Summary
هذا البروتوكول يوضح كيفية المحافظة ، غير متمايزة صحية الجذعية الجنينية البشرية (ES) الخلايا.
Abstract
يجب أن تراقب الجذعية الجنينية البشرية (HES) الخلايا ورعايتهم من أجل الحفاظ على صحة والثقافات غير متمايزة. في الحد الأدنى ، لا بد من تغذيتها ثقافات كل يوم عن طريق إجراء تغيير كامل المتوسطة لتجديد المغذيات المفقودة والحفاظ على ثقافات خالية من عوامل التفرقة غير المرغوب فيها. على الرغم من أن كمية صغيرة من التفريق أمر طبيعي ومتوقع في الثقافات الخلايا الجذعية ، ينبغي أن تكون ثقافة تنظيفها بشكل روتيني من قبل إزالة يدويا ، أو "قطف" مناطق متمايزة. تحديد وإزالة الزائدة من تمايز الثقافات الخلية HES وتقنيات أساسية في الحفاظ على صحة السكان من الخلايا.
Protocol
1. الصيانة : رصد الثقافات تحت المجهر
- إزالة واحد من الخلايا لوحة HES من الحاضنة 37 درجة مئوية ، وتقديمهم إلى المجهر.
- مراقبة المستعمرات في انخفاض القوة ، وذلك باستخدام 2X أو التكبير 5X ، لتقييم نوعية الثقافة عموما. لاحظ ما يلي : عادي اللون المتوسط ، وغياب أي تلوث مرئية ، عموما حجم مستعمرة ، والجودة والكثافة ، وأية ملاحظات أخرى.
- ملاحظة يتغير لون المتوسطة. بسبب التغير في درجة الحموضة واستنفاد المواد المغذية في المتوسط بعد الحضانة بين عشية وضحاها مع الخلايا HES ، سوف تغير من المتوسط الى اللون الاحمر الى اللون "القش". إذا كان المتوسط تبدو الأرجواني ، حدث تحول الرقم الهيدروجيني الأساسية. إذا كان المتوسط تبدو صفراء للغاية ، ويحمض المتوسط. قد المتوسطة الصفراء جدا أن تكون نتيجة المستعمرات مكتظة للغاية في البئر أو التلوث. وينبغي أن تظهر واضحة على المديين المتوسط في جميع الأوقات. على الرغم من مستوى معين من حطام خلية في المتوسط أمر طبيعي ، وينبغي لها أن تظهر أبدا غائما. إذا لوحظ على مستوى عال من حطام خلية ، الثقافة ليست صحية ، ويمكن أن تكون ملوثة.
- إذا كانت الثقافات لا تتطلب الصيانة أو الركض ، يمكن أن تؤخذ على مجلس الوزراء السلامة البيولوجية لتغذية (انظر القسم 2).
- إذا كانت الثقافات تحتوي على أكثر من 10 ٪ تقريبا التفريق المستعمرات ، ينبغي أن الخلايا "تنظيف" من خلال إزالة يدويا مناطق متمايزة (انظر القسم 3).
- إذا كانت تحتوي على ثقافات المستعمرات الكبيرة أو الكثيفة ، أو الطبقة المغذية MEF أكثر من 12 يوما من العمر ، ينبغي passaged الخلايا (انظر القسم 4).
2. تغذية خلايا HES
- في خزانة السلامة البيولوجية العقيمة ، وإزالة غطاء الطبق الثقافة ونضح المتوسط المستهلك. لا تسمح للطرف ماصة للمس أي جزء من لوحة أخرى غير مباشرة داخل الآبار. إذا كان هناك أي قلق من التلوث ، وتغير إلى ماصة جديدة معقمة.
- باستخدام الماصة زجاجية معقمة ، إضافة كمية مناسبة من حرارة HES الخلية مستنبت لكل بئر. للثقافات في صفيحة 6 - جيدا ، إضافة 2.5 مل في المتوسط أيضا.
- عودة إلى لوحة الحاضنة لتبقى عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2.
