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Biology

के फ्लोरोसेंट लेबलिंग ड्रोसोफिला हार्ट संरचनाएं

doi: 10.3791/1423 Published: October 13, 2009

Summary

यहाँ हम लार्वा और वयस्क से दिल ट्यूबों के विभिन्न तत्वों के फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए एक बुनियादी प्रोटोकॉल का वर्णन

Abstract

Protocol

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इससे पहले कि आप शुरू

  1. निम्न समाधानों को तैयार:
    1. आराम बफर (कृत्रिम ड्रोसोफिला (ADH) hemolymph (देखें "ड्रोसोफिला में दिल की धड़कन" Visualizing) है कि 10 मिमी EGTA होता)
    2. लगानेवाला (1x पीबीएस में 4% formaldehyde)
    3. PBSTx (पीबीएस 0.1 ट्राइटन-X-100% युक्त)
    4. उचित पतला प्राथमिक और प्रजातियों विशिष्ट PBSTx में fluorescently लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी
  2. काटना ड्रोसोफिला के बाद हृदय ट्यूब (वयस्क मक्खियों और / या लार्वा के) बेनकाब
    1. "ड्रोसोफिला में दिल की धड़कन Visualizing" में अर्द्ध बरकरार ड्रोसोफिला दिल तैयारी प्रोटोकॉल, या
    2. निम्नलिखित संशोधनों के साथ ड्रोसोफिला लारवल NMJ विच्छेदन एक प्रोटोकॉल: का प्रयोग करें लार्वा विच्छेदन के दौरान ADH oxygenated और उदर midline से थोड़ा पीछे पिन विस्थापित . लार्वा उदर midline के साथ काट रहे हैं. किसी भी ऊतक को हटाने के निर्धारण के लिए पहले मत करो.

प्रतिदीप्त धुंधला

  1. जाँच करें कि सभी दिल rhythmically oxygenated ADH में मार रहे हैं. बफर आराम के साथ जल्दी ADH जगह. प्रत्येक हृदय ट्यूब जांच करने के लिए सुनिश्चित करें संकुचन हिचकते हैं.
  2. लगानेवाला के साथ आराम बफर की जगह से दिल को ठीक करें. कोमल झटकों के साथ 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. (लार्वा तैयारी मिलाते लिए किसी भी कदम पर आवश्यक नहीं है और हृदय ऊतक की अखंडता के लिए हानिकारक माना जा सकता है है).
  3. नमूनों PBSTx के साथ दस मिनट के लिए लगातार झटकों के साथ कमरे के तापमान पर तीन बार धोएं.
  4. वयस्कों के लिए, ध्यान से वापस पेट ऐसी है कि रहता है क्या और अधिक अंडाकार और कम गोल है छल्ली के उदर किनारों ट्रिम. इसके अतिरिक्त, पेट और छाती के बीच एक एकल कटौती, ध्यान से और सफाई से अलग दोनों के शरीर क्षेत्रों और के साथ दिल के पूर्वकाल क्षेत्र के लिए न्यूनतम क्षति को सुनिश्चित करते हैं. लार्वा दिल के लिए, ध्यान से वसा शरीर का उपयोग कर ठीक संदंश हटा दें. चर्बी हटाने अत्यधिक सावधानी के साथ निष्पादित किया जाना चाहिए, लार्वा दिल के बाद से विशेष रूप से नाजुक है और अन्य मांसपेशियों या संयोजी ऊतक से बहुत कम समर्थन किया है. Tracheal शाखाओं को हटाने के रूप में इस दिल को नुकसान हो सकता है मत करो.
  5. किनारों से पेट छल्ली की छंटनी पृष्ठीय क्षेत्र स्थानांतरण, केन्द्र स्थित हृदय ट्यूब के साथ एक 96 कुओं कि प्राथमिक PBSTx में पतला एंटीबॉडी के 50-100 μl होते हैं के साथ अच्छी तरह से थाली में संपर्क से बचने. अच्छी तरह से प्रति कोई 12 से अधिक नमूनों का रखें. नित्य आंदोलन के साथ 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. ऊष्मायन 4 में भी रात भर सकता है किया जा डिग्री सेल्सियस
  6. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें. दिल नित्य झटकों के साथ 100 कमरे के तापमान पर μl PBSTx के साथ दस मिनट के लिए तीन बार धोएं.
  7. अंतिम धोने बफर के हटाने के बाद, PBSTx में 100 माध्यमिक एंटीबॉडी के μl, Alexa594 phalloidin (1:1000) के साथ पूरक जोड़ें. कमरे के तापमान पर लगातार झटकों के साथ एक घंटे के लिए सेते हैं. Fluorophore रोकने के विरंजन कवर नमूनों रखें.
  8. माध्यमिक ऊष्मायन के बाद, दिल PBSTx के 100 μl के साथ दस मिनट के लिए तीन बार लगातार झटकों के साथ धो कमरे के तापमान पर. धोने कदम भर कवर नमूने रखें.
  9. Triton एक्स-100 को हटाने के लिए, दिल पीबीएस के 100 μl में 10 मिनट के लिए एक अंतिम समय कुल्ला. नमूनों 4 ° C पर अंधेरे में संग्रहीत किया जा सकता है है कई दिनों के लिए बढ़ते से पहले.

