинического диагноза. Эта практика позволяет оценить частоты численных хромосомных аномалий в гаметах пациентов, которые ищут генетические репродуктивного совет.
На сегодняшний день хромосом наиболее часто включаются в анализ спермы рыб хромосом X, Y, 13, 18 и 21.
Это видео-статья описывает, шаг за шагом, как обрабатывать и исправлять человеческие образцы спермы, как decondense и денатурировать спермы хроматина, как действовать, чтобы получить сперму подготовка рыбы, и, как визуализировать результаты на микроскоп. Особые замечания из наиболее важных шагов даны для достижения наилучших результатов.
Protocol
И. обработки проб и фиксации клеток
- Оставьте спермы в стерильных контейнерах при комнатной температуре в течение 20 минут, пока сжижения.
- Передача образца центрифуги трубки и вращать его в 1000 г. в течение 5 минут.
- Аккуратно снимите и выбросьте супернатант помощью пипетки Пастера.
- Добавить гипотонического раствора (KCl, 0.075M) предварительно нагревают при 37 ° С, по каплям, при перемешивании на вихревой для получения конечного объема 10 мл.
- Поместите пробирку в водяную баню с температурой 37 ° С в течение 30 минут.
- Центрифуга на 1000 г в течение 5 минут. Тщательно отказаться супернатант декантацией, не нарушая гранул.
- После ресуспендирования гранул, добавить свежеприготовленным фиксатором (3:1 метанол: уксусная кислота) Карнуа по каплям при перемешивании на вихревой для получения конечного объема 8 мл.
- Повторите пункты 6 и 7 столько раз, сколько необходимо для получения белых гранул.
- Добавить свежеприготовленный метанол: уксусная кислота (3:1) по капле настроить конечный объем сотовой концентрация, необходимая для получения хороших ячейки распространения (в тех случаях, с небольшой шарик, несколько капель будет достаточно, в то время как образцы с высоким содержанием спермы восстанавливается, окончательный объем может достигать 1-2 мл). Тест слайд может быть сделано путем отказа ресуспендировали образца на неподмазанного слайдов и изучения под микроскопом фазового контраста. Это позволит проверить сотовой дисперсии получены и позволит исправить ошибку, если это необходимо, в дальнейшем слайдов.
- Для того, чтобы расширений, падение с минимальной высотой 40 см, две-три капли суспензии клеток в центр слайда unfrosted (ранее сохраненные в метаноле при -20 ° С до обезжирить их). Для того чтобы расположение образца по всему протокол, отметьте область, содержащую сперматозоиды расширение на противоположной стороне слайда с помощью карандаша алмаза.
- Магазин слайды при температуре -20 ° С в течение не менее 24 часов.
Примечание: добавление метанола и уксусной кислоты (3:1) по каплям при перемешивании это очень важный шаг, чтобы избежать образования спермы агрегатов.
II. Деконденсации
- Слайды хранятся при температуре -20 ° С должны разморозить, чтобы продолжить протокол (оставить их при комнатной температуре).
- Место слайд в двух последовательных банки Коплин с 2x-солевой раствор цитрата натрия (2xSSC) в течение 3 минут каждый.
- Передача слайдов через серию этанола моет в течение 2 минут в каждую банку Коплин. Начните с 70% этанола, следуйте на 90%, а заканчивается 100%. Сухой из слайд оставить его при комнатной температуре.
- Инкубировать слайд в дитиотреитол решение (1,4-дитиотреитол 5 мм, 1% Triton X-100, 2-амино-2-(гидроксиметил) -1,3-пропандиол 50 мм) при температуре 37 ° C в инкубаторе с decondense хроматина. Этот продукт действует, нарушая дисульфидных мостов протамины, что катушка ДНК в сперматозоидах ядра. Это очень важный шаг, поскольку ДНК в сперме ядра спрессованный. Инкубационный период слайдов в дитиотреитол решение (DTT) должны быть скорректированы в соответствии с реактивностью образца к этому продукту. Как правило, это время около 8 минут, хотя она может варьироваться от 2 до 15 минут.
