Summary
Ce protocole démontre comment maintenir en bonne santé, indifférencié souches embryonnaires humaines (ES) cellules.
Abstract
Souches embryonnaires humaines (hES) les cellules doivent être surveillés et soignés afin de maintenir en bonne santé, cultures indifférenciées. Au minimum, les cultures doivent être nourris chaque jour en effectuant un changement de milieu complet à reconstituer les éléments nutritifs perdus et de maintenir les cultures libres de facteurs de différenciation indésirable. Même si une petite quantité de différenciation est normal et prévu dans les cultures de cellules souches, la culture doit être systématiquement nettoyé en supprimant manuellement, ou «cueillette» des zones différenciées. Identifier et éliminer l'excès de différenciation de cultures de cellules hES sont des techniques essentielles dans le maintien d'une population saine de cellules.
Protocol
1. Entretien: Cultures observant au microscope
- Enlever une plaque de cellules hES de l'incubateur à 37 ° C et porter à la loupe.
- Observez les colonies à faible puissance, en utilisant un grossissement de 2X ou 5X, pour évaluer la qualité globale de la culture. Notez les points suivants: la couleur du milieu normal, absence de toute contamination visible, taille de la colonie d'ensemble, la qualité et la densité, et d'autres observations.
- Observer les changements de couleur moyenne. En raison du changement de pH et de l'épuisement des nutriments dans le milieu après une nuit d'incubation avec les cellules hES, le milieu va changer à partir d'une teinte rouge à un "paille" de couleur. Si le support semble violet, un changement de pH basique est survenue. Si le milieu apparaît extrêmement jaune, le milieu a acidifié. Milieu très jaune peut être le résultat de colonies extrêmement surpeuplées dans le puits ou la contamination. Le milieu doit être limpide en tout temps. Bien qu'un certain niveau de débris cellulaires dans le milieu est normal, il ne doit jamais apparaître nuageux. Si un niveau élevé de débris cellulaires sont observées, la culture n'est pas sain et peut être contaminée.
- Si les cultures ne nécessitent pas d'entretien ou de repiquage, elles peuvent être prises à l'enceinte de sécurité biologique d'être nourri (voir section 2).
- Si les cultures contiennent plus de 10% environ différencier les colonies, les cellules doivent être «nettoyé» en supprimant manuellement les zones différenciées (voir section 3).
- Si les cultures contiennent de grandes colonies ou dense, ou la couche nourricière MEF est de plus de 12 jours, les cellules doivent être repiquées (voir section 4).
2. Nourrir cellules hES
- Dans une enceinte de sécurité biologique stérile, retirez le couvercle de la boîte de culture et d'aspirer le milieu épuisé. Ne laissez pas la pointe de la pipette pour toucher toute partie de la plaque autre que directement à l'intérieur du puits. S'il n'y a aucun souci de la contamination, le changement vers une nouvelle pipette stérile.
- En utilisant une pipette en verre stérile, ajouter la quantité appropriée de milieu de culture hES réchauffé cellules dans chaque puits. Pour les cultures dans une plaque de 6 puits, ajouter 2,5 ml de milieu par puits.
- Retour à la plaque de l'incubateur de rester à 37 ° C et 5% de CO 2.
3. Retrait de différenciation de cultures de cellules hES
- Transformez 9 pouces en verre Pipettes Pasteur en instruments de ramassage par moulage des conseils sur la flamme d'un brûleur contrôlé alcool. Soyez sûr que la pointe de la pipette est scellé pour empêcher la contamination et arrondi pour éviter de rayer le plastique de la boîte de culture. Stériliser les instruments de ramassage avant de l'utiliser en utilisant la source de lumière UV dans l'enceinte de sécurité biologique ou la cueillette enclos.
- Retirez les zones différenciées. Différenciation se produit souvent dans une partie seulement d'une colonie de cellules hES, généralement le long des bords ou comme des points isolés dans le centre. Si seulement une section d'une colonie est différenciant, seule la zone différenciée doit être retiré. Différenciation peut souvent soulever la plaque dans un "collant" feuille, et il est utile de commencer par séparer les cellules différenciées du reste de la colonie en traçant une ligne à travers la colonie avec la fin de l'outil de cueillette.
- Une fois les pièces de la colonie sont séparées, glissent doucement l'outil de cueillette le long de la plaque pour détacher les cellules indésirables. Prenez soin de ne pas gratter trop de la couche nourricière MEF entre les colonies dans ce processus.
- Lorsque toutes les cellules différenciées sont retirés de la plaque (et flottant dans le milieu), retour à la culture à l'enceinte de sécurité biologique. Aspirer le milieu contenant des cellules différenciées et de remplacer à moyen hES culture fraîche de cellules.