3. إزالة التمايز من الثقافات الخلية HES
- تحويل 9 بوصة زجاج باستور ماصات في اختيار الأدوات التي صب على نصائح حول اللهب الحارق للرقابة من الكحول. تأكد من أن يتم إغلاق غيض من ماصة لمنع التلوث وتقريبه لتجنب خدش بلاستيكية الطبق الثقافة. تعقيم الأدوات قبل استخدامها التقاط باستخدام مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية أو التقاط ضميمة.
- إزالة مناطق متمايزة. التمايز يحدث في كثير من الأحيان جزء فقط من مستعمرة HES الخلية ، وعادة على طول الحواف أو على شكل بقع معزولة في الوسط. إلا إذا كان جزء من مستعمرة هو التفريق ، فقط في منطقة متباينة يحتاج إلى إزالتها. ويمكن التمييز في كثير من الأحيان رفع قبالة لوحة في ورقة "لزجة" ، وأنه من المفيد لأول فصل خلايا متمايزة عن بقية مستعمرة عن طريق رسم خط من خلال مستعمرة مع نهاية أداة التقاط.
- مرة واحدة يتم فصل أجزاء من مستعمرة ، تنزلق برفق أداة التقاط على طول لوحة لفصل الخلايا غير المرغوب فيها. الحرص على عدم كشط بعيدا الكثير من الطبقة المغذية MEF بين المستعمرات في هذه العملية.
- عندما تتم إزالة كافة الخلايا متمايزة عن لوحة (وعائمة في المتوسط) ، العودة الى مجلس الوزراء ثقافة السلامة البيولوجية. نضح المتوسط تحتوي على خلايا متمايزة واستبدال الطازجة HES خلية متوسطة الثقافة.
4. الركض خلايا HES
انزيم الحضانة
- في خزانة السلامة البيولوجية العقيمة ، وإزالة غطاء الطبق الثقافة 6 - جيدا ونضح المتوسط أمضى من الآبار لتكون passaged. لا تسمح للطرف ماصة للمس أي جزء من لوحة أخرى غير مباشرة داخل الآبار.
- باستخدام الماصة زجاجية معقمة ، إضافة 1 مل من الرابع إلى كل كولاجيناز تحسنت بشكل جيد لتكون passaged.
- عودة إلى لوحة الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
القشط وتجمع خلايا HES
- بعد حضانة الخلايا مع كولاجيناز ، ومراقبة المستعمرات تحت المجهر. ينبغي للانزيم يسبب تغيير خفية ولكن يمكن ملاحظتها في حواف المستعمرة.
- في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية ، ونضح بلطف الانزيم من كل بئر واستبدالها مع متوسط 2.0 مل HES ثقافة الخلية.
- تلميح لوحة ثقافة قليلا نحوك ويستغرق المتوسط 2.0 مل في البئر الأولى مع الزجاج الماصة 5 مل. عقد عمودي الماصة على الجزء السفلي من لوحة ، وتنزلق برفق طرف الماصة عبر بشكل جيد في حين الإفراج عن ببطء المتوسط.
- كرر القشط وpipettiأوقات الحركة نانوغرام 3-4 حتى كل من المستعمرات قد أزيلت من البئر. الماصة بلطف لتجنب تفكك المستعمرات في صغير جدا من القطع. عندما تم إزالة الخلايا من البئر الأولى ، وترك محتويات في البئر وتبدأ الخلايا كشط قبالة القرن المقبل أيضا.
- عندما تم كشط كل من الآبار لتكون passaged وحمام سباحة والمتوسطة التي تحتوي على قطع من كل مستعمرة جيدا في أنبوب معقم 15 مليلتر المخروطية.
- شطف الآبار كشط بإضافة 1 مل من خلية HES مستنبت لكل بئر. جمع هذا شطف ونقل في أنبوب مخروطي الشكل.
- الخلايا الماصة برفق في أنبوب لتفريق قطع مستعمرة تصل إلى الحجم المطلوب.
- الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في غرام × 200
طلاء للخلايا الخلية HES
- في حين أن خلايا HES في جهاز الطرد المركزي ، وإعداد وحدة التغذية الجديدة MEF 6 - جيدا لوحة. التسمية مع لوحة المعلومات المناسبة الخلية HES : خط خلية جديدة مرور عدد وتاريخ إقراره. نضح المتوسط MEF من الآبار وإضافة 1.0 مل PBS إلى كل بئر. دوامة بلطف عازلة حول الآبار ونضح غسل برنامج تلفزيوني. إضافة 1.5 مل الخلية HES مستنبت لكل بئر ووضع لوحة جانبا.
- عندما يتم الانتهاء من الخلايا HES الطرد المركزي ، ليصبح أنبوب يعود الى مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. نضح لطاف ، والحرص على عدم تعكير صفو فضفاضة معبأة الخلية بيليه.
- Resuspend الخلايا في بيليه مع المتوسط بما فيه الكفاية ل1 مل HES المتوسطة الثقافة في الخلية بشكل جيد لتكون مطلية. عندما resuspend تنقسم الى 6 آبار جديدة ، وبيليه في المتوسط 6 مل.
- بلطف وبشكل متساو إضافة 1 مل من التعليق على كل خلية مستعدة بشكل جيد من لوحة التغذية MEF.
- وضع لوحة في الحاضنة 37 درجة مئوية والشريحة بعناية لوحة الأمام إلى الخلف ، وجنبا إلى جنب لتوزيعها بالتساوي على الخلايا في جميع أنحاء البئر.
- السماح للخلايا لنعلق على 37 درجة مئوية خلال الليل.
5. ممثل النتائج :
غير متمايزة خلايا HES صغيرة ، ومعبأة بإحكام ، وعادة ما تتألف من انتشار أكبر وأكثر من الخلايا. ويمكن التفريق يحدث داخل مستعمرة (الشكل 1A) أو بين المستعمرات (الشكل 3B).
ويمكن رؤية morhopologies مختلفة تحت التكبير منخفضة تحت المجهر. ومورفولوجيا الخلايا الجيدة ، كما رأينا في الشكل 2A ، ويحتوي على الصغيرة ، والخلايا معبأة بإحكام التي تنمو في أحادي الطبقة. وينبغي أن يكون الخلايا نظيفة ، حواف محددة ، مع قليل من دون تمييز. الخلايا هو موضح في الشكل 2B مستعدون لالركض ، ومكتظة الخلايا هو موضح في الشكل 2C.
الشكل 1. التمايز في الثقافات HES : (أ) التفريق بين مستعمرة (ب) التفريق بين المستعمرات.
الشكل 2. Morphologies ينظر في الثقافات HES. (أ) جيدة مورفولوجية الخلية (ب) الخلايا HES التي هي على استعداد لالركض (C) زنزانات مكتظة.
Discussion
يجب الحفاظ على عقم في جميع الأوقات عند التعامل مع الخلايا HES. تنظيف وتعقيم مجلس الوزراء السلامة البيولوجية وجميع المعدات قبل استخدامها. يجب أن تتم تصفيته جميع الكواشف باستخدام 0.22 ميكرون تصفية حجم المسام قبل الاستخدام. استخدام antiboiotics في الثقافة خلية HES غير ضروري ويجب تجنبها.
وينبغي أن تكون هناك بيئة منفصلة كمحطة اختيار المعين. يمكن أن العلبة المعقمة لتكون محطة الضميمة ثابت (مثل محطة عمل PCR) مع مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية ، وهو غطاء تدفق الصفحي ، أو خزانة السلامة البيولوجية. وثمة حاجة إلى مجهر تشريح داخل محطة التقاط لمراقبة مستعمرات كما تتم إزالة مناطق متمايزة. يجب أن يتم تعديل لوحة من الزجاج الأمامي للسياج ثابت أو خزانة السلامة البيولوجية للسماح oculars من المجهر لتوسيع من خلال لوحة دون المساس تدفق الهواء المناسب والعقم.
