Summary
Dieses Protokoll zeigt, wie man gesunde, undifferenzierte humane embryonale Stammzellen (ES-Zellen) zu halten.
Abstract
Humane embryonale Stammzellen (hES-Zellen) müssen überwacht und gepflegt werden, um gesunde, undifferenzierten Kulturen zu erhalten. Zumindest müssen die Kulturen täglich gefüttert, indem er umfassende Medium ändern, um verlorenen Nährstoffe wieder aufzufüllen und die Kulturen frei von unerwünschten Differenzierungsfaktoren zu halten. Obwohl eine kleine Menge der Differenzierung ist normal und erwartet in Stammzell-Kulturen, sollte die Kultur regelmäßig gereinigt werden, um manuell entfernen oder "picking" differenzierte Bereiche. Erkennen und Entfernen von überschüssigem Differenzierung von hES-Zell-Kulturen sind wesentliche Techniken in der Erhaltung einer gesunden Population von Zellen.
Protocol
1. Wartung: Observing Kulturen unter dem Mikroskop
- Entfernen einer Platte von hES-Zellen aus dem 37 ° C Inkubator und bringen dem Mikroskop.
- Beachten Sie die Kolonien bei niedriger Leistung, mit 2X oder 5fache Vergrößerung, um die gesamte Kultur Qualität zu beurteilen. Beachten Sie die folgenden: normal mittel Farbe, das Fehlen von sichtbaren Verunreinigungen insgesamt Kolonie Größe, Qualität und Dichte, und andere Beobachtungen.
- Beachten Medium Farbe ändert. Durch die Veränderung des pH und die Erschöpfung der Nährstoffe in das Medium nach einer Inkubation über Nacht mit der hES-Zellen wird das Medium von einem roten Farbton zu einem "Stroh" Farbe zu ändern. Wenn das Medium erscheint lila, hat einen basischen pH-Verschiebung stattgefunden. Wenn das Medium erscheint extrem gelb, hat das Medium angesäuert. Sehr gelb Medium kann das Ergebnis der extrem überfüllten Kolonien in den Brunnen oder Verunreinigungen sein. Das Medium erscheinen soll zu jeder Zeit klar. Obwohl ein gewisses Maß an Zelltrümmer in das Medium ist normal, sollte es nie erscheinen trübe. Wenn ein hohes Maß an Zelltrümmer beobachtet wird, ist die Kultur nicht gesund und können kontaminiert sein.
- Wenn die Kulturen nicht gewartet werden müssen oder die Passage, können sie um die biologische Sicherheit Schrank eingespeist (siehe Abschnitt 2) werden entnommen werden.
- Wenn die Kulturen mehr als etwa 10% Differenzierung Kolonien enthalten, sollten die Zellen "aufgeräumt" werden durch manuelles Entfernen der differenzierten Bereiche (siehe Abschnitt 3).
- Wenn die Kulturen groß oder dichten Kolonien enthalten, oder die MEF Feeder-Schicht ist mehr als 12 Tage alt sind, sollten die Zellen passagiert (siehe Abschnitt 4).
2. Feeding hES-Zellen
- In einer sterilen Sicherheitswerkbank, entfernen Sie den Deckel der Kulturschale und saugen die verbrauchte Medium. Nicht in die Spitze der Pipette auf einen Teil der Platte außer direkt in die Vertiefungen berühren. Wenn es irgendeine Sorge der Kontamination, um eine neue, sterile Pipette ändern.
- Mit einem sterilen Glaspipette, fügen Sie die entsprechende Menge erwärmt hES-Zell-Kulturmedium in jede Vertiefung. Für Kulturen in einer 6-Well-Platte, fügen Sie 2,5 ml Medium pro Vertiefung.
- Bringen Sie die Platte in den Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2 bleiben.
