Summary
यह वीडियो आलेख वर्णन करता है, कदम से कदम, कैसे एक वीर्य नमूना प्रक्रिया करने के लिए अच्छी गुणवत्ता वाले प्रतिदीप्ति प्राप्त करने
Abstract
Aneuploidies मनुष्यों में सबसे अक्सर गुणसूत्र असामान्यताओं हैं. इन असामान्यताएं के अधिकांश माता पिता में gametogenic प्रक्रिया के दौरान meiotic त्रुटियों से परिणाम. मानव पुरुषों में, इन त्रुटियों को संख्यात्मक गुणसूत्र असामान्यताएं जो संतानों के लिए इन विसंगतियों का संचारण का एक बढ़ा जोखिम का प्रतिनिधित्व करते हैं के साथ शुक्राणु के उत्पादन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
इस कारण से, शुक्राणु नाभिक पर स्वस्थानी संकरण (मछली) में प्रतिदीप्ति की तकनीक एक नैदानिक निदान के संदर्भ में व्यापक रूप से शामिल प्रोटोकॉल बन गया है. इस अभ्यास के रोगियों है कि आनुवंशिक प्रजनन सलाह के लिए तलाश के gametes में संख्यात्मक गुणसूत्र असामान्यताओं की आवृत्तियों के एक अनुमान प्रदान करती है.
तिथि करने के लिए, सबसे अक्सर शुक्राणु मछली विश्लेषण में शामिल गुणसूत्रों गुणसूत्रों एक्स, वाई, 13, 18 और 21 हैं.
यह वीडियो आलेख वर्णन करता है, कदम से कदम, कैसे प्रक्रिया और एक मानव वीर्य नमूना ठीक है, कैसे decondense और शुक्राणु chromatin, कैसे करने के लिए शुक्राणु मछली की तैयारी को प्राप्त करने के लिए आगे बढ़ना denature, और माइक्रोस्कोप पर परिणामों की कल्पना कैसे. सबसे अधिक प्रासंगिक कदम की विशेष टिप्पणी के लिए सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए दिया जाता है.
Protocol
मैं नमूना प्रसंस्करण और सेल निर्धारण
- द्रवीकरण जब तक 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बाँझ कंटेनर में वीर्य का नमूना छोड़ो.
- एक अपकेंद्रित्र ट्यूब नमूना स्थानांतरण और 1000g पर यह 5 मिनट के लिए स्पिन.
- धीरे हटाने और सतह पर तैरनेवाला एक पाश्चर विंदुक का उपयोग त्यागें.
- Hypotonic समाधान जोड़ें (KCl, 0.075M) पूर्व गर्म 37 डिग्री सेल्सियस, ड्रॉप द्वारा ड्रॉप, जबकि एक भंवर पर मिश्रण 10 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा प्राप्त है.
- एक पानी के स्नान में 37 में ट्यूब ° C 30 मिनट के लिए प्लेस.
- 5 मिनट के लिए 1000g पर अपकेंद्रित्र. ध्यान decantation द्वारा गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
- गोली resuspending के बाद जोड़ने के लिए, हौसले है Carnoy लगानेवाला (03:01 मेथनॉल: एसिटिक एसिड) तैयार ड्रॉप द्वारा ड्रॉप, जबकि एक भंवर पर मिश्रण 8 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा प्राप्त है.
- दोहराएँ आवश्यक के रूप में कई बार के रूप में 6 और 7 अंक के लिए एक सफेद गोली प्राप्त करने के लिए.
- हौसले से तैयार मेथनॉल जोड़ें: एसिटिक एसिड (3:1) ड्रॉप द्वारा ड्रॉप करने के लिए सेलुलर अच्छी सेल प्रसार (एक छोटे से गोली के साथ उन मामलों में प्राप्त करने के लिए आवश्यक एकाग्रता के लिए अंतिम मात्रा को समायोजित करने के लिए, कुछ बूँदें काफी नमूने जबकि एक उच्च राशि के साथ किया जाएगा के शुक्राणु बरामद, अंतिम मात्रा 1-2 मिलीलीटर तक पहुँच कर सकते हैं). एक परीक्षण स्लाइड एक ungreased स्लाइड पर resuspended नमूना छोड़ने और यह एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोप के तहत जांच के द्वारा बनाया जा सकता है. इस के लिए सेलुलर प्राप्त फैलाव की जाँच करें और यह सही है, तो यह जरूरी है स्लाइड में आगे, की अनुमति होगी दूँगी.
