Summary
Questo video-articolo descrive, passo dopo passo, come elaborare un campione di sperma per raggiungere una buona qualità di fluorescenza
Abstract
Aneuploidie sono le più frequenti anomalie cromosomiche negli esseri umani. La maggior parte di queste anomalie derivare da errori durante il processo meiotico gametogenic nei genitori. Nei maschi umani, questi errori possono portare alla produzione di spermatozoi con anomalie cromosomiche numeriche che rappresentano un aumento del rischio di trasmissione di queste anomalie alla prole.
Per questo motivo, la tecnica di ibridazione in situ fluorescente (FISH) su nuclei degli spermatozoi è diventato un protocollo ampiamente adottato nel contesto della diagnosi clinica. Questa pratica fornisce una stima della frequenza di anomalie cromosomiche numeriche nei gameti dei pazienti che cercano di consulenza genetica riproduttiva.
Ad oggi, i cromosomi più frequentemente inclusi nell'analisi dello sperma FISH sono cromosomi X, Y, 13, 18 e 21.
Questo video-articolo descrive, passo dopo passo, come elaborare e fissare un campione di sperma umano, come decondense e denaturare la cromatina spermatica, come procedere per ottenere preparazioni FISH spermatozoi, e come visualizzare i risultati al microscopio. Note particolari delle operazioni più rilevanti sono dati per ottenere i migliori risultati.
Protocol
I. Trattamento dei campioni e la fissazione delle cellule
- Lasciare il campione di seme in contenitori sterili a temperatura ambiente per 20 minuti fino a liquefazione.
- Trasferire il campione in una provetta da centrifuga e spin è a 1000g per 5 minuti.
- Rimuovere delicatamente e scartare il surnatante con una pipetta Pasteur.
- Aggiungi una soluzione ipotonica (KCl, 0.075M) pre-riscaldato a 37 ° C, goccia a goccia, mescolando in un vortice di ottenere un volume finale di 10 ml.
- Porre il tubo in un bagno d'acqua a 37 ° C per 30 minuti.
- Centrifugare a 1000g per 5 minuti. Eliminare attentamente il supernatante per decantazione, senza disturbare il pellet.
- Dopo risospendere il pellet, aggiungere preparata Carnoy fissativo (3:1 metanolo: acido acetico) goccia a goccia mescolando in un vortice di ottenere un volume finale di 8 ml.
- Ripetere i punti 6 e 7 come numero di volte necessario per ottenere una pallina bianca.
- Aggiungere metanolo appena preparato: acido acetico (3:1) goccia a goccia per regolare il volume finale alla concentrazione cellulare necessarie per ottenere una buona diffusione delle cellule (nei casi con una piccola pallina, poche gocce sono sufficienti, mentre i campioni con una quantità elevata di spermatozoi recuperati, il volume finale può raggiungere 1-2 ml). Una diapositiva di prova può essere fatta facendo cadere il campione risospeso su uno scivolo ungreased ed esaminando al microscopio a contrasto di fase. Questo permetterà di controllare la dispersione cellulari ottenute e che permettono di correggere, se è necessario, in altre diapositive.
- Per rendere le estensioni, caduta da una altezza minima di 40 cm due o tre gocce di sospensione cellulare al centro di diapositive unfrosted (precedentemente memorizzati in metanolo a -20 ° C a sgrassare loro). Per abilitare la posizione del campione in tutto il protocollo, segnare l'area contenente l'estensione sperma sul lato opposto della diapositiva con una matita diamante.
- Conservare i campioni a -20 ° C per almeno 24 ore.
Nota: L'aggiunta del metanolo: acido acetico (3:1) goccia a goccia sotto agitazione è un passo molto importante per evitare la formazione di aggregati sperma.
II. Decondensazione
- I vetrini conservati a -20 ° C deve essere scongelato per proseguire con il protocollo (lasciarli a temperatura ambiente).
- Mettere il vetrino in due vaschette Coplin consecutivi con 2x salina-la soluzione di sodio citrato (2xSSC) per 3 minuti ciascuno.
- Trasferire i vetrini attraverso una serie di lavaggi etanolo per 2 minuti in ogni vaschetta Coplin. Inizia con etanolo al 70%, seguite dal 90% e finire con il 100%. Asciugare il vetrino lasciandola a temperatura ambiente.