वयस्क दिल के लिए बढ़ते

  1. Vectashield बढ़ते मध्यम के 10 μl के साथ एक खुर्दबीन स्लाइड के लिए दो 18 x 18 मिमी को कवर फिसल जाता है का पालन करें. coverslips ~ 10-15 मिमी अलग स्थान होना चाहिए. दो coverslips के बीच बढ़ते मध्यम के एक छोटे से तीसरे ड्रॉप प्लेस.
  2. Vectashield की एक तिहाई coverslip के केंद्र में 20 μl रखें.
  3. ध्यान से छल्ली के चरम किनारों से पीबीएस धोने समाधान से दिल की प्रत्येक, हटाने और धीरे से उन्हें दिल साइड जगह तीसरे coverslip पर बढ़ते मध्यम के ड्रॉप पर नीचे. Coverslip पर ड्रॉप प्रति कोई पांच से ज्यादा दिल प्लेस.
  4. एक खुर्दबीन के नीचे की जाँच करें सुनिश्चित करने के सभी दिलों नीचे का सामना कर रहे हैं.
  5. ध्यान दिल युक्त coverslip पलटना और जल्दी से इसे स्लाइड पर जगह ऐसी है कि coverslip जोड़ी के बीच Vectashield छोटी बूंद के साथ हृदय ट्यूबों फ़्यूज़ के साथ छोटी बूंद coverslips की जोड़ी से युक्त एक "पुल" coverslips द्वारा गठित किया जाना चाहिए. दिलों के बीच एक coverslip और खुर्दबीन स्लाइड निलंबित कर दिया जाएगा.
  6. एक खुर्दबीन के नीचे की जाँच करने के लिए सुनिश्चित करें कि दिल अब ऊपर की ओर का सामना कर रहे हैं.
  7. नेल पॉलिश के साथ अपने किनारों पर coverslips तय करो.
  8. दिल अब फ्लोरोसेंट या confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged किया जा करने के लिए तैयार हैं.

  1. (~ 20 μl) एक खुर्दबीन स्लाइड पर ड्रॉप Vectashield रखें.
  2. ध्यान से Vectashield और पूरबी उन्हें पृष्ठीय पक्ष में दो नमूनों के नीचे लार्वा टंगस्टन सुइयों का उपयोग करने के लिए स्थानांतरण.
  3. व्यक्तिगत नमूनों बढ़ते माध्यम से बाहर खींच और समानांतर में प्रत्येक संरेखित.
  4. नमूना के पक्ष का विरोध करने पर एक coverslip रखें. संदंश का प्रयोग, शीर्ष पर एक तीसरे coverslip जगह है, पहले पीछे coverslip पर एक तरफ बिछाने और यह कम पूर्वकाल इस प्रकार एक पुल बनाने coverslip के लिए नीचे के द्वारा. केशिका बलों पूर्वकाल जो लार्वा दिल की उचित संरेखण में मदद करता है के लिए पीछे से Vectashield के प्रवाह का कारण होगा.
  5. ठीक जगह में सभी coverslips, उनके किनारों पर, नेल पॉलिश के साथ और ध्यान के साथ 20-30 μl Vectashield coverslips के बीच स्थान को भरने.
  6. नेल पॉलिश और दुकान के साथ 4 पर सील डिग्री सेल्सियस, या -20 डिग्री सेल्सियस पर दीर्घकालिक भंडारण के लिए