- Сразу же, передача слайд на два срока подряд банки Коплин с 2xSSC в течение 3 минут в каждой Коплин.
- Продолжить путем размещения слайдов через серию этанола моет в течение 2 минут в каждую банку Коплин (70%, 90% и 100% этанола). Пусть слайд высохнуть при комнатной температуре.
Примечание: Чрезмерное воздействие DTT приведет в дисперсных FISH сигналов в конце процедуры, в то время слишком короткое воздействие приведет к отсутствию некоторых сигналов.
III. Гибридизация
- Денатурации ДНК спермы путем инкубации слайдов в банке Коплин формамидом раствор (70% Formamide/2xSSC) при 73 ° С в течение 5 минут.
- Передача слайд через этанола решения в течение 1 минуты в Коплин банку (начните с 70% этанола, 85% и закончить с 100%). Оставьте слайд высыхать при комнатной температуре.
- Добавить непосредственно 5 л соответствующие готовые к использованию датчика смесь до 15x15 скольжения крышки (AneuVysion Пробирной Многоцветный Зонд панели: КЭП 18/X/Y или LSI 13/21).
- Как показано в видео, осторожно поместите слайд на покровное стекло, чтобы соединить регион цели и зонд смесью. Печать его с резинового клея.
- Место скользить в подогретого 37 ° C гибридизации камеры (HYBrite ™) и инкубировать ее при температуре 37 ° С в течение 6-24 часов.
Примечание: В то время как денатурация образец спермы является обязательным, необходимость денатурирующих зондов определяется производителем. Зонд смесей, используемых в этом протоколе готовы к использованию, и в этом случае зонд денатурации не требуется.
Объем зонд смесь будет варьироваться в зависимости от размера гибридизированных области.
IV. Моетпосле гибридизации
- Выньте слайд из гибридизации камеры.
- Снимите резиновый клей и тщательно вытащить покровным стеклом мягко скользящими в сторону.
- Для устранения неспецифической сигналы гибридизации место слайда в течение 2 минут в банку с Коплин 0.4xSSC/0.3% NP-40 предварительно нагревают при 73 ° С на водяной бане.
- Передача слайд 2xSSC/0.1% NP-40 промывочного раствора при комнатной температуре в течение 1 минуты. Пусть слайд высохнуть при комнатной температуре.
- Добавить counterstaining продукта к целевому региону (8 л для 18x18 скольжения обложки). Наиболее распространенным продуктом используется 4 ',6-diamidino-2-фенилиндола (DAPI, Vysis Inc.)
- Как показано в видео, крышка гибридизированных региона с покровным стеклом (для сохранения гибридизации покровным стеклом могут быть запечатаны с лаком для ногтей).
- Магазин гибридизированных слайды при температуре -20 ° C в темноте, пока их перспектива анализа. В этих условиях слайды могут храниться до 12 месяцев без значительных потеряли в интенсивности флуоресценции сигнал.
Примечание: более высокая температура или слишком много времени мыть может привести к ликвидации некоторых сигналов, в то время как противоположное не будет вымывать неспецифической гибридизации зонда.
Объем counterstaining продукт добавил варьируется в зависимости от размера гибридизации области до корки.
В. Визуализация
Препараты могут быть оценены в соответствии epifluorescence микроскоп с тройным полосовой фильтр для DAPI / Техас Красный / FITC и однозонной фильтры для Aqua, FITC и Техас Red. Стандартные критерии оценки должны следовать для правильной оценки спермы ядер 1.
Подготовка гибридизации с зондами для хромосом X, Y и 18 должен отображать сигналы для этих трех хромосом. Каждый нормальный сперматозоиды должны показать, одного синего сигнала (соответствующая хромосома 18), и зеленый сигнал (Х-сперматозоиды подшипник) или красный сигнал (Y-сперматозоиды подшипник).
