Summary
Descriviamo un metodo rapido ed efficace per la purificazione dei mitocondri dal lievito
Abstract
I mitocondri sono la sede principale della produzione di ATP durante il metabolismo aerobico in eucarioti fotosintetici non-cellule
Protocol
Materiali e metodi
Ceppi di lievito e le condizioni di crescita
Il ceppo selvatico BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) era cresciuto in media ricca YEPD (1 estratto di lievito%, 2% peptone, 2% di glucosio). Le cellule sono state coltivate a 30 ° C con agitazione di rotazione a 200 rpm in beute con un rapporto "fiasco volume / medio volume" di 5:1.
Isolamento del greggio frazione mitocondriale
- Crescere 1 L di wild-type cultura ceppo BY4742 per 48 h.
- Versare la cultura in 500 ml provette Nalgene. Bilanciare il carico e le cellule raccolto per centrifugazione per 5 min a 3000 xg a temperatura ambiente.
- Decantare le cellule surnatante e risospendere pellet in 250 ml di dH2O. Celle a pellet per centrifugazione per 5 min a 3000 xg a temperatura ambiente.
- Decantare le cellule surnatante e risospendere pellet in 250 ml di dH2O. Celle a pellet per centrifugazione per 5 min a 3000 xg a temperatura ambiente.
- Determinare peso fresco di pellet.
- Risospendere le cellule in un tampone di pellet DTT [2 ml di tampone / g (peso fresco) cellule].
- Trasferire la sospensione cellulare a 50 ml, tubi di plastica Falcon.
- Ruotare le provette a 70 rpm in uno shaker per 20 minuti a 30 ° C.
- Celle di raccolta per centrifugazione per 5 min a 3000 xg a temperatura ambiente.
- Risospendere le cellule in un tampone di pellet Zymolyase senza Zymolyase [7 ml di tampone / g (peso fresco) cellule].
- Celle a pellet per centrifugazione per 5 min a 3000 xg a temperatura ambiente.
- Risospendere le cellule in un tampone di pellet Zymolyase senza Zymolyase [7 ml di tampone / g (peso fresco) cellule].
- Trasferimento sospensione cellulare in un pallone di vetro.
- Aggiungere la polvere di Zymolyase-100T [1 mg di Zymolyase-100T / g (peso fresco), le cellule] alla sospensione cellulare.
- Ruotare il pallone con sospensione cellulare a 70 giri in uno shaker per 30 minuti a 30 ° C.
- Sferoplasti trasferimento formata a causa della digestione della parete cellulare con Zymolyase-100T in provette di plastica da 50 ml centrifuga.
- Pellet sferoplasti per centrifugazione per 8 minuti a 2200 xga 4 ° C.
** Tutti i passi successivi devono essere effettuate a 4 ° C o in ghiaccio. Sospensioni di sferoplasti devono essere trattati con delicatezza usando pipette con punte tagliate per evitare di rompere organelli .**
- Risospendere sferoplasti pellet in ghiacciato buffer di omogeneizzazione [6,5 ml di tampone / g (peso fresco) cellule].
- Pellet sferoplasti per centrifugazione per 8 minuti a 2200 xga 4 ° C.
- Risospendere sferoplasti pellet in ghiacciato buffer di omogeneizzazione [6,5 ml di tampone / g (peso fresco) cellule].
- Trasferimento alle cellule di un pre-raffreddata in ghiaccio vetro omogeneizzatore.
- Utilizzando un pestello stretto, omogeneizzare le cellule facendo 15 colpi di pestello.
- Aggiungere 1 volume di ghiaccio, freddo buffer di omogeneizzazione.
- Trasferimento sferoplasti omogeneizzato in provette di plastica da 50 ml centrifuga.
- Pellet di cellule ininterrotta, nuclei e detriti di grandi dimensioni per centrifugazione per 5 min a 1500 xga 4 ° C.
- Centrifugare il surnatante risultante per 5 min a 3000 xga 4 ° C.
- Centrifugare il surnatante risultante per 15 min a 12000 xga 4 ° C.
- Decantare il surnatante e risospendere pellet in ghiacciato buffer di omogeneizzazione [6,5 ml di tampone / g (peso fresco) cellule].
- Centrifugare per 5 min a 3000 xga 4 ° C.
- Centrifugare il surnatante risultante per 15 min a 12000 xga 4 ° C.
- Decantare il surnatante e risospendere pellet in 3 ml di ghiacciata tampone SEM.