प्रतिनिधि परिणाम

जब सही ढंग से क्रियान्वित, सभी उपकरणों और पृष्ठीय पोत से जुड़े ऊतकों बरकरार रहेगा और आसानी से देखे जा चाहिए. पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति कम से कम किया जाना चाहिए. वयस्कों, उदर अनुदैर्ध्य मांसपेशी परत दाग बहुत अच्छी तरह से और पर्याप्त संकेत (1 चित्रा और चित्रा 2) का उत्पादन. अंतर्निहित परिपत्र cardiomyocytes तथापि, तीव्र overlying वेंट्रल परत के रूप में एक संकेत के रूप में उत्पादन नहीं करते हैं. वयस्क दिल के पूर्वकाल "शंक्वाकार कक्ष" के myocytes सिकुड़ा सामग्री का एक पर्याप्त राशि शामिल है और, फलस्वरूप, इस क्षेत्र में सबसे मजबूत हृदय ट्यूब के शेष के सापेक्ष के रूप में प्रकट होता है. लार्वा दिल चढ़ती myofibrillar वयस्क सिकुड़ा cardiomyocytes (चित्रा 3) के समान व्यवस्था से पता चलता है.

चित्रा 1a
चित्रा 1b
चित्रा 1: शीर्ष. एक फ्लोरोसेंट माइक्रोग्राफ एक वयस्क ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के पूरे हृदय ट्यूब है कि मायोसिन GFP व्यक्त दिखा . छवि Zeiss Imager Z1 फ्लोरोसेंट एक Apotome स्लाइडिंग मॉड्यूल के साथ सुसज्जित खुर्दबीन के साथ लिया गया था. मायोसिन-GFP हरे रंग में दिखाया गया है, actin AlexaFluor ® 594 (लाल) phalloidin और α-actinin साथ दाग है विरोधी α-actinin प्रतिरक्षी (नीला) के साथ लेबल है. नोट: प्रारंभिक प्रक्रिया अच्छी तरह से संरक्षित संरचनाओं के साथ दिल के नमूनों की वसूली परमिट है. AM = alary मांसपेशियों, सीसी = शंक्वाकार कक्ष वी = आंतरिक वाल्व; VLL = वेंट्रल अनुदैर्ध्य मांसपेशी परत. नीचे. वेंट्रल अनुदैर्ध्य चढ़ती myofibril व्यवस्था सिकुड़ा cardiomyocytes दिखा परत बस के नीचे दिल की 3 पेट खंड के माध्यम से सीसी से वयस्क हृदय ट्यूब के एक क्षेत्र है. कृपया यहाँ क्लिक करें चित्रा 1a का एक बड़ा संस्करण के लिए, और यहाँ आंकड़ा 1b का एक बड़ा संस्करण के लिए

चित्रा 2
चित्रा 2: वयस्क AlexaFluor ® 594 (लाल) phalloidin और (कोलेजन टाइप IV) विरोधी Pericardin (हरा) एंटीबॉडी के साथ दाग दिल के पूर्वकाल भाग के प्रतिनिधि confocal ढेर . Pericardin ventral सतह के साथ दिल के साथ जुड़ा हुआ है, संभावना उदर मांसपेशी परत के longitudinally उन्मुख myofibrils से प्रारंभिक है. कृपया आंकड़ा 2 का एक बड़ा संस्करण के लिए यहाँ क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3: एक मंच तीन ड्रोसोफिला लार्वा के समुचित दिल के खंड A7 के एक फ्लोरोसेंट माइक्रोग्राफ. छवि Zeiss Imager Z1 फ्लोरोसेंट एक Apotome स्लाइडिंग मॉड्यूल के साथ सुसज्जित खुर्दबीन के साथ लिया गया था. Actin AlexaFluor ® 594 (हरा) phalloidin और α-actinin के साथ लेबल है विरोधी α-actinin एंटीबॉडी (लाल) के साथ दाग है. कृपया आंकड़ा 3 का एक बड़ा संस्करण के लिए यहाँ क्लिक करें .