3. Entfernen Differenzierung von hES-Zell-Kulturen
- Transform 9-Zoll-Glas Pasteur Pipetten in Kommissionierung Werkzeuge durch Formen der Spitzen über die kontrollierte Flamme eines Spiritusbrenner. Achten Sie darauf, dass die Spitze der Pipette verschlossen ist, um eine Kontamination zu verhindern und abgerundeten um Kratzer zu vermeiden Kunststoff der Kulturschale. Sterilisieren die Kommissionierung Werkzeuge vor dem Einsatz mit den UV-Lichtquelle in der biologischen Sicherheitswerkbank oder Kommissionierung Gehäuse.
- Entfernen Sie die differenzierte Bereiche. Differenzierung tritt oft nur in einem Teil eines hES-Zell-Kolonie, in der Regel an den Rändern oder als isolierte Flecken in der Mitte. Wenn nur ein Abschnitt einer Kolonie ist differenziert, muss nur die differenzierte Bereich entfernt werden. Differenzierung kann oft abheben der Platte in eine "klebrige" Blatt, und es ist hilfreich, zunächst getrennt die differenzierten Zellen aus dem Rest der Kolonie durch Ziehen einer Linie durch die Kolonie mit dem Ende der Kommissionierung-Tool.
- Sobald die Teile der Kolonie getrennt sind, sanft gleiten die Kommissionierung-Tool auf der Platte, um die unerwünschten Zellen zu lösen. Achten Sie darauf, nicht zu kratzen weg zu viel von der MEF Feeder-Schicht zwischen den Kolonien in diesem Prozess.
- Wenn alle differenzierten Zellen von der Platte (und variabel im Medium) entfernt werden, wieder die Kultur die biologische Sicherheitswerkbank. Saugen Sie das Medium mit den differenzierten Zellen und ersetzen mit frischen hES-Zell-Kulturmedium.
4. Passagierung hES-Zellen
Enzyminkubation
- In einer sterilen Sicherheitswerkbank, entfernen Sie den Deckel des 6-well Kulturschale und saugen die verbrauchte Medium aus den Vertiefungen zu passagiert werden. Nicht in die Spitze der Pipette auf einen Teil der Platte außer direkt in die Vertiefungen berühren.
- Mit einem sterilen Glaspipette, 1 mL erwärmt Kollagenase IV für jeden gut zu passagiert werden.
- Bringen Sie die Platte um die 37 ° C Inkubator für 5 Minuten.
Kratzen und Pooling der HES-Zellen
- Nach Inkubation der Zellen mit Kollagenase, beobachten die Kolonien unter dem Mikroskop. Das Enzym sollte zu einem feinen, aber beobachtbare Veränderung in der Kolonie Kanten.
- In der biologischen Sicherheitswerkbank, sanft saugen das Enzym aus jedem Well und ersetzen mit 2,0 mL hES-Zell-Kulturmedium.
- Tipp der Kulturplatte leicht in Ihre Richtung und nehmen die 2,0 ml Medium in die erste Bohrung mit einer 5 ml Glaspipette. Halten Sie die Pipette senkrecht zur Unterseite der Platte, sanft gleiten die Pipettenspitze über die gut, während langsam die Freigabe der Mittel.
- Wiederholen Sie die Schaben und pipetting Bewegung 3-4 mal, bis alle Kolonien aus dem Brunnen entfernt. Pipettieren vorsichtig, um zu vermeiden Aufbrechen der Kolonien in zu kleine Stücke. Wenn die Zellen aus der ersten Bohrung entfernt worden sind, lassen Sie den Inhalt in den Brunnen und beginnen Abschaben der Zellen aus der nächsten gut.
- Wenn alle Brunnen passagiert werden wurden abgekratzt, Pool das Medium mit der Kolonie Stücke aus jeder Vertiefung in ein steriles 15 ml konischen Rohr.
- Spülen Sie den abgeschabt Brunnen durch Zugabe von 1 ml hES-Zell-Kulturmedium in jede Vertiefung. Sammeln Sie diese gründlich und Transfer zum konischen Rohr.
- Pipettieren Sie die Zellen vorsichtig in das Rohr zum Aufbrechen der Kolonie Stück bis die gewünschte Größe.
- Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 Minuten bei 200 x g.