- एक्सटेंशन, 40 सेमी की एक न्यूनतम ऊंचाई से ड्रॉप unfrosted स्लाइड के केंद्र में दो या तीन सेल निलंबन की बूंदों (-20 डिग्री सेल्सियस पर पहले मेथनॉल में संग्रहीत करने के लिए उन्हें Degrease). प्रोटोकॉल भर में नमूने के स्थान को सक्षम करने के लिए, एक हीरे की पेंसिल का उपयोग कर स्लाइड के विपरीत पक्ष पर शुक्राणु युक्त क्षेत्र विस्तार के निशान.
- -20 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 24 घंटे के लिए स्लाइड्स का स्टोर.
नोट: मेथनॉल के अलावा: एसिटिक एसिड (3:1) ड्रॉप द्वारा ड्रॉप, जबकि मिश्रण शुक्राणु समुच्चय के गठन से बचने के लिए एक बहुत ही महत्वपूर्ण कदम है.
द्वितीय. Decondensation
- स्लाइड -20 पर संग्रहीत ° सी प्रोटोकॉल के साथ जारी रखने के defrosted होना चाहिए (उन्हें कमरे के तापमान पर छोड़ दें).
- 3 मिनट के लिए प्रत्येक 2x खारा सोडियम साइट्रेट समाधान (2xSSC) के साथ दो लगातार coplin जार में स्लाइड प्लेस.
- 2 मिनट के लिए प्रत्येक coplin जार में इथेनॉल washes के एक श्रृंखला के माध्यम से स्लाइड स्थानांतरण. 70% इथेनॉल के साथ शुरू करो, 90% से पालन करें और 100% के साथ खत्म. यह कमरे के तापमान पर छोड़ स्लाइड सूखी.
- 37 में dithiothreitol समाधान में स्लाइड (50mm 1,4-dithiothreitol 5mm% 1 X-100 ट्राइटन, 2-एमिनो-2 - (hydroxymethyl) -1,3 - propanediol) सेते ° सी इनक्यूबेटर में chromatin decondense. यह उत्पाद protamines के डाइसल्फ़ाइड कुंडल कि पुल शुक्राणु नाभिक में डीएनए को तोड़ने के द्वारा कार्य करता है. यह एक बहुत ही महत्वपूर्ण कदम है क्योंकि नाभिक में शुक्राणु डीएनए अत्यधिक जमा है. dithiothreitol समाधान (डीटीटी) में स्लाइड्स की ऊष्मायन समय नमूना है इस उत्पाद के लिए जेट के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए. आमतौर पर, इस समय 8 मिनट के आसपास है, हालांकि इसे 2 से 15 मिनट से भिन्न हो सकते हैं.
- तत्काल, दो प्रत्येक coplin में 3 मिनट के लिए 2xSSC के साथ लगातार coplin जार स्लाइड हस्तांतरण.
- इथेनॉल washes के एक श्रृंखला के माध्यम से 2 मिनट के लिए प्रत्येक coplin जार (70%, 90% और 100% इथेनॉल) में स्लाइड रखने द्वारा जारी रखें. चलो स्लाइड करने के लिए कमरे के तापमान पर बाहर सूखी.
नोट: डीटीटी के लिए अत्यधिक जोखिम में परिणाम प्रक्रिया के अंत में मछली संकेतों फैलाने, जबकि एक बहुत कम जोखिम कुछ संकेतों के अभाव में परिणाम होगा.
III. वर्ण - संकर करना
- 73 (70% Formamide/2xSSC) पर formamide समाधान ° 5 मिनट के लिए सी के साथ एक coplin जार में स्लाइड incubating द्वारा शुक्राणु डीएनए denature.
- इथेनॉल समाधान के माध्यम से coplin जार 1 प्रति मिनट है (70% इथेनॉल के साथ शुरू, 85% और 100% के साथ खत्म) के लिए स्लाइड स्थानांतरण. स्लाइड छोड़ दो कमरे के तापमान पर बाहर सूखी.