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Discussion

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यहाँ हम एक तैयारी और धुंधला ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर पृष्ठीय पोत और फ्लोरोसेंट या confocal माइक्रोस्कोपी के माध्यम से इमेजिंग के लिए जुड़े ऊतकों के लिए उपयोगी प्रोटोकॉल उपस्थित थे. हम से परिष्कृत और अधिक प्रभावी धुंधला हो जाना है कि लार्वा और वयस्क ड्रोसोफिला दिल ट्यूबों के स्वस्थानी इमेजिंग में अच्छी तरह से हल परमिट के लिए हमारी प्रयोगशाला में कार्यरत कदम की एक संक्षिप्त खाते प्रदान करते हैं. दूसरों संक्षिप्त फार्म 2, 3, 4 में इसी तरह के तरीकों का वर्णन किया है.

महत्वपूर्ण अतिरिक्त विवरण को ध्यान जब धुंधला हो जाना प्रक्रिया को लागू करने की आवश्यकता होती है. उदाहरण के लिए, के रूप में अन्य जैविक सामग्री के साथ पाया, काफी अनुरूप ड्रोसोफिला हृदय की मांसपेशी फाइबर काफी भंगुर निम्नलिखित निर्धारण हो गया है. नोट का विशेष सहायक alary फाइबर हृदय ट्यूब से जुड़ा, जो काफी नाजुक हैं 5 6 7 के कई जोड़े हैं. इस प्रकार, अनावश्यक हेरफेर शारीरिक तनाव और प्रत्यक्ष तय ऊतकों को नुकसान सीमित घट जाती है और यह अच्छी तरह से संरक्षित है और पूरी तरह बरकरार संरचनाओं visualizing की संभावना बढ़ जाती है. इसके अलावा, छल्ली के चरम किनारों पर केवल वयस्क नमूने से निपटने के ऊतक गड़बड़ी के लिए संभावना minimizes.

यह भी ध्यान दें कि इस प्रोटोकॉल के कदम केवल लार्वा और वयस्क ड्रोसोफिला दिलों के सफल immunostaining के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में विचार किया जाना चाहिए करने के लिए आवश्यक है. पद्धति आमतौर पर हमारी प्रयोगशाला में इस्तेमाल अभिकर्मकों के लिए आवश्यक कदम की न्यूनतम संख्या कम है. किसी भी immunohistochemistry प्रोटोकॉल के साथ के रूप में, कुछ एंटीबॉडी विभिन्न स्थितियों (अवरुद्ध, डिटर्जेंट, लंबे समय तक धोने कदम, आदि के चर मात्रा) की आवश्यकता हो सकती है. इसलिए यह प्रोटोकॉल empirically ऐसे एंटीबॉडी के लिए कर सकते हैं अनुकूलित किया जाना संभावित किसी भी ड्रोसोफिला हृदय संरचना का अनूठा धुंधला जरूरतों को पूरा.

यहाँ वर्णित तकनीकों का उपयोग कर दिल अध्ययन विशेष रूप से शक्तिशाली है क्योंकि ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर एक अत्यंत विनयशील मॉडल प्रणाली है कि अच्छी तरह से विकसित की आनुवंशिक उपकरणों की एक विस्तृत विविधता से लाभ. इन उपकरणों अद्वितीय खोजी शक्ति विकास, और हृदय की मांसपेशी और उसके घटकों की संरचना और समारोह का अध्ययन करने की अनुमति. उदाहरण के लिए, दिल में cytoarchitectural प्रोटीन की mutational विश्लेषण ड्रोसोफिला 8, 9 में कार्डियोमायोपैथी मॉडल की एक किस्म की पहचान में मदद मिली है . इन मॉडलों के sarcomeric घटकों के फ्लोरोसेंट लेबलिंग से पता चला है कि मक्खियों में हृदय फैलाव myofibrillar विप्लव और सिकुड़ा सामग्री की एक हानि के साथ है. इसके अतिरिक्त, कई GFP-सम्मिलन लाइनों वर्तमान में उपलब्ध हैं 10. ऊपर प्रोटोकॉल ऐसी लाइनों के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता विस्तृत रूपात्मक स्थानीयकरण और संभावित आणविक GFP टैग प्रोटीन द्वारा बनाई गई बातचीत के बारे में जानकारी इकट्ठा. इसके अलावा, उड़ लाइनों के जीनोम चौड़ा आरएनएआई संग्रह 11 कि दिल के भीतर 12 प्रोटीन घटक के चुनिंदा पछाड़ना की अनुमति मौजूद हैं . हमारी धुंधला प्रोटोकॉल, उपयुक्त माइक्रोस्कोपी द्वारा पीछा किया, हृदय विशेष हित के जीन की पछाड़ना के साथ संयोजन के रूप में, एक प्रोटीन दिल की संरचना और समारोह के लिए अपने योगदान के सावधान विश्लेषण सक्षम. साथ में, इन तकनीकों एक शक्तिशाली स्क्रीनिंग विधि बनाने के लिए कल्पना और समझने से ज्ञात का एक मेजबान की प्रासंगिकता, या पहले से uncharacterized, प्रोटीन उचित हृदय आकृति विज्ञान और शरीर विज्ञान के लिए आवश्यक उपकरणों की मदद.

