Summary
Deze video-artikel beschrijft stap voor stap, hoe je een sperma monster proces om goede kwaliteit te bereiken fluorescentie
Abstract
Aneuploïdieën zijn de meest voorkomende chromosomale afwijkingen bij de mens. De meeste van deze afwijkingen het gevolg zijn van fouten tijdens de meiose gametogene proces in de ouders. In de menselijke mannetjes, kunnen deze fouten leiden tot de productie van spermatozoa met numerieke chromosoomafwijkingen die een verhoogd risico van overdracht van deze afwijkingen aan het nageslacht te vertegenwoordigen.
Om deze reden heeft de techniek van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) op het sperma kernen wordt een protocol op grote schaal opgenomen in de context van de klinische diagnose. Deze werkwijze geeft een schatting van de frequenties van numerieke chromosoom afwijkingen in de gameten van de patiënten die zoeken naar genetische voortplanting advies.
Tot op heden, de chromosomen het vaakst opgenomen in het sperma FISH analyse zijn chromosomen X, Y, 13, 18 en 21.
Deze video-artikel beschrijft stap voor stap, hoe te verwerken en vast een menselijk sperma, hoe decondense en denatureren het sperma chromatine, hoe over te gaan tot zaadcellen visbereidingen te krijgen, en hoe u de resultaten op de microscoop zichtbaar te maken. Bijzondere opmerkingen van de meest relevante stappen worden gegeven aan de beste resultaten te bereiken.
Protocol
I. Voorbeeld verwerking en cel-fixatie
- Laat het sperma monster in steriele recipiënten bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten totdat het vloeibaar maken.
- Breng het monster op een centrifugebuis en de spin het bij 1000g gedurende 5 minuten.
- Verwijder voorzichtig en gooi het supernatant met behulp van een Pasteur pipet.
- Voeg hypotone oplossing (KCl, 0.075M) voorverwarmde bij 37 ° C, druppel voor druppel, terwijl het mengen op een vortex tot een uiteindelijk volume van 10 ml te verkrijgen.
- Plaats de buis in een waterbad bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
- Centrifugeer bij 1000g gedurende 5 minuten. Verwijder voorzichtig het supernatans door decanteren, zonder de pellet te verstoren.
- Na resuspenderen de pellet, voeg vers bereide fixatief (3:1 methanol: azijnzuur) Carnoy's druppelsgewijs tijdens het mengen op een vortex tot een uiteindelijk volume van 8 ml te verkrijgen.
- Herhaal de punten 6 en 7 zo vaak als nodig is om een witte pellet te verkrijgen.
- Voeg vers bereide methanol: ijsazijn (3:1) druppelsgewijs aan het uiteindelijke volume aan te passen aan de cellulaire concentratie die nodig is voor het verkrijgen van een goede spreiding cel (in die gevallen met een kleine pellets, zal paar druppels volstaan terwijl monsters met een hoog bedrag van sperma hersteld, kan het uiteindelijke volume te bereiken 1-2 ml). Een test glijbaan kan worden gemaakt door het droppen van de geresuspendeerde monster op een niet ingevette glijbaan en de behandeling ervan onder een fase contrast microscoop. Dit zal verhuurd aan de verkregen cellulaire dispersie te controleren en in staat zou stellen te corrigeren, als het nodig is, in de verdere dia's.
- Om de extensies, druppel uit een minimale hoogte van 40 cm twee of drie druppels celsuspensie in het centrum van unfrosted dia's (eerder opgeslagen in methanol bij -20 ° C om ze te ontvetten). Maken Om de locatie van het monster door het protocol, markeren het gebied met het sperma uitbreiding aan de andere kant van de dia met behulp van een diamant potlood.
- Bewaar de dia's bij -20 ° C gedurende ten minste 24 uur.
Opmerking: De toevoeging van methanol: ijsazijn (3:1) druppelsgewijs tijdens het mixen is een zeer belangrijke stap om de vorming van zaadcellen aggregaten te voorkomen.
II. Decondensation
- De dia's worden opgeslagen bij -20 ° C worden ontdooid om verder te gaan met het protocol (laat ze op kamertemperatuur).
- Plaats de dia in twee opeenvolgende Coplin potten met 2x zout-natriumcitraatoplossing (2xSSC) gedurende 3 minuten.
- Overdracht van de glijbaan door een reeks van ethanol wasbeurten gedurende 2 minuten in elke Coplin pot. Begin met 70% ethanol, gevolgd door een 90% en eindig met 100%. Uitdrogen van de glijbaan laat het bij kamertemperatuur.