- Incubare il vetrino in una soluzione ditiotreitolo (1,4-ditiotreitolo 5mm, 1% Triton X-100, 2-Amino-2-(idrossimetil) -1,3-propandiolo 50mm) a 37 ° C in incubatore a decondense della cromatina. Questo prodotto agisce rompendo i ponti disolfuro della protamine bobina che il DNA nel nucleo degli spermatozoi. Questo è un passo molto importante perché il DNA nel nucleo degli spermatozoi è molto compatta. Il tempo di incubazione delle diapositive in soluzione ditiotreitolo (DTT) deve essere regolata in base alla reattività del campione di questo prodotto. Di solito, questa volta è di circa 8 minuti, anche se può variare da 2 a 15 minuti.
- Immediatamente, il trasferimento lo scivolo a due vasetti consecutivi Coplin con 2xSSC per 3 minuti in ogni Coplin.
- Continuare mettendo la diapositiva con una serie di lavaggi etanolo per 2 minuti in ogni barattolo Coplin (70%, 90% e il 100% di etanolo). Lasciate che il vetrino ad asciugare a temperatura ambiente.
Nota: l'esposizione eccessiva al digitale terrestre porterebbe a disperdere i segnali FISH al termine della procedura, mentre una esposizione troppo breve si tradurrebbe in una mancanza di alcuni segnali.
III. Ibridazione
- Denaturare il DNA dello sperma incubando il vetrino in una vaschetta Coplin con la soluzione formammide (70% Formamide/2xSSC) a 73 ° C per 5 minuti.
- Trasferire il vetrino attraverso soluzioni di etanolo per 1 minuto per Coplin vaso (inizio con il 70% di etanolo, 85% e finire con il 100%). Lasciare il vetrino ad asciugare a temperatura ambiente.
- Aggiungere direttamente 5 l del corrispondente pronti per l'uso miscela sonda di una scivolata copertura 15x15 (Assay AneuVysion multi-colore del pannello della sonda: CEP 18/X/Y o LSI 13/21).
- Come è mostrato nel video, posizionare con attenzione il vetrino sul vetrino di mettere insieme la regione di destinazione e la miscela della sonda. Sigillarlo con mastice.
- Mettere il vetrino in una pre-riscaldato a 37 ° C camera di ibridazione (HYBrite ™) e incubare è a 37 ° C per 6-24 ore.
Nota: considerando che la denaturazione del campione di sperma è obbligatoria, la necessità di denaturazione delle sonde è determinato dal produttore. Le miscele di sonda utilizzata in questo protocollo sono pronti all'uso e, in questo caso, denaturazione della sonda non è necessaria.
Il volume della miscela sonda varierà a seconda delle dimensioni dell'area ibridato.
IV. Lavapost-ibridazione
- Estrarre il vetrino dalla camera di ibridazione.
- Rimuovere il mastice ed estrarre delicatamente la polizza di copertura scorrevole leggermente di lato.
- Per eliminare i segnali di ibridazione aspecifica posto il vetrino per 2 minuti in una vaschetta Coplin con 0.4xSSC/0.3% NP-40 pre-riscaldato a 73 ° C in un bagno d'acqua.
- Trasferire i vetrini in una soluzione 2xSSC/0.1% NP-40 lavare a temperatura ambiente per 1 minuto. Lasciate che il vetrino ad asciugare a temperatura ambiente.
- Aggiungere un prodotto di contrasto alla regione bersaglio (8 litri per una copertura antiscivolo 18x18). Il prodotto più comune utilizzato è 4 ',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, Vysis Inc.).
- Come è mostrato nel video, la regione delle ibridato con un vetrino (per preservare l'ibridazione la polizza di copertura può essere sigillato con smalto).
- Conservare i vetrini ibridato a -20 ° C al buio fino a quando la loro analisi prospettiva. In queste condizioni le diapositive possono essere conservati per un massimo di 12 mesi senza perdita significativa dell'intensità del segnale di fluorescenza.
Nota: Una temperatura più alta o un tempo di lavaggio eccessive può provocare l'eliminazione di alcuni segnali, mentre il contrario non sarebbe lavare ibridazioni sonda aspecifici.
Il volume del prodotto di contrasto aggiunto varierà a seconda delle dimensioni dell'area di ibridazione di coprire.
V. visualizzazione
La preparazione può essere valutato sotto un microscopio a epifluorescenza dotato di una tripla banda filtro per DAPI / Texas Red / FITC e single-band filtri per Aqua, FITC e Texas Red. Criteri di valutazione standard devono essere seguite per la corretta valutazione dei nuclei dello sperma 1.
