Summary
Dit protocol laat zien hoe het behoud van gezonde, ongedifferentieerde menselijke embryonale stamcellen (ES) cellen.
Abstract
Menselijke embryonale stamcellen (hES) cellen moeten worden gecontroleerd en verzorgd met het oog op een gezonde, ongedifferentieerde culturen te behouden. Minimaal moet de culturen worden gevoed elke dag door het uitvoeren van een complete medium te veranderen om verloren voedingsstoffen aan te vullen en aan de culturen vrij van ongewenste differentiatie factoren te houden. Hoewel het een kleine hoeveelheid van differentiatie is normaal en verwacht in stamcellen culturen, moet de cultuur regelmatig worden opgeruimd door het handmatig verwijderen, of "plukken" gedifferentieerde gebieden. Het identificeren en verwijderen van overtollige differentiatie van hES celculturen zijn essentiële technieken in het behoud van een gezonde populatie van cellen.
Protocol
1. Onderhoud: Waarnemen culturen onder de microscoop
- Verwijder een plaat van hES cellen uit de 37 ° C incubator en breng aan de microscoop.
- Let op de kolonies bij laag vermogen, met behulp van 2x of 5x vergroting, om de algemene cultuur van kwaliteit te beoordelen. Let op het volgende: normaal medium kleur, de afwezigheid van enige zichtbare verontreiniging, de totale kolonie grootte, kwaliteit en dichtheid, en alle andere waarnemingen.
- Let op medium kleur verandert. Als gevolg van de verandering in pH en de uitputting van voedingsstoffen in het medium na een nacht incubatie met de hES cellen, zal het medium veranderen van een rode tint aan een "stro" kleur. Als het medium verschijnt paars, heeft een basische pH verschuiving is opgetreden. Als het medium verschijnt extreem geel, heeft het medium aangezuurd. Zeer geel medium kan het gevolg zijn van extreem overvolle kolonies in de put of vervuiling worden. Het medium moet duidelijk blijken te allen tijde. Hoewel een zekere mate van celresten in het medium is normaal, zou het nooit verschijnen bewolkt. Als er een hoge mate van celresten wordt waargenomen, de cultuur is niet gezond en kan worden besmet.
- Als de cultuur vereisen geen onderhoud of passage, kunnen ze worden genomen om de biologische veiligheid kabinet worden gevoerd (zie hoofdstuk 2).
- Als de culturen meer dan ongeveer 10% differentiëren kolonies, moeten de cellen worden "opgeruimd" door het handmatig verwijderen van de gedifferentieerde gebieden (zie hoofdstuk 3).
- Als de culturen bevatten grote of dichte kolonies, of de MEF feeder laag is meer dan 12 dagen oud is, moeten de cellen worden gepasseerd (zie hoofdstuk 4).
2. Feeding hES cellen
- In een steriele biologische veiligheid kast, verwijdert u het deksel van de cultuur schotel en zuigen de gebruikte medium. Sta niet toe dat de punt van de pipet om een deel van de plaat anders dan direct in de putten te raken. Als er een zaak van besmetting, ga naar een nieuwe, steriele pipet.
- Met behulp van een steriele glazen pipet, voeg de juiste hoeveelheid warm hES celkweekmedium aan elke well. Voor de culturen in een 6-well plaat, voeg 2,5 ml medium per well.
- Zet de plaat om de couveuse te blijven bij 37 ° C en 5% CO 2.
3. Het verwijderen van Differentiatie van hES Cell Cultures
- Transformeren 9 inch glas pasteurpipetten in picking tools door het vormen van de tips over de gecontroleerde vlam van een alcohol brander. Zorg ervoor dat de punt van de pipet is gesloten houden om verontreiniging te voorkomen en afgerond om te voorkomen krassen op het plastic van de cultuur schotel. Steriliseer de picking tools voor gebruik met behulp van het UV-licht bron in de biologische veiligheid kast of plukken behuizing.
- Verwijder de gedifferentieerde gebieden. Differentiatie komt vaak voor in slechts een gedeelte van een hES cel kolonie, meestal langs de randen of als geïsoleerde plekken in het centrum. Als slechts een gedeelte van een kolonie is differentiëren, alleen de gedifferentieerde gebied moet worden verwijderd. Differentiatie kan vaak tillen de plaat in een "sticky" zijn opgenomen, en is het nuttig om eerst de gedifferentieerde cellen te scheiden van de rest van de kolonie door het tekenen van een lijn door de kolonie met het einde van de picking tool.
- Zodra de stukken van de kolonie zijn gescheiden, zachtjes glijden het plukken gereedschap langs de plaat om de ongewenste cellen los te maken. Zorg ervoor dat u schrapen weg te veel van het MEF feeder laag tussen de kolonies in dit proces.