- सीधे 5 के एल जोड़ें इसी तैयार - उपयोग एक 15x15 कवर पर्ची (AneuVysion परख जांच बहु रंग पैनल: सीईपी 18/X/Y या LSI 13/21) के लिए जांच मिश्रण.
- के रूप में यह वीडियो में दिखाया गया है, कवर पर्ची पर ध्यान स्लाइड जगह को एक साथ लक्षित क्षेत्र और जांच मिश्रण डाल. यह रबर सीमेंट के साथ सील.
- एक पूर्व गर्म 37 में स्लाइड प्लेस ° सी संकरण चैम्बर (HYBrite ™) और यह 37 डिग्री सेल्सियस सेते 6-24 घंटे के लिए.
नोट: जबकि शुक्राणु नमूना के विकृतीकरण अनिवार्य है, जांच denaturing की आवश्यकता निर्माता द्वारा निर्धारित किया जाता है. जांच इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया मिश्रण का उपयोग करने के लिए तैयार हैं और इस मामले में है, जांच विकृतीकरण की आवश्यकता नहीं है .
जांच मिश्रण की मात्रा संकरित क्षेत्र के आकार के अनुसार अलग अलग होंगे.
चतुर्थ. Washesपोस्ट - संकरण
- संकरण कक्ष से बाहर स्लाइड ले लो.
- रबर सीमेंट निकालें और ध्यान से बाहर खींच कवर पर्ची पक्ष को धीरे से फिसलने.
- Unspecific संकरण संकेतों को खत्म करने के लिए 2 मिनट के लिए एक coplin जार में 0.4xSSC/0.3% के साथ स्लाइड जगह एनपी-40 पूर्व 73 पर गरम ° सी एक पानी के स्नान में.
- स्लाइड 2xSSC/0.1% 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एनपी 40 धोने के समाधान के लिए स्थानांतरण. चलो स्लाइड करने के लिए कमरे के तापमान पर बाहर सूखी.
- लक्ष्य क्षेत्र (एक 18x18 कवर पर्ची के लिए 8 एल) के लिए एक उत्पाद counterstaining जोड़ें. सबसे आम इस्तेमाल उत्पाद 4 ',6-diamidino-2 - phenylindole (DAPI, Vysis इंक) है.
- के रूप में यह वीडियो में दिखाया गया है, एक कवर पर्ची (संकरण कवर पर्ची नाखून वार्निश के साथ बंद किया जा सकता है है बनाए रखने के) के साथ संकरित क्षेत्र को कवर.
- -20 ° सी में संकरित स्लाइड्स उनके संभावना विश्लेषण जब तक अंधेरे में स्टोर. इन शर्तों के तहत स्लाइड्स प्रतिदीप्ति संकेत तीव्रता में महत्वपूर्ण खो के बिना अप करने के लिए 12 महीनों के लिए भंडारित किया जा सकता है.
नोट: एक उच्च तापमान या एक अत्यधिक धोने के समय कुछ संकेतों के उन्मूलन में परिणाम कर सकते हैं, जबकि विपरीत बाहर unspecific जांच hybridizations नहीं धोना होगा.
counterstaining जोडी उत्पाद की मात्रा संकरण को कवर क्षेत्र के आकार के अनुसार अलग अलग होंगे.
वी. विज़ुअलाइज़ेशन
तैयारी एक epifluorescence / DAPI टेक्सास लाल / FITC और एकल बैंड एक्वा FITC, और टेक्सास रेड के लिए फ़िल्टर के लिए एक ट्रिपल बैंड फिल्टर के साथ सुसज्जित खुर्दबीन के तहत मूल्यांकन किया जा सकता है. शुक्राणु 1 नाभिक के सही मूल्यांकन के लिए मानक मूल्यांकन मानदंडों का पालन किया जाना चाहिए.
गुणसूत्रों एक्स, वाई और 18 के लिए जांच के साथ संकरित तैयारी इन तीन गुणसूत्रों के लिए संकेतों को प्रदर्शित करना चाहिए. हर सामान्य शुक्राणु एक नीले (18 गुणसूत्र करने के लिए इसी), संकेत, और एक हरे रंग का संकेत (शुक्राणु एक्स असर) या एक लाल संकेत (शुक्राणु वाई - असर) दिखाना चाहिए.