Plating der hES-Zell-Cells
- Während die hES-Zellen in der Zentrifuge sind, bereiten eine neue 6-well MEF Feeder Platte. Beschriften Sie die Platte mit den entsprechenden hES-Zell-Informationen: Zell-Linie, neue Passage-Nummer und Datum Durchgang. Saugen Sie das MEF Medium aus dem Brunnen und 1,0 ml PBS in jede Vertiefung. Vorsichtig schwenken die Puffer um den Brunnen und saugen Sie den PBS waschen. Fügen Sie 1,5 ml hES-Zell-Kulturmedium in jede Vertiefung und stellte den Teller beiseite.
- Wenn der hES-Zellen fertig sind Zentrifugieren, bringen die Röhre zurück, um die biologische Sicherheitswerkbank. Den Überstand aspirieren, darauf achten, daß die lose verpackt Zellpellet stören.
- Resuspendieren der Zellen in das Pellet mit genügend Medium für 1 mL hES-Zell-Kulturmedium pro Vertiefung zu plattiert werden. Bei der Aufteilung in 6 neue Brunnen, das Pellet in 6 ml Medium.
- Sanft und gleichmäßig 1 mL der Zellsuspension auf jeweils gut vorbereitet der MEF Feeder Platte.
- Legen Sie die Platte in die 37 ° C Inkubator und vorsichtig die Platte nach vorne nach hinten und seitlich zur gleichmäßigen Verteilung der Zellen im ganzen gut.
- Lassen Sie die Zellen bei 37 ° C über Nacht befestigen.
5. Repräsentative Ergebnisse:
Undifferenzierte hES-Zellen sind klein, dicht aneinander, und in der Regel von größeren, ausbreiten Zellen bestehen. Differenzierung kann innerhalb einer Kolonie (Abbildung 1A) oder zwischen Kolonien (Abbildung 3B) auftreten.
Verschiedene morhopologies unter geringer Vergrößerung unter dem Mikroskop gesehen werden. Eine gute Zellmorphologie, wie in Abbildung 2A zu sehen, enthält kleine, dicht gepackte Zellen, die in einer Monoschicht wachsen. Zellen sollten sauber, definierte Kanten, mit wenig bis gar keine Differenzierung. Die Zellen in Abbildung 2B dargestellt sind bereit für die Passage, und die Zellen in der Abbildung 2C dargestellt sind überfüllt.
Abbildung 1. Differenzierung in hES Kulturen. (A) Differenzierung von einer Kolonie (B) Unterscheidung zwischen Kolonien.
Abbildung 2. Morphologien in hES Kulturen gesehen. (A) gute Zellmorphologie (B) hES-Zellen, die bereit sind für die Passage (C) überfüllten Zellen sind.
Discussion
Sterilität muss jederzeit gewährleistet sein, wenn die Arbeit mit hES-Zellen. Reinigung und Sterilisation der biologischen Sicherheitswerkbank und alle Geräte vor dem Einsatz. Alle Reagenzien müssen gefiltert durch ein 0,22 um Filter mit einer Porengröße vor dem Gebrauch werden. Die Verwendung von antiboiotics in hES-Zell-Kultur ist nicht notwendig und sollte vermieden werden.
Eine separate Umwelt sollte als Designated Kommissionierplatz eingestellt werden. Die sterile Umhüllung für die Station kann eine statische Gehäuse (z. B. PCR-Workstation) mit einer UV-Lichtquelle, einer Sterilbank oder einer biologischen Sicherheitswerkbank werden. Ein Binokular in der Kommissionierung Station wird benötigt, um die Kolonien zu beobachten, wie die differenzierte Bereiche entfernt werden. Die Frontscheibe eines statischen Gehäuse oder einer biologischen Sicherheitswerkbank muss geändert werden, um für die Okulare des Mikroskops ermöglichen, um durch die Fenster, ohne eine ausreichende Belüftung und Sterilität zu verlängern.