- Wanneer alle van de gedifferentieerde cellen worden verwijderd uit de plaat (en drijvend in het medium), de terugkeer van de cultuur naar de biologische veiligheid kabinet. Zuig het medium dat de gedifferentieerde cellen en te vervangen door verse hES celkweekmedium.
4. Passage hES cellen
Enzyme Incubation
- In een steriele biologische veiligheid kast, verwijdert u het deksel van de 6-well cultuur schotel en zuigen de gebruikte medium van de putten te worden gepasseerd. Sta niet toe dat de punt van de pipet om een deel van de plaat anders dan direct in de putten te raken.
- Met behulp van een steriele glazen pipet, voeg 1 ml warm collagenase IV aan elk putje te worden gepasseerd.
- Zet de plaat naar de 37 ° C incubator gedurende 5 minuten.
Schrapen en bundeling van de hES cellen
- Na het incuberen van de cellen met collagenase, observeren de kolonies onder de microscoop. Het enzym moet leiden tot een subtiele maar waarneembare verandering in de kolonie randen.
- In de biologische veiligheid kabinet, Zuig voorzichtig het enzym uit elk putje en te vervangen door 2,0 ml hES celkweekmedium.
- Tip van de cultuur plaatje iets naar u toe en nemen de 2,0 ml medium in de eerste goed met een 5 ml glazen pipet. Houd de pipet loodrecht op de bodem van de plaat voorzichtig glijden de pipet tip over het goed, terwijl langzaam loslaten van het medium.
- Herhaal de schrapen en pipetting motion 3-4 keer totdat alle kolonies zijn verwijderd uit de put. Pipet voorzichtig om te voorkomen dat het breken van de koloniën in te kleine stukjes. Wanneer de cellen zijn verwijderd uit de eerste goed, laat de inhoud in de put en beginnen te schrapen de cellen uit van het volgende goed.
- Wanneer alle van de putten worden gepasseerd zijn geschraapt, het zwembad van het medium met de kolonie stukken uit elk putje in een steriele 15 ml conische buis.
- Spoel de geschraapt putten door het toevoegen van 1 ml van HES celkweekmedium aan elke well. Verzamel deze afspoelen en over te dragen aan de conische buis.
- Pipet de cellen voorzichtig in de buis te breken de kolonie stukken tot de gewenste grootte.
- Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 200 x g.
Plating de HES cel Cellen
- Terwijl de hES cellen in de centrifuge, bereidt een nieuwe 6-well MEF feeder plaat. Label de plaat met de juiste hES cell informatie: cellijn, nieuwe passage nummer, en passage datum. Zuig het MEF medium van de putten en voeg 1,0 mL PBS aan elk putje. Zwenk de buffer rond de putten en zuig het PBS wassen. Voeg 1,5 mL hES celkweekmedium aan elk putje en zet de plaat opzij.
- Wanneer de hES cellen klaar centrifugeren, terug te brengen van de buis om de biologische veiligheid kabinet. Zuig het supernatant, zorg dat u de los-packed cell pellet te verstoren.
- Resuspendeer de cellen in de pellet met voldoende medium voor 1 mL hES celkweekmedium per goed te worden verzilverd. Bij splitsing in zes nieuwe putten, resuspendeer de pellet in 6 mL medium.
- Zachtjes en gelijkmatig voeg 1 ml van de celsuspensie aan elk goed voorbereid van de MEF feeder plaat.
- Plaats de plaat in de 37 ° C incubator en zorgvuldig de plaat naar voren naar achteren en opzij schuif naar rechts gelijkmatig te verdelen de cellen gedurende de put.
- Laat de cellen te hechten bij 37 ° C gedurende de nacht.
5. Representatieve resultaten:
Ongedifferentieerde cellen hES zijn kleine, strak verpakt en bestaan meestal uit van grotere, meer verspreid cellen. Differentiatie kan plaatsvinden binnen een kolonie (Figuur 1A) of tussen kolonies (figuur 3B).
Verschillende morhopologies kan worden gezien onder lage vergroting onder de microscoop. Een goede celmorfologie, zoals te zien is in Figuur 2A, bevat kleine, dicht opeengepakte cellen die groeien in een monolaag. Cellen moeten schoon, gedefinieerde randen, met weinig tot geen differentiatie. De cellen in figuur 2B zijn klaar voor passage, en de cellen die in de figuur 2C zijn overvol.
Figuur 1. Differentiatie in hES culturen. (A) differentiatie van een kolonie (B) differentiatie tussen de kolonies.
Figuur 2. Morfologie te zien in hES culturen. (A) goede cel morfologie (B) hES cellen die klaar zijn voor de passage (C) overvolle cellen.
