Summary
此视频文章介绍，分步实施，如何处理精液样本，以实现优质的荧光
Abstract
非整倍体是在人类最常见的染色体异常。大多数这些异常的结果在父母gametogenic的过程中减数分裂错误。在人类男性中，这些错误可能会导致精子的生产与数值代表发送这些异常的后代的风险增加的染色体异常。
出于这个原因，荧光原位杂交技术（FISH）技术对精子核，已成为广泛应用于临床诊断的背景下成立一个协议。这种做法提供了一个估计的数值遗传生殖意见征求患者的配子染色体异常的频率。
迄今为止，精子FISH分析中最常见的染色体染色体的X，Ÿ，13，18和21。
此视频文章介绍，分步实施，如何处理和解决人类精液样本，如何decondense和变性的精子染色质，如何继续获得精子的鱼制品，以及如何在显微镜可视化的结果。特别说明的最相关的步骤，以达到最佳效果。
Protocol
一，样品处理和细胞固定
- 留在无菌容器在室温为20分钟，直到液化的精液样本。
- 样品转移到离心管中，并旋转千克5分钟。
- 轻轻取下并丢弃上清液用巴斯德吸管。
- 添加低渗溶液（氯化钾，0.075M）预先加热到37℃，一滴一滴，而上一个旋涡混合，获得了10毫升的最终体积。
- 管置于水浴中在37 ° C 30分钟。
- 在千克离心5分钟。小心丢弃上清液，通过调迁，而不会干扰颗粒。
- resuspending沉淀后，加入新鲜配制的卡诺固定液（3:1甲醇：冰醋酸）一滴一滴，而上一个旋涡混合获得终体积为8毫升。
- 需要多次重复6分和7个获得白色颗粒。
- 加入新鲜配制的甲醇：冰醋酸（3:1）一滴一滴地调整最终体积取得了良好的细胞扩散（用小颗粒的个案所需的细胞浓度，将几滴而样本足够高的金额精子的复苏，最终体积可以达到1-2毫升）。 ungreased幻灯片拖放到悬浮样品和检查相衬显微镜下，可以通过测试幻灯片。这将让检查获得的细胞分散，将使纠正它，如果它是必要的，进一步的幻灯片，的。
- 为了使扩展，从最低高度40厘米滴两三滴，进入unfrosted幻灯片中心的细胞悬液（先前储存在-20 ° C甲醇脱脂他们）。为了使样品的整个协议中的位置，包含幻灯片用金刚石铅笔对面的精子扩展标记的区域。
- 至少24小时，存放在-20 ° C的幻灯片。
注：除了甲醇：冰醋酸（3:1）一滴一滴地边搅拌是非常重要的一步，以避免形成精子聚集。
二。 Decondensation
- 幻灯片储存在-20 ° C必须解冻继续与协议（在室温下离开）。
- 在连续两个2X生理盐水柠檬酸钠溶液，每次3分钟（2xSSC）coplin罐放置的幻灯片。
- 通过一系列的乙醇洗涤2分钟，在每个coplin JAR传输的幻灯片。开始用70％乙醇，按照90％和100％完成。留在室温下干出来的幻灯片。
- 二硫苏糖醇的解决方案中的幻灯片（1,4 - 二硫苏糖醇5MM，1％Triton X - 100的的2 - 氨基-2 - （羟甲基）-1,3 - 丙二醇50MM）在37 ° C至孵化器decondense染色质。此产品的行为，打破protamines二硫键，线圈在精子细胞核的DNA。这是一个非常重要的一步，因为在精子细胞核的DNA是高度压缩。在二硫苏糖醇（DTT），解决方案的幻灯片的孵化时间必须调整，根据样品的反应本产品。通常情况下，这个时间是8分钟左右，虽然它可以从2至15分钟。
- 随即，转让幻灯片连续两个coplin 2xSSC罐每个coplin 3分钟。
- 继续放置2分钟的幻灯片，通过一系列乙醇洗涤，在每个coplin JAR（70％，90％和100％的乙醇）。让幻灯片在室温下进行干燥。
注意：数码地面电视的过度暴露会导致分散在该过程结束中的鱼类信号，而过短的曝光会导致缺乏某些信号。
三。杂交
- 精子DNA变性在coplin JAR孵化甲酰胺溶液（70％Formamide/2xSSC）在73 ° 5分钟的幻灯片。
- 通过乙醇溶液，每coplin JAR 1分钟（先用70％乙醇，85％和100％完成）转让的幻灯片。离开幻灯片，在室温下进行干燥。
- 直接添加5升的相应准备使用的探针混合到15x15盖玻片（AneuVysion含量多色探针小组：CEP 18/X/Y或LSI 13/21）。
- 因为它是在视频中，小心地放到盖玻片的幻灯片放在一起目标区域和探针混合物。用橡皮泥密封。
- 幻灯片放入预先加热37 °彗星杂交室（HYBrite™），并在37 ° C为6-24小时。
注：鉴于变性的精子样本是强制性的，变性的探针的必要性是由制造商决定 。 在本议定书中所使用的探针混合物准备使用，在这种情况下，不需要探针变性。
根据杂交面积的大小，探针混合物的体积会有所不同。
四。洗杂交后
- 从杂交室取出的幻灯片。
- 取出橡皮泥，小心地拉出盖玻片，轻轻滑动到一侧。
- 为了消除非特异性的杂交信号coplin JAR放置在一个2分钟的幻灯片0.4xSSC/0.3％NP - 40前预热在73 ° C在水浴。
- 传输一个2xSSC/0.1％NP - 40洗解决方案，在室温1分钟的幻灯片。让幻灯片在室温下进行干燥。
- 添加counterstaining产品的目标区域（8个18x18盖玻片L）。最常见的产品中使用的是4',6 - diamidino - 2 -苯基吲哚（DAPI，Vysis公司）。
- 因为它是在视频中，盖上盖玻片（保持杂交，可以用指甲油密封盖玻片）杂交的地区。
- 商店在黑暗中的杂交幻灯片，在-20 ° C，直到他们的前景分析。在这些条件下的幻灯片，可以存储长达12个月无明显的荧光信号强度丢失。
注：较高的温度或过度的清洗时间可以消除一些信号，而相反的，不会洗出非特异性探针杂交。
counterstaining附加值产品的体积会有所不同，根据杂交面积覆盖的大小。
五，可视化
配备一个带通滤波器的DAPI /得克萨斯红/ FITC和单波段水色，FITC和德克萨斯红滤波器三重epifluorescence显微镜下，可以评估的筹备工作。必须遵循的精子细胞核1的正确评价标准的考核标准。
这三种染色体的制备杂交探针与染色体X，Y和18显示的信号。每个正常的精子必须显示一个蓝色信号（对应的18号染色体），和一个绿色的信号（X -轴承精子）或红色的信号（Y -轴承精子）。
在染色体13和21，13号染色体和21号染色体的一个红色信号的绿色信号的探针杂交编制，应加以区别，在每一个正常的精子。
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Discussion
本协议描述了如何处理人类获得精子鱼制品的精液样本。使用该协议有可能在雄配子染色体异常分析。精子非整倍体筛查的应用无论是在基础研究方面，在不育男性的生殖意见。虽然在临床诊断中最广泛研究的染色体，X，Y，13，18和21，其他商业探针的染色体和基因位点的广泛可用，也可以在这些实验中使用。