13 क्रोमोसोम और 21, 13 गुणसूत्र और गुणसूत्र 21 के लिए एक लाल संकेत के लिए हरी झंडी के लिए जांच के साथ संकरित तैयारी में हर सामान्य शुक्राणु में प्रतिष्ठित किया जाना चाहिए.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे शुक्राणु मछली तैयारी प्राप्त करने के लिए मानव वीर्य के नमूनों की प्रक्रिया है. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना यह संभव है कि पुरुष gametes में गुणसूत्र असामान्यताओं का विश्लेषण. शुक्राणु aneuploidy स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों या तो बुनियादी अनुसंधान के संदर्भ में और प्रजनन बांझ पुरुषों के लिए दी गई सलाह में. हालांकि नैदानिक निदान में सबसे व्यापक रूप से अध्ययन गुणसूत्रों एक्स, वाई, 13, 18 और 21 क्रोमोसोम और loci की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अन्य वाणिज्यिक जांच कर रहे हैं उपलब्ध हैं और इन प्रयोगों में भी इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Acknowledgments
यह काम Generalitat de Catalunya (2005 SGR00437) द्वारा समर्थित किया गया था. लेखकों उनके पर्यवेक्षण और प्रोत्साहन, और अपनी तकनीकी सहायता के लिए जे लुकास के लिए जे Blanco और एफ विडाल करने के लिए धन्यवाद.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Material | Roche Group | 10197777001 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol | Material | Roche Group | 10708976001 | |
| Acetic acid | Material | Merck & Co., Inc. | 100.063 | |
AneuVysion® Multicolor DNA Probe Kit
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Material | Vysis Inc. | 32-161075
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| Centrifuge 5804R | Tool | Eppendorf | ||
| Centrifuge tube | Material | Nalge Nunc international | 347856 | |
| Coplin jar (glass) | Material | Barloworld Scientific | Hellendahl (ZCT278) | |
| Coplin jar (plastic) | Material | Deltalab | 191087 | |
| Cover slips (15x15) | Material | Knittel Glaser | 4600115 | |
| Cover slips (18x18) | Material | Knittel Glaser | 4600118 | |
| Diamond pencil | Material | Hammacher | 335117010 | |
| Ethanol | Material | Merck & Co., Inc. | 100.983 | |
| Formamide | Material | Roche Group | 11814320001 | |
| Freezer | Tool | Zanussi | ||
| Gloves | Material | Sanyo | 101/3300 | |
| HYBrite™ | Tool | Vysis Inc. | ||
| Immersion Oil | Material | Olympus Corporation | 35505 | |
| Incubator | Tool | Heraeus Instruments | ||
| Methanol | Material | Merck & Co., Inc. | 106.009 | |
| Micropipette | Material | Labsystems | Finnpipette (4500000) | |
| Micropipette replacement tip | Material | Daslab | 16-2001 | |
| Nail varnish | Material | Quo-cosmetics | ||
| Olympus BX60 epifluorescence microscope | Tool | Olympus Corporation | Equipped with a triple-band filter for DAPI/Texas Red/FITC and single-band filters for Aqua, FITC and Texas Red. | |
| Pasteur Pipette | Material | Rubilabor | 211.0230 | |
| Phase contrast microscope | Tool | Nikon Instruments | ||
| Plastic pipette (3ml) | Material | Deltalab | 200007 | |
| Potassium chloride (KCl) | Material | Fluka | 60128 | |
| Rubber cement | Material | Best-test | ||
| Slides | Material | Knittel Glaser | 4520022 | |
| Slide Saver Boxes | Material | Deltalab | 19276.1 | |
| Sterile container | Material | Deltalab | 409726 | |
| Syringe | Material | PentaFerte | 002022300 | |
| Thermometer | Material | Comark Instruments, Inc | KM12 | |
| Tri-distilled water | Material | |||
| Triton X-100 | Material | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Tweezers | Material | B. Braun Medical | Aesculap (BD224R) | |
| Vertical laminar flow hood | Tool | Burdinola | OR-ST 1500 | |
| Vortex mixer | Tool | Fisher Scientific | FB15012 | |
| Water bath | Tool | Raypa® |
References
- Blanco, J., Egozcue, J., Vidal, F. Incidence of chromosome 21 disomy in human spermatozoa as determined by fluorescent in-situ hybridization. Hum. Reprod. 11, 722-726 (1996).