Discussion
Steriliteit moet worden gehandhaafd ten alle tijden bij het werken met hES cellen. Reinigen en steriliseren van de biologische veiligheid kabinet en alle apparatuur voor gebruik. Alle reagentia moeten worden gefilterd met behulp van een 0,22 urn poriegrootte filter voorafgaand aan gebruik. Het gebruik van antiboiotics in hES celcultuur is niet nodig en moeten worden vermeden.
Een aparte omgeving moet worden opgezet als een aangewezen picking station. De steriele behuizing voor het station kan een statische behuizing (zoals een PCR werkstation) met een UV-lichtbron, een laminaire stroming kap, of een biologisch veiligheidskabinet worden. Een dissectiemicroscoop in de picking station is nodig om de koloniën te observeren als de gedifferentieerde gebieden worden verwijderd. De voorkant glazen paneel van een statische behuizing of een biologisch veiligheidskabinet moet worden gewijzigd om de lenzen van de microscoop om door het panel uit te breiden zonder afbreuk te doen aan een goede luchtstroom en steriliteit.
Om gezond te houden hES celculturen, cellen worden gepasseerd bij de optimale tijd, meestal om de 4-7 dagen. Op dit moment is de koloniën hebben bereikt hun maximale grootte en kunnen beginnen te fuseren. Samengevoegde kolonies kan verhogen de snelheid van differentiatie in de cultuur. Split ratio's over het algemeen vallen 1u03-01u05, afhankelijk van het aantal kolonies plated, uitbreiding tarief, en de cultuur omstandigheden. Overplated kolonies (split-ratio te laag) zal waarschijnlijk voortijdig fuseren en moeten worden gepasseerd voordat ze bereiken hun maximale grootte.
Culturen op een MEF feeder laag die is meer dan 2 weken oud moet zijn gepasseerd op nieuwe MEFs dat ongedifferentieerde groei en proliferatie ondersteunen.
Omdat differentiatie van nature voorkomt in hES celculturen, is een klein bedrag verwacht. Frequent of overmatige differentiatie kan optreden als de culturen niet ontvangt passende zorg. De cellen moeten worden gevoed elke dag, moet begroeiing tussen de passages worden vermeden. Gebruik altijd verse reagentia. Alle media, MEF en reagentia moeten worden gebruikt binnen 14 dagen de tijd om ongedifferentieerde hES celgroei te voorkomen. Nieuwe tal van reagentia, zoals Knockout Serum vervanging, FBS en MEFs, moeten voor worden gescreend om te gebruiken. Vergeet niet dat een gedifferentieerde cellen niet verwijderd voor passage zal worden overgedragen aan de nieuwe culturen. Probeer ook om de cellen te houden bij 37 ° C waar mogelijk. Minimaliseren van de tijd dat de cellen buiten te brengen van de incubator (bijv. op de microscoop podium of in de biologische veiligheid kabinet.) Een verwarmd microscoop fase kan zeer voordelig zijn als de cellen van de incubator zijn voor langere tijd.
Bij het observeren van de HES celkweken onder de microscoop, eerst beoordelen van de algehele kwaliteit en de grootte van de kolonies te bekijken met behulp van een laag vermogen (2x of 5x) doelstelling. Als potentieel gedifferentieerde cellen worden waargenomen bij laag vermogen, bevestigen de gedifferentieerde morfologie met een hogere vergroting doelstelling (10X).
Onmiddellijk na het verwijderen van differentiatie, kunnen de randen van de kolonies gekarteld of beschadigd is. Incubeer de koloniën 's nachts in vers medium om de resterende ongedifferentieerde cellen te herstellen. Zonder de invloed van differentiatie in de cultuur, zullen deze resterende kolonies blijven normaal vermenigvuldigen.
Indien mogelijk, te beginnen experimenten met lage passage hES cellen. Karyotype de cellen voor en na alle belangrijke experimenten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM | Invitrogen | 11965-092 | For MEF medium |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Certified | Invitrogen | 16000-044 | Heat-inactivated For MEF medium |
| D-MEM/F-12 | Invitrogen | 11330-057 | |
| Knockout™ Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | Pre-screen to ensure support of hES cells |
| bFGF | Stemgent | 03-0002 | Use at [4 ng/mL] final |
| Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 200 mM (100X) Use at [1X] final |
| PBS | Invitrogen | 14190-250 | Without Ca2+ or Mg2+ |
| Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12 |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | Type A, Porcine |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Defined | Hyclone | SH300.70.01 | For freezing medium |
| 6-well plates | Nalge Nunc international | 140675 | For general culture |
| 4-well plates | Nalge Nunc international | 176740 | For thawing |
| 5 mL glass pipets | Fisher Scientific | 13-678-27E | Individually wrapped |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430052 | Polypropylene |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | 9” glass |
References
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. , 5th edition, Wiley-Liss. (2005).