4. Le repiquage cellules hES
Incubation enzymatique
- Dans une enceinte de sécurité biologique stérile, retirez le couvercle de la boîte de culture de 6 puits et aspirer le milieu épuisé par les puits pour être repiquées. Ne laissez pas la pointe de la pipette pour toucher toute partie de la plaque autre que directement à l'intérieur du puits.
- En utilisant une pipette en verre stérile, ajouter 1 ml de collagénase IV réchauffé à chaque puits pour être repiquées.
- Retour de la plaque à l'étuve à 37 ° C pendant 5 minutes.
Grattage et mise en commun des cellules hES
- Après incubation des cellules avec de la collagénase, observer les colonies sous le microscope. L'enzyme devrait entraîner un changement subtil mais observables dans les bords colonie.
- Dans le cabinet de sécurité biologique, doucement aspirer l'enzyme de chaque puits et la remplacer par 2,0 mL hES milieu de culture cellulaire.
- Astuce de la plaque de culture légèrement vers vous et prendre la moyenne 2,0 ml dans le premier puits avec une pipette de verre de 5 ml. Tenir la pipette perpendiculairement au fond de la plaque, glissent doucement l'embout de la pipette sur le bien tout en libérant lentement du milieu. Répétez le raclage et le pipetage fois le mouvement jusqu'à ce que toutes 3-4 des colonies ont été retirés du puits. Pipet délicatement pour éviter de casser les colonies dans trop peu de pièces. Lorsque les cellules ont été retirés du premier puits, laisser le contenu dans le puits et commencer à gratter les cellules hors de la suivante aussi.
- Quand tous les puits d'être repiquées ont été grattées, piscine au milieu contenant les morceaux colonie de chaque puits dans un tube de 15 ml stériles conique.
- Rincer les puits gratté en ajoutant 1 mL de milieu de culture cellulaire hES à chaque puits. Recueillir ce rinçage et le transfert au tube conique.
- Pipet les cellules doucement dans le tube pour briser les morceaux colonie jusqu'à la taille désirée.
- Centrifuger les cellules pendant 5 minutes à 200 x g.
Placage des cellules de cellules hES
- Alors que les cellules hES sont dans la centrifugeuse, préparez une nouvelle plaque de 6 puits d'alimentation du MEF. Étiquette de la plaque avec les informations hES cellule appropriée: lignée cellulaire, le numéro de nouveau passage, et la date de passage. Aspirer le MEF moyennes des puits et ajoutez 1,0 ml de PBS dans chaque puits. Remuer doucement le tampon autour des puits et aspirer le lavage PBS. Ajouter 1,5 mL hES milieu de culture cellulaire dans chaque puits et mis la plaque de côté.
- Lorsque les cellules hES sont finis centrifugation, amener le tube de retour à l'enceinte de sécurité biologique. Aspirer le surnageant, en faisant attention de ne pas perturber le lâche-emballés culot cellulaire.
- Resuspendre les cellules dans le culot avec support suffisant pour 1 ml hES milieu de culture cellulaire par puits d'être plaqué. Lorsque se diviser en six nouveaux puits, resuspendre le culot dans 6 mL de milieu.
- Doucement et uniformément ajouter 1 mL de la suspension cellulaire préparée à chaque puits de la plaque d'alimentation du MEF.
- Placer la plaque dans l'incubateur à 37 ° C et glissez soigneusement la plaque d'avant en arrière, et latéralement afin de répartir uniformément les cellules à travers le puits.
- Laisser les cellules d'attacher à 37 ° C pendant la nuit.
5. Les résultats représentatifs:
Cellules hES indifférenciées sont petits, serrés, et se composent généralement de propagation plus grandes, plus les cellules. La différenciation peut se produire dans une colonie (figure 1A) ou entre les colonies (figure 3B).
Morhopologies différents peuvent être vus sous un faible grossissement au microscope. Une bonne morphologie cellulaire, comme on le voit à la figure 2A, contient de petites cellules serrées qui poussent en monocouche. Les cellules doivent avoir propre, bords définis, avec peu ou pas de différenciation. Les cellules montré dans la figure 2B sont prêts pour repiquage, et les cellules montré dans la figure 2C sont surpeuplées.
Figure 1. Différenciation dans les cultures hES. (A) la différenciation d'une colonie (B) la différenciation entre les colonies.
Figure 2. Morphologies vu dans les cultures hES. (A) la morphologie cellulaire bonne (B) des cellules hES qui sont prêts pour repiquage (C) des cellules surpeuplées.