Um gesund zu erhalten hES-Zell-Kulturen, müssen die Zellen zum optimalen Zeitpunkt passagiert werden, in der Regel alle 4-7 Tage. In dieser Zeit der Kolonien haben ihre maximale Größe erreicht und kann beginnen zu verschmelzen. Zusammengeführt Kolonien kann die Geschwindigkeit der Differenzierung in der Kultur zu erhöhen. Split-Verhältnisse in der Regel fallen 1.03 bis 01.05 Uhr, abhängig von der Anzahl der Kolonien plattiert, Expansionsrate und Kulturbedingungen. Overplated Kolonien (Split-Verhältnis zu niedrig) wird wahrscheinlich vorzeitig fusionieren und müssen passagiert werden, bevor sie ihre maximale Größe erreicht.
Kulturen auf einer MEF Feeder-Schicht, die mehr als 2 Wochen alt ist, muss auf neue MEFs dass undifferenzierte Wachstum und die Vermehrung Unterstützung passagiert werden.
Da die Differenzierung von Natur aus in hES-Zell-Kulturen, wird eine kleine Menge erwartet. Häufige oder starke Differenzierung kann auftreten, wenn die Kulturen nicht erhalten eine angemessene Pflege. Die Zellen zugeführt werden muß jeden Tag sein sollte Überwucherung zwischen Passagen vermieden werden. Verwenden Sie stets frischen Reagenzien. Alle Medien, MEFs und Reagenzien sollten innerhalb von 14 Tagen genutzt werden, um undifferenzierte hES-Zell-Wachstum zu vermeiden. New viele Reagenzien, wie Knockout Serum Replacement, FBS und MEFs, sollte vor gescreent werden, um zu verwenden. Denken Sie daran, dass alle differenzierten Zellen nicht vor Passagierung entfernt, um den neuen Kulturen übertragen werden. Versuchen Sie auch, die Zellen bei 37 ° C, wann immer möglich zu halten. Minimieren Sie die Zeit der Zellen verbringen außerhalb des Inkubators (zB am Mikroskop der Bühne oder im biologischen Sicherheitsschrank.) Ein beheizter Mikroskoptisch kann sehr vorteilhaft, wenn die Zellen des Inkubators für längere Zeit sein.
Bei der Betrachtung der hES-Zell-Kulturen unter dem Mikroskop, zunächst zu prüfen, die Qualität und Größe der Kolonien Blick mit einem Low-Power-(2x oder 5x) Ziel. Wenn potentiell differenzierten Zellen bei geringer Leistung beobachtet werden, bestätigen die differenzierte Morphologie mit einer höheren Vergrößerung Objektiv (10-fach).
Sofort nach dem Entfernen Differenzierung, können die Ränder der Kolonien gezackt oder beschädigt. Inkubieren Sie die Kolonien über Nacht in frisches Medium, damit die verbleibenden undifferenzierte Zellen sich zu erholen. Ohne den Einfluss der Differenzierung in der Kultur, werden diese verbleibenden Kolonien weiterhin normal vermehren.
Wenn möglich, beginnen Experimente mit low-Passage hES-Zellen. Karyotyp der Zellen vor und nach alle wichtigen Experimente.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM | Invitrogen | 11965-092 | For MEF medium |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Certified | Invitrogen | 16000-044 | Heat-inactivated For MEF medium |
| D-MEM/F-12 | Invitrogen | 11330-057 | |
| Knockout™ Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | Pre-screen to ensure support of hES cells |
| bFGF | Stemgent | 03-0002 | Use at [4 ng/mL] final |
| Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 200 mM (100X) Use at [1X] final |
| PBS | Invitrogen | 14190-250 | Without Ca2+ or Mg2+ |
| Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12 |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | Type A, Porcine |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Defined | Hyclone | SH300.70.01 | For freezing medium |
| 6-well plates | Nalge Nunc international | 140675 | For general culture |
| 4-well plates | Nalge Nunc international | 176740 | For thawing |
| 5 mL glass pipets | Fisher Scientific | 13-678-27E | Individually wrapped |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430052 | Polypropylene |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | 9” glass |
References
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. , 5th edition, Wiley-Liss. (2005).