- Incubeer de dia in dithiothreitol oplossing (1,4-dithiothreitol 5mm, 1% Triton X-100, 2-Amino-2-(hydroxymethyl) -1,3-propaandiol 50mm) bij 37 ° C in de incubator van de chromatine decondense. Dit product werkt door het breken van de disulfide bruggen van de protamines dat spoel het DNA in de kern spermatozoa. Dit is een zeer belangrijke stap, omdat het DNA in het sperma kern is zeer verdicht. De incubatietijd van de dia's in dithiothreitol oplossing (DTT) moeten worden aangepast aan het monster van de reactiviteit van dit product. Normaal gesproken, dit keer is het ongeveer 8 minuten, hoewel het kan variëren van 2 tot 15 minuten.
- Onmiddellijk, overdracht van de dia om twee opeenvolgende Coplin potten met 2xSSC gedurende 3 minuten in elk Coplin.
- Ga verder door het plaatsen van de foto door een reeks van ethanol wasbeurten gedurende 2 minuten in elke Coplin pot (70%, 90% en 100% ethanol). Laat de schuif uit te drogen bij kamertemperatuur.
Let op: Overmatige blootstelling aan DTT zou resulteren in verspreiden FISH signalen aan het einde van de procedure, terwijl een te korte blootstelling zou resulteren in een gebrek aan sommige signalen.
III. Hybridisatie
- Denatureren het sperma DNA door het incuberen van de dia in een Coplin pot met formamide oplossing (70% Formamide/2xSSC) bij 73 ° C gedurende 5 minuten.
- Overdracht van de foto door de ethanol-oplossingen voor 1 minuut per Coplin pot (te beginnen met 70% ethanol, 85% en eindig met 100%). Laat de schuif uit te drogen bij kamertemperatuur.
- Voeg direct 5 l van de overeenkomstige kant-en-klare probe mengsel aan een 15x15 dekglas (AneuVysion Assay multi-color Probe Panel: CEP 18/X/Y of LSI 13/21).
- Zoals is te zien in de video, plaatst u voorzichtig de slide op de cover slip samen te stellen het doelgebied en de probe mengsel. Afdichting met rubber cement.
- Plaats de dia in een voorverwarmde 37 ° C hybridisatie kamer (HYBrite ™) en bij 37 ° C incuberen voor 6-24 uur.
Let op: Overwegende dat de denaturatie van het sperma monster is verplicht, de noodzaak van de denaturering de sondes wordt bepaald door de fabrikant. De sonde mengsels die in dit protocol zijn klaar voor gebruik en, in dit geval, probe denaturatie is niet vereist.
Het volume van de sonde mengsel is afhankelijk van de grootte van het gehybridiseerde gebied.
IV. Wastpost-hybridisatie
- Haal de dia in de hybridisatie kamer.
- Verwijder de rubber cement en trek het dekglas schuiven voorzichtig naar de zijkant.
- Het elimineren van de niet-specifieke hybridisatie signalen plaats de schuif gedurende 2 minuten in een Coplin pot met 0.4xSSC/0.3% NP-40 voorverwarmd bij 73 ° C in een waterbad.
- Overdracht van de dia naar een 2xSSC/0.1% NP-40 wassen oplossing bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut. Laat de schuif uit te drogen bij kamertemperatuur.
- Voeg een tegenkleuring product om de doelstelling regio (8 l voor een 18x18 dekglas). De meest gebruikte product is 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Vysis Inc.)
- Zoals is te zien in de video, dekking van de gehybridiseerd regio met een dekglas (voor de hybridisatie van de dekglas kan worden afgesloten met nagellak te behouden).
- Bewaar gehybridiseerd dia's bij -20 ° C in het donker tot hun prospect analyse. Onder deze omstandigheden de dia's kan worden opgeslagen voor maximaal 12 maanden zonder grote verliezen in fluorescentie-signaal intensiteit.
Opmerking: Een hogere temperatuur of een overmatige wassen tijd kan resulteren in de eliminatie van een aantal signalen, terwijl het omgekeerde niet zou wassen uit niet-specifieke probe hybridisaties.
Het volume van de toegevoegde tegenkleuring product is afhankelijk van de grootte van het hybridisatie gebied te dekken.
V. Visualisatie
De preparaten kunnen geëvalueerd onder een epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een triple-band filter voor DAPI / Texas Red / FITC en single-band filters voor Aqua, FITC en Texas Red. Standaard beoordelingscriteria moet worden gevolgd voor de correcte evaluatie van het sperma kernen 1.