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Acknowledgments

लेखकों एसआई Bernstein (सैन डिएगो स्टेट यूनिवर्सिटी) महत्वपूर्ण पढ़ने और इस पांडुलिपि की तैयारी के बारे में उपयोगी सुझाव के लिए धन्यवाद. यह काम एसआई Bernstein, SDSU, और आर Bodmer, BIMR NIH अनुदान द्वारा समर्थित था, और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन के पश्चिमी राज्य संबद्ध से जी Vogler और ए Cammarato के लिए एक के बाद डॉक्टरेट फैलोशिप द्वारा.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Ethylene glycol-bis (2-amino-ethylether) -N,N,N’,N’-tetra-acetic acid (EGTA) Reagent Sigma-Aldrich E4378
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure Reagent Polysciences, Inc. 50-00-0
Triton-X-100 Reagent Sigma-Aldrich 9002-93-1
Alexa Fluor® 594 phalloidin Reagent Invitrogen A12381
Vectashield® Mounting Medium for Fluorescence with DAPI Reagent Vector Laboratories H-1200
Tungsten pins Reagent Fine Science Tools 26002-10
Pin holder Reagent Fine Science Tools 26018-17

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References

  1. Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. (2009).
  2. Molina, M. R., Cripps, R. M. Ostia, the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells. Mech Dev. 1, 51-59 (2001).
  3. Dulcis, D., Levine, R. B. Glutamatergic innervation of the heart initiates retrograde contractions in adult Drosophila melanogaster. J Neurosci. 2, 271-280 (2005).
  4. Zeitouni, B. Signalling pathways involved in adult heart formation revealed by gene expression profiling in Drosophila. PLoS Genet. 10, 1907-1921 (2007).
  5. Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological change. J. Morphol. 2, 351-399 (1936).
  6. Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. Wiley. New York. (1950).
  7. Rizki, T. M. The circulatory system and associated cells and tissues. Academic Press. New York. (1978).
  8. Cammarato, A. Myosin transducer mutations differentially affect motor function, myofibril structure, and the performance of skeletal and cardiac muscles. Mol Biol Cell. 2, 553-562 (2008).
  9. Taghli-Lamallem, O. Dystrophin deficiency in Drosophila reduces lifespan and causes a dilated cardiomyopathy phenotype. Aging Cell. 2, 237-249 (2008).
  10. Kelso, R. J. a database documenting a GFP protein-trap insertion screen in Drosophila melanogaster. Nucleic Acids Res. 32, D418-D420 (2004).
  11. Dietzl, G. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 7150, 151-156 (2007).
  12. Mery, A. The Drosophila muscle LIM protein, Mlp84B, is essential for cardiac function. J Exp Biol. 211, 15-23 (2008).
के फ्लोरोसेंट लेबलिंग<em> ड्रोसोफिला</em> हार्ट संरचनाएं
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Alayari, N. N., Vogler, G., Taghli-Lamallem, O., Ocorr, K., Bodmer, R., Cammarato, A. Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures. J. Vis. Exp. (32), e1423, doi:10.3791/1423 (2009).More

Alayari, N. N., Vogler, G., Taghli-Lamallem, O., Ocorr, K., Bodmer, R., Cammarato, A. Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures. J. Vis. Exp. (32), e1423, doi:10.3791/1423 (2009).

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