Summary
Cette vidéo-article décrit, étape par étape, comment traiter un échantillon de sperme d'atteindre une bonne qualité de fluorescence
Abstract
Aneuploïdies sont les anomalies les plus fréquentes chromosomiques chez l'homme. La plupart de ces anomalies résultent d'erreurs durant le processus de la méiose gamétogènes chez les parents. Dans les mâles humains, ces erreurs peuvent conduire à la production de spermatozoïdes avec des anomalies chromosomiques numériques qui représentent un risque accru de transmission de ces anomalies à la descendance.
Pour cette raison, la technique de l'hybridation fluorescente in situ (FISH) sur noyaux de spermatozoïdes est devenu un protocole largement intégrées dans le contexte du diagnostic clinique. Cette pratique donne une estimation de la fréquence des anomalies chromosomiques numériques dans les gamètes des patients qui cherchent des conseils de reproduction génétique.
À ce jour, les chromosomes les plus fréquemment inclus dans l'analyse FISH des spermatozoïdes sont les chromosomes X, Y, 13, 18 et 21.
Cette vidéo-article décrit, étape par étape, comment traiter et résoudre un échantillon de sperme humain, comment decondense et dénaturer la chromatine des spermatozoïdes, la façon de procéder pour obtenir les préparations de poisson du sperme, et la façon de visualiser les résultats au microscope. Remarque spéciale sur les étapes les plus pertinents sont donnés pour atteindre les meilleurs résultats.
Protocol
Le traitement des échantillons et la fixation des cellules I.
- Laisser l'échantillon de sperme dans des contenants stériles à température ambiante pendant 20 minutes jusqu'à liquéfaction.
- Transférer l'échantillon dans un tube de centrifugeuse et il tourne à 1000g pendant 5 minutes.
- Retirer délicatement et jeter le surnageant à l'aide d'une pipette Pasteur.
- Ajouter une solution hypotonique (KCl, 0,075 M) pré-chauffé à 37 ° C, goutte à goutte, tout en mélangeant sur un vortex pour obtenir un volume final de 10 ml.
- Placer le tube dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 30 minutes.
- Centrifuger à 1000g pendant 5 minutes. Soigneusement jeter le surnageant par décantation, sans perturber le culot.
- Après remise en suspension du culot, ajouter fraîchement préparés fixateur de Carnoy (méthanol 03h01: acide acétique) goutte à goutte tout en mélangeant sur un vortex d'obtenir un volume final de 8 ml.
- Répéter les points 6 et 7 autant de fois que nécessaire pour obtenir une pastille blanche.
- Ajouter méthanol fraîchement préparés: acide acétique (3:1) goutte à goutte pour ajuster le volume final à la concentration cellulaire nécessaire à l'obtention de cellules bonne répartition (dans ces cas avec une petite pastille, quelques gouttes suffiront alors que les échantillons avec une grande quantité des spermatozoïdes récupérés, le volume final peut atteindre 1-2 ml). Une lame de test peut être fait en laissant tomber l'échantillon en suspension sur une lame non graissée et de l'examiner sous un microscope à contraste de phase. Cela vous permettra de vérifier la dispersion cellulaire obtenue et lui permettrait de corriger, s'il est nécessaire, dans les diapositives supplémentaires.
- Pour faire les extensions, chute d'une hauteur minimale de 40 cm à deux ou trois gouttes de suspension cellulaire dans le centre de glisse non glacés (précédemment stockées dans le méthanol à -20 ° C pour les dégraisser). Afin de permettre la localisation de l'échantillon tout au long du protocole, de marquer la zone contenant l'extension du sperme sur le côté opposé de la lame à l'aide d'un crayon de diamant.
- Stocker les diapositives à -20 ° C pendant au moins 24 heures.
Remarque: L'ajout de méthanol: acide acétique (3:1) goutte à goutte tout en mélangeant une étape très importante pour éviter la formation d'agrégats de sperme.
II. Décondensation
- Les diapositives stockées à -20 ° C doit être dégivré pour continuer avec le protocole (les laisser à température ambiante).
- Placer la lame dans deux jarres Coplin consécutifs avec une solution de citrate de sodium salin 2x (2xSSC) pendant 3 minutes chacune.
- Transférer le glisser à travers une série de lavages éthanol pendant 2 minutes dans chaque jarre de Coplin. Commencez avec 70% d'éthanol, suivi par 90% et terminer avec 100%. Déshydrater la glisser le laissant à température ambiante.