De voorbereiding gehybridiseerd met probes voor chromosomen X, Y en 18 moet worden weergegeven signalen voor deze drie chromosomen. Elke normale spermatozoa moeten laten zien een blauw-signaal (dat overeenkomt met het chromosoom 18), en een groen signaal (X-dragende spermatozoa) of een rood signaal (Y-dragende spermatozoa).
In de voorbereiding gehybridiseerd met probes voor chromosomen 13 en 21, een groen signaal voor chromosoom 13 en een rood signaal voor chromosoom 21 dient te worden onderscheiden in elke normale spermatozoa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft hoe menselijk sperma monsters proces voor het verkrijgen van sperma visbereidingen. Met behulp van dit protocol is het mogelijk om chromosomale afwijkingen te analyseren in mannelijke gameten. Spermatozoa aneuploidie screening heeft toepassingen hetzij in het kader van fundamenteel onderzoek en in de reproductieve advies aan onvruchtbare mannen. Hoewel in de klinische diagnose van de meest bestudeerde chromosomen zijn X, Y, 13, 18 en 21, andere commerciële probes voor een breed scala van chromosomen en loci zijn beschikbaar en kunnen ook worden gebruikt in deze experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437). De auteurs danken aan J. Blanco en F. Vidal voor hun toezicht en aanmoediging, en J. Lucas voor zijn technische bijstand.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Material | Roche Group | 10197777001 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol | Material | Roche Group | 10708976001 | |
| Acetic acid | Material | Merck & Co., Inc. | 100.063 | |
AneuVysion® Multicolor DNA Probe Kit
|
Material | Vysis Inc. | 32-161075
|
|
| Centrifuge 5804R | Tool | Eppendorf | ||
| Centrifuge tube | Material | Nalge Nunc international | 347856 | |
| Coplin jar (glass) | Material | Barloworld Scientific | Hellendahl (ZCT278) | |
| Coplin jar (plastic) | Material | Deltalab | 191087 | |
| Cover slips (15x15) | Material | Knittel Glaser | 4600115 | |
| Cover slips (18x18) | Material | Knittel Glaser | 4600118 | |
| Diamond pencil | Material | Hammacher | 335117010 | |
| Ethanol | Material | Merck & Co., Inc. | 100.983 | |
| Formamide | Material | Roche Group | 11814320001 | |
| Freezer | Tool | Zanussi | ||
| Gloves | Material | Sanyo | 101/3300 | |
| HYBrite™ | Tool | Vysis Inc. | ||
| Immersion Oil | Material | Olympus Corporation | 35505 | |
| Incubator | Tool | Heraeus Instruments | ||
| Methanol | Material | Merck & Co., Inc. | 106.009 | |
| Micropipette | Material | Labsystems | Finnpipette (4500000) | |
| Micropipette replacement tip | Material | Daslab | 16-2001 | |
| Nail varnish | Material | Quo-cosmetics | ||
| Olympus BX60 epifluorescence microscope | Tool | Olympus Corporation | Equipped with a triple-band filter for DAPI/Texas Red/FITC and single-band filters for Aqua, FITC and Texas Red. | |
| Pasteur Pipette | Material | Rubilabor | 211.0230 | |
| Phase contrast microscope | Tool | Nikon Instruments | ||
| Plastic pipette (3ml) | Material | Deltalab | 200007 | |
| Potassium chloride (KCl) | Material | Fluka | 60128 | |
| Rubber cement | Material | Best-test | ||
| Slides | Material | Knittel Glaser | 4520022 | |
| Slide Saver Boxes | Material | Deltalab | 19276.1 | |
| Sterile container | Material | Deltalab | 409726 | |
| Syringe | Material | PentaFerte | 002022300 | |
| Thermometer | Material | Comark Instruments, Inc | KM12 | |
| Tri-distilled water | Material | |||
| Triton X-100 | Material | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Tweezers | Material | B. Braun Medical | Aesculap (BD224R) | |
| Vertical laminar flow hood | Tool | Burdinola | OR-ST 1500 | |
| Vortex mixer | Tool | Fisher Scientific | FB15012 | |
| Water bath | Tool | Raypa® |
References
- Blanco, J., Egozcue, J., Vidal, F. Incidence of chromosome 21 disomy in human spermatozoa as determined by fluorescent in-situ hybridization. Hum. Reprod. 11, 722-726 (1996).