La preparazione ibridato con sonde per i cromosomi X, Y e 18 dovrebbe mostrare segnali per questi tre cromosomi. Ogni spermatozoi normali devono mostrare un segnale blu (corrispondente al cromosoma 18), e un segnale verde (X-cuscinetto spermatozoi) o di un segnale rosso (Y-cuscinetto spermatozoi).
Nella preparazione ibridato con sonde per i cromosomi 13 e 21, un segnale verde per il cromosoma 13 e un segnale rosso per cromosoma 21 dovrebbero essere distinti in ogni spermatozoi normali.
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Discussion
Questo protocollo descrive come trattare i campioni di sperma umano per ottenere preparazioni FISH spermatozoi. Utilizzando questo protocollo è possibile analizzare le anomalie cromosomiche nei gameti maschili. Spermatozoi di screening aneuploidia ha applicazioni sia nel contesto della ricerca di base e nei consigli riproduttiva dato ai maschi infertili. Anche se nella diagnosi clinica dei cromosomi più studiati sono X, Y, 13, 18 e 21, altre sonde commerciali per una vasta gamma di cromosomi e loci sono disponibili e possono essere utilizzati anche in questi esperimenti.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437). Gli autori ringraziano a J. Blanco e F. Vidal per la loro supervisione e incoraggiamento, e J. Lucas per la sua assistenza tecnica.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Material | Roche Group | 10197777001 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol | Material | Roche Group | 10708976001 | |
| Acetic acid | Material | Merck & Co., Inc. | 100.063 | |
AneuVysion® Multicolor DNA Probe Kit
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Material | Vysis Inc. | 32-161075
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| Centrifuge 5804R | Tool | Eppendorf | ||
| Centrifuge tube | Material | Nalge Nunc international | 347856 | |
| Coplin jar (glass) | Material | Barloworld Scientific | Hellendahl (ZCT278) | |
| Coplin jar (plastic) | Material | Deltalab | 191087 | |
| Cover slips (15x15) | Material | Knittel Glaser | 4600115 | |
| Cover slips (18x18) | Material | Knittel Glaser | 4600118 | |
| Diamond pencil | Material | Hammacher | 335117010 | |
| Ethanol | Material | Merck & Co., Inc. | 100.983 | |
| Formamide | Material | Roche Group | 11814320001 | |
| Freezer | Tool | Zanussi | ||
| Gloves | Material | Sanyo | 101/3300 | |
| HYBrite™ | Tool | Vysis Inc. | ||
| Immersion Oil | Material | Olympus Corporation | 35505 | |
| Incubator | Tool | Heraeus Instruments | ||
| Methanol | Material | Merck & Co., Inc. | 106.009 | |
| Micropipette | Material | Labsystems | Finnpipette (4500000) | |
| Micropipette replacement tip | Material | Daslab | 16-2001 | |
| Nail varnish | Material | Quo-cosmetics | ||
| Olympus BX60 epifluorescence microscope | Tool | Olympus Corporation | Equipped with a triple-band filter for DAPI/Texas Red/FITC and single-band filters for Aqua, FITC and Texas Red. | |
| Pasteur Pipette | Material | Rubilabor | 211.0230 | |
| Phase contrast microscope | Tool | Nikon Instruments | ||
| Plastic pipette (3ml) | Material | Deltalab | 200007 | |
| Potassium chloride (KCl) | Material | Fluka | 60128 | |
| Rubber cement | Material | Best-test | ||
| Slides | Material | Knittel Glaser | 4520022 | |
| Slide Saver Boxes | Material | Deltalab | 19276.1 | |
| Sterile container | Material | Deltalab | 409726 | |
| Syringe | Material | PentaFerte | 002022300 | |
| Thermometer | Material | Comark Instruments, Inc | KM12 | |
| Tri-distilled water | Material | |||
| Triton X-100 | Material | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Tweezers | Material | B. Braun Medical | Aesculap (BD224R) | |
| Vertical laminar flow hood | Tool | Burdinola | OR-ST 1500 | |
| Vortex mixer | Tool | Fisher Scientific | FB15012 | |
| Water bath | Tool | Raypa® |
References
- Blanco, J., Egozcue, J., Vidal, F. Incidence of chromosome 21 disomy in human spermatozoa as determined by fluorescent in-situ hybridization. Hum. Reprod. 11, 722-726 (1996).