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Acknowledgments
这项工作是支持的Generalitat加泰罗尼亚（2005 - SGR00437）。作者感谢J.布兰科和维达尔楼，他们的监督和鼓励，并为他的技术援助研究卢卡斯。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Material | Roche Group | 10197777001 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol | Material | Roche Group | 10708976001 | |
| Acetic acid | Material | Merck & Co., Inc. | 100.063 | |
AneuVysion® Multicolor DNA Probe Kit
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Material | Vysis Inc. | 32-161075
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| Centrifuge 5804R | Tool | Eppendorf | ||
| Centrifuge tube | Material | Nalge Nunc international | 347856 | |
| Coplin jar (glass) | Material | Barloworld Scientific | Hellendahl (ZCT278) | |
| Coplin jar (plastic) | Material | Deltalab | 191087 | |
| Cover slips (15x15) | Material | Knittel Glaser | 4600115 | |
| Cover slips (18x18) | Material | Knittel Glaser | 4600118 | |
| Diamond pencil | Material | Hammacher | 335117010 | |
| Ethanol | Material | Merck & Co., Inc. | 100.983 | |
| Formamide | Material | Roche Group | 11814320001 | |
| Freezer | Tool | Zanussi | ||
| Gloves | Material | Sanyo | 101/3300 | |
| HYBrite™ | Tool | Vysis Inc. | ||
| Immersion Oil | Material | Olympus Corporation | 35505 | |
| Incubator | Tool | Heraeus Instruments | ||
| Methanol | Material | Merck & Co., Inc. | 106.009 | |
| Micropipette | Material | Labsystems | Finnpipette (4500000) | |
| Micropipette replacement tip | Material | Daslab | 16-2001 | |
| Nail varnish | Material | Quo-cosmetics | ||
| Olympus BX60 epifluorescence microscope | Tool | Olympus Corporation | Equipped with a triple-band filter for DAPI/Texas Red/FITC and single-band filters for Aqua, FITC and Texas Red. | |
| Pasteur Pipette | Material | Rubilabor | 211.0230 | |
| Phase contrast microscope | Tool | Nikon Instruments | ||
| Plastic pipette (3ml) | Material | Deltalab | 200007 | |
| Potassium chloride (KCl) | Material | Fluka | 60128 | |
| Rubber cement | Material | Best-test | ||
| Slides | Material | Knittel Glaser | 4520022 | |
| Slide Saver Boxes | Material | Deltalab | 19276.1 | |
| Sterile container | Material | Deltalab | 409726 | |
| Syringe | Material | PentaFerte | 002022300 | |
| Thermometer | Material | Comark Instruments, Inc | KM12 | |
| Tri-distilled water | Material | |||
| Triton X-100 | Material | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Tweezers | Material | B. Braun Medical | Aesculap (BD224R) | |
| Vertical laminar flow hood | Tool | Burdinola | OR-ST 1500 | |
| Vortex mixer | Tool | Fisher Scientific | FB15012 | |
| Water bath | Tool | Raypa® |
References
- Blanco, J., Egozcue, J., Vidal, F. Incidence of chromosome 21 disomy in human spermatozoa as determined by fluorescent in-situ hybridization. Hum. Reprod. 11, 722-726 (1996).