- Incuber la lame dans une solution de dithiothréitol (1,4-dithiothréitol 5mM, 1% de Triton X-100, 2-amino-2-(hydroxyméthyl) -1,3-propanediol 50mm) à 37 ° C dans l'incubateur à decondense la chromatine. Ce produit agit en brisant les ponts disulfures de la protamines que la bobine de l'ADN dans le noyau des spermatozoïdes. C'est une étape très importante car l'ADN dans le noyau du spermatozoïde est très compacté. Le temps d'incubation des lames dans une solution de dithiothréitol (DTT) doit être ajustée en fonction de la réactivité de l'échantillon de ce produit. Habituellement, ce temps est d'environ 8 minutes, mais il peut varier de 2 à 15 minutes.
- Immédiatement, le transfert de la diapositive à deux mandats consécutifs de jarres Coplin avec 2xSSC pendant 3 minutes dans chaque Coplin.
- Continuer en plaçant la lame à travers une série de lavages éthanol pendant 2 minutes dans chaque jarre de Coplin (70%, 90% et 100% d'éthanol). Laissez la lame sécher à température ambiante.
Remarque: Une exposition excessive à la TNT entraînerait dispersent signaux FISH à la fin de la procédure, alors qu'une exposition trop courte donnerait lieu à un manque de certains signaux.
III. Hybridation
- Dénaturer l'ADN des spermatozoïdes en incubant la lame dans un bocal avec une solution de formamide Coplin (70% Formamide/2xSSC) à 73 ° C pendant 5 minutes.
- Transfert de la diapositive à travers des solutions d'éthanol pour 1 minute par Coplin jar (commencer avec 70% d'éthanol, 85% et terminer avec 100%). Laisser la lame sécher à température ambiante.
- Ajouter directement 5 l de l'correspondante de prêt-à-utiliser un mélange de sonde d'une lamelle 15x15 (Assay AneuVysion Sonde Panneau multi-couleurs: CEP 18/X/Y ou LSI 13/21).
- Comme il est montré dans la vidéo, placer soigneusement la glisser sur la lamelle de mettre sur pied la région cible et le mélange de la sonde. Scellez avec du ciment en caoutchouc.
- Placer la lame dans un 37 pré-chauffé ° C chambre d'hybridation (HYBrite ™) et incuber à 37 ° C pendant 6-24 heures.
Remarque: Alors que la dénaturation de l'échantillon de sperme est obligatoire, la nécessité de dénaturation des sondes est déterminé par le fabricant. Les mélanges sonde utilisée dans ce protocole sont prêts à utiliser et, dans ce cas, la dénaturation de sonde n'est pas nécessaire.
Le volume du mélange de sondes varie en fonction de la taille de la zone hybride.
IV. Lavepost-hybridation
- Sortez la lame de la chambre d'hybridation.
- Enlever la colle au caoutchouc et tirez délicatement sur la lamelle glissant doucement sur le côté.
- Afin d'éliminer les signaux d'hybridation non spécifiques placer la lame pendant 2 minutes dans une jarre de Coplin avec 0.4xSSC/0.3% NP-40 pré-chauffé à 73 ° C dans un bain d'eau.
- Transfert de la diapositive à une solution 2xSSC/0.1% NP-40 lavage à température ambiante pendant 1 minute. Laissez la lame sécher à température ambiante.
- Ajouter un produit contre-coloration à la région cible (8 l pour une lamelle de 18x18). Le produit le plus couramment utilisé est de 4 ',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, Vysis Inc.)
- Comme il est montré dans la vidéo, la couverture de la région hybridée avec une lamelle (pour préserver l'hybridation de la lamelle peut être scellé avec du vernis à ongles).
- Stocker les lames hybridées à -20 ° C dans l'obscurité jusqu'à leur analyse perspective. Dans ces conditions, les diapositives peuvent être stockées pendant 12 mois sans perte vraiment importante dans l'intensité du signal de fluorescence.
Remarque: Une température plus élevée ou un temps de lavage excessif peut entraîner l'élimination de certains signaux, alors que l'inverse ne serait pas laver la sonde hybridations non spécifiques.
Le volume du produit de contre-coloration ajoutée varie en fonction de la taille de la zone d'hybridation pour la couverture.
Visualisation V.
Les préparations peuvent être évalués sous un microscope à épifluorescence équipé d'un filtre à triple bande pour DAPI / Texas Red / FITC et simples filtres à bande pour Aqua, FITC et au Texas Red. Critères d'évaluation standard doivent être suivies pour l'évaluation correcte des noyaux 1 sperme.