للحفاظ على صحة الخلايا HES الثقافات ، يجب passaged الخلايا في الوقت الأمثل ، وعادة كل 4-7 أيام. في هذا الوقت وصلت إلى أقصى حجمها المستعمرات وربما تبدأ في الدمج. ويمكن دمج المستعمرات زيادة معدل التمايز في الثقافة. تقسيم نسب الانخفاض عموما 1:03 حتي 1:05 ، اعتمادا على عدد من المستعمرات مطلي ، ومعدل التوسع ، وظروف الثقافة. سوف المستعمرات Overplated (نسبة منخفضة جدا تقسيم) دمج المحتمل قبل الأوان ، وتحتاج إلى passaged قبل ان تصل الى حجمها الأقصى.
يجب passaged الثقافات على الطبقة المغذية MEF أن أكثر من 2 أسابيع من العمر إلى MEFs جديدة من شأنها أن تدعم النمو والانتشار غير متمايزة.
منذ التمايز يحدث بشكل طبيعي في الخلية HES الثقافات ، ومن المتوقع أن كمية صغيرة. قد تمايز متكررة أو المفرط يحدث إذا الثقافات لا يتلقون الرعاية المناسبة. يجب تغذية الخلايا كل يوم ، ينبغي تجنب فرط بين الممرات. دائما استخدام الكواشف الطازجة. وينبغي استخدام كل MEFs ووسائل الإعلام والكواشف في غضون 14 يوما لتجنب نمو الخلايا غير المتمايزة HES. لا بد من فحص الكثير من الكواشف الجديدة ، مثل استبدال المصل خروج المغلوب ، وMEFs FBS ، وذلك قبل الاستخدام. تذكر انه سيتم نقل أي خلايا متمايزة لا تتم إزالة قبل الركض على ثقافات جديدة. أيضا ، في محاولة للحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية كلما أمكن ذلك. تقليل الوقت الذي يقضونه خارج الخلايا في الحاضنة (مثل المجهر على المسرح أو في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.) مرحلة ساخنة المجهر يمكن أن تكون مفيدة جدا إذا كانت الخلايا ستكون الحاضنة لفترات طويلة من الزمن.
عند مراقبة الثقافات HES الخلية تحت المجهر ، وتقييم الجودة الشاملة لأول مرة وحجم مستعمرات عرضها باستخدام طاقة منخفضة (2X أو 5X) الهدف. إذا لاحظ خلايا متمايزة المحتمل في الطاقة منخفضة ، وتأكيد مورفولوجيا متباينة باستخدام هدفا أعلى التكبير (10X).
فورا بعد إزالة التمايز ، قد حواف خشنة تظهر المستعمرات أو معطوب. احتضان المستعمرات في المتوسط بين عشية وضحاها جديدة للسماح للخلايا غير متمايزة المتبقية للتعافي. دون التأثير على التمايز في الثقافة ، فإن هذه المستعمرات المتبقية مواصلة تتكاثر بشكل طبيعي.
إذا كان ذلك ممكنا ، بدء التجارب باستخدام الخلايا منخفضة مرور HES. النمط النووي للخلايا قبل وبعد كل التجارب الكبرى.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM | Invitrogen | 11965-092 | For MEF medium |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Certified | Invitrogen | 16000-044 | Heat-inactivated For MEF medium |
| D-MEM/F-12 | Invitrogen | 11330-057 | |
| Knockout™ Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | Pre-screen to ensure support of hES cells |
| bFGF | Stemgent | 03-0002 | Use at [4 ng/mL] final |
| Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 200 mM (100X) Use at [1X] final |
| PBS | Invitrogen | 14190-250 | Without Ca2+ or Mg2+ |
| Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12 |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | Type A, Porcine |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Defined | Hyclone | SH300.70.01 | For freezing medium |
| 6-well plates | Nalge Nunc international | 140675 | For general culture |
| 4-well plates | Nalge Nunc international | 176740 | For thawing |
| 5 mL glass pipets | Fisher Scientific | 13-678-27E | Individually wrapped |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430052 | Polypropylene |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | 9” glass |
References
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. , 5th edition, Wiley-Liss. (2005).