Discussion
Stérilité doit être maintenue en tout temps lorsque vous travaillez avec des cellules hES. Nettoyer et stériliser l'enceinte de sécurité biologique et de tous les équipements avant l'utilisation. Tous les réactifs doivent être filtrés en utilisant un filtre de 0,22 um taille des pores avant l'utilisation. L'utilisation de antiboiotics en culture de cellules hES n'est pas nécessaire et devrait être évitée.
Un environnement distinct devrait être mis en place comme une station de cueillette désigné. L'enceinte stérile pour la station peut être une enceinte statique (comme un poste de travail PCR) avec une source de lumière UV, une hotte à flux laminaire, ou une enceinte de sécurité biologique. Un microscope à dissection à l'intérieur du poste de cueillette est nécessaire pour observer les colonies comme des zones différenciées sont supprimés. Le panneau de verre avant d'une enceinte statique ou une enceinte de sécurité biologique doit être modifié pour permettre les oculaires du microscope à s'étendre à travers le panneau, sans compromettre une bonne ventilation et la stérilité.
Pour entretenir la santé des cultures de cellules hES, les cellules doivent être passées au moment optimal, généralement tous les 4-7 jours. A cette époque les colonies ont atteint leur taille maximale et peut être commencent à fusionner. Fusionné colonies peuvent augmenter le taux de différenciation dans la culture. Ratios de Split tombent généralement 1:03-1:05, selon le nombre de colonies en plaqué, le taux d'expansion, et les conditions de culture. Overplated colonies (rapport de division trop faible) sera probablement fusionner prématurément et ont besoin d'être repiquées avant qu'ils atteignent leur taille maximale.
Cultures sur une couche nourricière MEF qui est plus de 2 semaines doit être passée à nouveau FAE qui soutiendront la croissance et la prolifération indifférenciée.
Depuis une différenciation se produit naturellement dans les cultures de cellules hES, une petite quantité est attendue. Différentiation fréquente ou excessive peut se produire si les cultures ne reçoivent pas les soins appropriés. Les cellules doivent être nourris tous les jours, la prolifération entre les passages doivent être évités. Toujours utiliser des réactifs frais. Tous les médias, les FAE et les réactifs doivent être utilisés dans les 14 jours afin d'éviter la croissance de cellules hES indifférenciées. Les nouveaux lots de réactifs, comme le remplacement Knockout Sérum, FBS et FAE, devraient être examinés avant toute utilisation. N'oubliez pas que toute les cellules différenciées pas enlevé avant repiquage sera transférée aux nouvelles cultures. Aussi, essayez de maintenir les cellules à 37 ° C dès que possible. Minimisez le temps passé à l'extérieur des cellules de l'incubateur (par exemple sur la platine du microscope ou dans l'enceinte de sécurité biologique.) Une platine de microscope chauffée peut être très bénéfique si les cellules seront de l'incubateur pour de longues périodes de temps.
En observant les cultures de cellules hES sous le microscope, d'abord évaluer la qualité globale et la taille des colonies vue en utilisant une faible puissance (2x ou 5x) objectif. Si les cellules potentiellement différenciés sont observés à faible puissance, de confirmer la morphologie différenciée en utilisant un objectif plus fort grossissement (10x).
Immédiatement après avoir enlevé la différenciation, les bords des colonies peuvent apparaître dentelées ou endommagés. Incuber les colonies pendant la nuit dans un milieu frais pour permettre aux cellules indifférenciées qui restent à recouvrer. Sans l'influence de la différenciation dans la culture, ces colonies restantes continueront à proliférer normalement.
Si possible, commencer des expériences utilisant faible passage de cellules hES. Caryotype des cellules avant et après toutes les expériences majeures.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM | Invitrogen | 11965-092 | For MEF medium |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Certified | Invitrogen | 16000-044 | Heat-inactivated For MEF medium |
| D-MEM/F-12 | Invitrogen | 11330-057 | |
| Knockout™ Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | Pre-screen to ensure support of hES cells |
| bFGF | Stemgent | 03-0002 | Use at [4 ng/mL] final |
| Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 200 mM (100X) Use at [1X] final |
| PBS | Invitrogen | 14190-250 | Without Ca2+ or Mg2+ |
| Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12 |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | Type A, Porcine |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Defined | Hyclone | SH300.70.01 | For freezing medium |
| 6-well plates | Nalge Nunc international | 140675 | For general culture |
| 4-well plates | Nalge Nunc international | 176740 | For thawing |
| 5 mL glass pipets | Fisher Scientific | 13-678-27E | Individually wrapped |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430052 | Polypropylene |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | 9” glass |
References
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. , 5th edition, Wiley-Liss. (2005).