La préparation hybridé avec des sondes pour les chromosomes X, Y et 18 devraient afficher des signaux de ces trois chromosomes. Chaque spermatozoïde normal doit montrer un signal bleu (correspondant au chromosome 18), et un signal vert (X portant spermatozoïdes) ou un signal rouge (Y portant spermatozoïdes).
Dans la préparation hybridé avec des sondes pour les chromosomes 13 et 21, un signal vert pour le chromosome 13 et un signal rouge pour le chromosome 21 doit être distingué dans tous les spermatozoïdes normaux.
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Discussion
Ce protocole décrit comment traiter les échantillons de sperme de l'homme pour obtenir les préparations de poisson sperme. L'utilisation de ce protocole, il est possible d'analyser des anomalies chromosomiques dans les gamètes mâles. Les spermatozoïdes aneuploïdie de dépistage a des applications soit dans le contexte de la recherche fondamentale et dans les conseils de reproduction donnée aux hommes infertiles. Bien que dans le diagnostic clinique des chromosomes les plus étudiées sont X, Y, 13, 18 et 21, d'autres sondes commerciales pour une large gamme de chromosomes et loci sont disponibles et peuvent également être utilisées dans ces expériences.
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Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437). Les auteurs remercient J. Blanco et F. Vidal pour leur supervision et d'encouragement, et J. Lucas pour son assistance technique.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Material | Roche Group | 10197777001 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol | Material | Roche Group | 10708976001 | |
| Acetic acid | Material | Merck & Co., Inc. | 100.063 | |
AneuVysion® Multicolor DNA Probe Kit
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Material | Vysis Inc. | 32-161075
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| Centrifuge 5804R | Tool | Eppendorf | ||
| Centrifuge tube | Material | Nalge Nunc international | 347856 | |
| Coplin jar (glass) | Material | Barloworld Scientific | Hellendahl (ZCT278) | |
| Coplin jar (plastic) | Material | Deltalab | 191087 | |
| Cover slips (15x15) | Material | Knittel Glaser | 4600115 | |
| Cover slips (18x18) | Material | Knittel Glaser | 4600118 | |
| Diamond pencil | Material | Hammacher | 335117010 | |
| Ethanol | Material | Merck & Co., Inc. | 100.983 | |
| Formamide | Material | Roche Group | 11814320001 | |
| Freezer | Tool | Zanussi | ||
| Gloves | Material | Sanyo | 101/3300 | |
| HYBrite™ | Tool | Vysis Inc. | ||
| Immersion Oil | Material | Olympus Corporation | 35505 | |
| Incubator | Tool | Heraeus Instruments | ||
| Methanol | Material | Merck & Co., Inc. | 106.009 | |
| Micropipette | Material | Labsystems | Finnpipette (4500000) | |
| Micropipette replacement tip | Material | Daslab | 16-2001 | |
| Nail varnish | Material | Quo-cosmetics | ||
| Olympus BX60 epifluorescence microscope | Tool | Olympus Corporation | Equipped with a triple-band filter for DAPI/Texas Red/FITC and single-band filters for Aqua, FITC and Texas Red. | |
| Pasteur Pipette | Material | Rubilabor | 211.0230 | |
| Phase contrast microscope | Tool | Nikon Instruments | ||
| Plastic pipette (3ml) | Material | Deltalab | 200007 | |
| Potassium chloride (KCl) | Material | Fluka | 60128 | |
| Rubber cement | Material | Best-test | ||
| Slides | Material | Knittel Glaser | 4520022 | |
| Slide Saver Boxes | Material | Deltalab | 19276.1 | |
| Sterile container | Material | Deltalab | 409726 | |
| Syringe | Material | PentaFerte | 002022300 | |
| Thermometer | Material | Comark Instruments, Inc | KM12 | |
| Tri-distilled water | Material | |||
| Triton X-100 | Material | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Tweezers | Material | B. Braun Medical | Aesculap (BD224R) | |
| Vertical laminar flow hood | Tool | Burdinola | OR-ST 1500 | |
| Vortex mixer | Tool | Fisher Scientific | FB15012 | |
| Water bath | Tool | Raypa® |
References
- Blanco, J., Egozcue, J., Vidal, F. Incidence of chromosome 21 disomy in human spermatozoa as determined by fluorescent in-situ hybridization. Hum. Reprod. 11, 722-726 (1996).