** Anche se questa sospensione è arricchita nei mitocondri, organelli contiene anche altri come il reticolo endoplasmatico (microsomi), Golgi, e vacuoli. Per ottenere i mitocondri pura, questa frazione greggio mitocondriale può essere sottoposto a ulteriore frazionamento, come descritto di seguito .**
Purificazione di mitocondri privi di contaminazione da parte di altri organuli
- Mettere 1,5 ml di ghiacciata 60% (w / v) di saccarosio nel tampone EM in un Ultra-Clear provetta da centrifuga Beckman.
- Sovrapposizione del 60% (w / v) con 4 ml di saccarosio del 32%, 1,5 ml del 23%, 1,5 ml di 15% di saccarosio (tutti p / v in tampone EM).
- Mettere 3 ml della frazione mitocondriale greggio in SEM tampone sulla parte superiore del 15% (w / v) di saccarosio.
- Centrifuga in un SW41 Beckman Ti oscillante-rotore per 1 ora a 134000 xg (33.000 rpm) a 4 ° C.
- La forma mitocondri intatti una fascia marrone al 60% / interfaccia di saccarosio 32%.
- Rimuovere con attenzione saccarosio fino a raggiungere la band mitocondriale.
- Rimuovere la banda mitocondriale usando una pipetta con la punta tagliata e metterla in una provetta da centrifuga di un rotore Beckman-5 MLS.
- Riempire il tubo con tampone SEM.
- Pellet i mitocondri puro per centrifugazione in un MLS-5 rotore per 30 minuti a 10000 xg (31000 rpm) per 30 minuti a 4 ° C.
- Decantare il surnatante utilizzandouna pipetta.
- Utilizzare i mitocondri pura per l'analisi delle funzioni mitocondriali, proteoma mitocondriale e lipidome, e del DNA mitocondriale.
Reagenti
- DTT buffer [100 mM Tris/H2SO4 (pH 9,4), 10 mM ditiotreitolo] (per 15 ml)
- 1,5 ml di buffer di 1 M Tris/H2SO4 (pH 9,4)
- 150 ml di 1 M DTT
- Il volume a 15 ml
- Zymolyase tampone [20 mM di potassio fosfato (pH 7,4), sorbitolo 1,2 M] (per 100 ml)
- 2 ml di 1 M tampone fosfato di potassio (pH 7,4)
- 60 ml di 2 M sorbitolo
- Il volume a 100 ml
- Buffer di omogeneizzazione [10 mM Tris / HCl (pH 7,4), 0,6 M sorbitolo, 1 mM EDTA, 0.2% (w / v) di BSA] (per 250 ml]
- 2,5 ml di 1 M Tris / HCl (pH 7,4)
- 75 ml di 2 M sorbitolo
- 500 microlitri di 500 mM EDTA
- 0,5 g di BSA
- Il volume a 250 ml
- SEM tampone [10 mM MOPS / KOH (pH 7,2), 250 mM saccarosio, 1 mM EDTA] (per 250 ml)
- 2,5 ml di 1 M MOPS / KOH tampone (pH 7,2)
- 31,25 ml di 2 M saccarosio
- 500 microlitri di 500 mM EDTA
- Il volume a 250 ml
- EM tampone [10 mM MOPS / KOH (pH 7,2), 1 mM EDTA] (per 250 ml)
- 2,5 ml di 1 M MOPS / KOH tampone (pH 7,2)
- 500 microlitri di 500 mM EDTA
- Il volume a 250 ml
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Discussion
Questo metodo consente ad alto rendimento puro isolamento dei mitocondri da cellule di lievito. I mitocondri purificati con questo metodo sono essenzialmente priva di contaminazione da parte di altri organuli e mantengono la loro integrità strutturale e funzionale dopo la loro purificazione. I rendimenti metodo descritto mitocondri che sono adatti per cell-free ricostituzione di processi essenziali mitocondriale. Questi mitocondri elevata purezza può essere utilizzato anche per l'analisi della struttura e delle funzioni mitocondriali, proteoma mitocondriale e lipidome, e del DNA mitocondriale.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal CIHR e la NSERC del Canada. VIT è un investigatore CIHR New Research Chair e Concordia University di Genomica, Biologia Cellulare e invecchiamento.
References
- Voet, D., Voet, J. G. Biochemistry. , 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2004).
- Suen, D. -F., Norris, K. L., Youle, R. J. Mitochondrial dynamics and apoptosis. Genes Dev. 22, 1577-1590 (2008).
- Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F. &, Hardwick, J. M. Mitochondrial factors with dual roles in death and survival. Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).
- Detmer, S. A., Chan, D. C. Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 870-879 (2007).
- McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: more than just a powerhouse. Curr. Biol. 16, R551-R560 (2006).
- Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T. Mitochondria, oxidants, and aging. Cell. 120, 483-495 (2005).