При подготовке гибридизации с зондами для хромосомы 13 и 21, зеленый сигнал для хромосомы 13 и красный сигнал для хромосомы 21 следует различать в каждом нормальном сперматозоидов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает процесс человеческого образцы спермы для получения препаратов сперматозоидов FISH. Используя этот протокол, можно анализировать хромосомные аномалии в мужских гамет. Сперматозоиды анеуплоидии скрининга заявки либо в контексте фундаментальных исследований и в репродуктивной совет, данный бесплодных мужчин. Хотя в клинической диагностике наиболее широко изучается хромосомы X, Y, 13, 18 и 21, другие коммерческие зонды для широкого круга локусов хромосом и имеются в наличии и могут быть использованы в этих экспериментах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Женералитата Каталонии (2005-SGR00437). Авторы выражают благодарность Дж. Бланко и Ф. Видаль для их контроля и поощрения, и Дж. Лукас за техническую помощь.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Material | Roche Group | 10197777001 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol | Material | Roche Group | 10708976001 | |
| Acetic acid | Material | Merck & Co., Inc. | 100.063 | |
AneuVysion® Multicolor DNA Probe Kit
|
Material | Vysis Inc. | 32-161075
|
|
| Centrifuge 5804R | Tool | Eppendorf | ||
| Centrifuge tube | Material | Nalge Nunc international | 347856 | |
| Coplin jar (glass) | Material | Barloworld Scientific | Hellendahl (ZCT278) | |
| Coplin jar (plastic) | Material | Deltalab | 191087 | |
| Cover slips (15x15) | Material | Knittel Glaser | 4600115 | |
| Cover slips (18x18) | Material | Knittel Glaser | 4600118 | |
| Diamond pencil | Material | Hammacher | 335117010 | |
| Ethanol | Material | Merck & Co., Inc. | 100.983 | |
| Formamide | Material | Roche Group | 11814320001 | |
| Freezer | Tool | Zanussi | ||
| Gloves | Material | Sanyo | 101/3300 | |
| HYBrite™ | Tool | Vysis Inc. | ||
| Immersion Oil | Material | Olympus Corporation | 35505 | |
| Incubator | Tool | Heraeus Instruments | ||
| Methanol | Material | Merck & Co., Inc. | 106.009 | |
| Micropipette | Material | Labsystems | Finnpipette (4500000) | |
| Micropipette replacement tip | Material | Daslab | 16-2001 | |
| Nail varnish | Material | Quo-cosmetics | ||
| Olympus BX60 epifluorescence microscope | Tool | Olympus Corporation | Equipped with a triple-band filter for DAPI/Texas Red/FITC and single-band filters for Aqua, FITC and Texas Red. | |
| Pasteur Pipette | Material | Rubilabor | 211.0230 | |
| Phase contrast microscope | Tool | Nikon Instruments | ||
| Plastic pipette (3ml) | Material | Deltalab | 200007 | |
| Potassium chloride (KCl) | Material | Fluka | 60128 | |
| Rubber cement | Material | Best-test | ||
| Slides | Material | Knittel Glaser | 4520022 | |
| Slide Saver Boxes | Material | Deltalab | 19276.1 | |
| Sterile container | Material | Deltalab | 409726 | |
| Syringe | Material | PentaFerte | 002022300 | |
| Thermometer | Material | Comark Instruments, Inc | KM12 | |
| Tri-distilled water | Material | |||
| Triton X-100 | Material | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Tweezers | Material | B. Braun Medical | Aesculap (BD224R) | |
| Vertical laminar flow hood | Tool | Burdinola | OR-ST 1500 | |
| Vortex mixer | Tool | Fisher Scientific | FB15012 | |
| Water bath | Tool | Raypa® |
References
- Blanco, J., Egozcue, J., Vidal, F. Incidence of chromosome 21 disomy in human spermatozoa as determined by fluorescent in-situ hybridization. Hum. Reprod. 11, 722-726 (1996).
