Summary
이 프로토콜은 건강, undifferentiated 인간의 배아 줄기 (ES) 세포를 유지하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
인간의 배아 줄기 (hES) 세포는 건강한, undifferentiated 문화를 유지하기 위해 모니터링 및 치료를해야합니다. 최소한 문화가 손실 영양분을 보충하고 원하지 않는 차별화 요인의 무료 문화를 유지하는 완벽한 매체 변경을 수행하여 매일 공급해야합니다. 차별화의 소량의 정상과 줄기 세포 배양에 예상이지만, 문화는 정기적으로 수동으로 제거하거나, 차별화된 지역 "을 따기"로 청소해야합니다. 식별 및 hES 세포 배양에서 초과 차별을 제거하면 세포의 건강한 인구의 유지에 필수적인 기술입니다.
Protocol
1. 유지 보수 : 현미경으로 관찰 문화
- 37 ° C 배양기에서 hES 세포 중 하나가 접시를 제거하고 현미경을 가져.
- 전체 문화 품질을 평가하기 위해, 2X 또는 5 배 확대를 사용하여 낮은 전력에서 식민지를 관찰합니다. 다음을 참고 : 정상 중간 색상, 모든 눈에 보이는 오염, 전체 식민지의 크기, 품질 및 밀도의 부재, 그리고 다른 관찰합니다.
- 중간 색상 변화를 관찰. 산도의 변화와 hES 세포와 하룻밤 배양 후 배지의 영양분의 고갈로 인해, 매체는 "지푸라기"컬러에 붉은 색조에서 변경됩니다. 매체 보라색 나타나는 경우, 기본적인 산도의 변화가 발생했습니다. 매체 매우 노란색 나타나면, 매체는 산성 있습니다. 매우 노란색 매체는 물론이나 오염에 극도로 초만원 식민지의 결과 수 있습니다. 매체는 항상 명확 나타납니다. 매체 세포 파편의 특정 수준은 정상입니다하지만, 그것은 흐린 나타나지 않을 것입니다. 세포 파편의 높은 수준을 관찰하면, 문화 건강이 아니므로 오염 수 있습니다.
- 문화가 유지 보수 passaging 필요하지 않으면, 그들은 (섹션 2 참조) 먹이에 생물 학적 안전 캐비닛로 이동하실 수 있습니다.
- 문화가 약 10 % 식민지 차별 개 이상 포함하는 경우, 전지가 수동으로 차별화된 영역 (섹션 3 참조) 제거하여 "청소"한다.
- 문화가 크거나 밀도 식민지를 포함하거나, MEF 피더 층 이상 12일 된 경우, 전지 (섹션 4 참조) passaged해야합니다.
2. 수유 hES 셀
- 무균 생물 학적 안전 캐비넷에서 문화 접시의 뚜껑을 제거하고 지출 매체를 대기음. 피펫의 팁을 직접 우물 내부가 아닌 다른 접시의 어떤 부분을 만지는 것을 허용하지 않습니다. 오염의 우려가있다면, 새, 멸균 피펫로 변경합니다.
- 멸균 유리 pipet을 사용하여 각 음에 예열 hES 세포 배양 매체의 적절한 금액을 추가합니다. 6 잘 플레이트의 문화, 잘 당 2.5 ML 매체를 추가합니다.
- 37 ° C와 5% CO 2 상태로 인큐베이터에 접시를 반환합니다.
3. hES 세포 문화의 차별을 제거
- 성형 알코올 버너의 불꽃 제어를 통해 조언에 의해 따기 도구로 9 인치 유리 파스퇴르 pipettes를 변환. 피펫의 팁을가 오염을 방지하기 위해 봉인과 문화 요리의 플라스틱을 긁힘 방지하기 위해 반올림되어 있는지 확인합니다. 사용 생물 학적 안전 캐비넷에서 UV 광원을 사용하거나 인클로저 따기 전에 채집 도구를 소독.
- 차별 영역을 제거합니다. 차별은 종종 일반적으로 가장자리를 따라 또는 중앙에 고립 명소로 hES 세포 콜로니의 단지 부분에 발생합니다. 식민지만이 섹션 차별 경우에만 차별화된 영역은 제거되어야합니다. 차별화는 종종 "끈적끈적한"시트에서 접시를 리프트 수 있으며, 그것은 수확 도구의 마지막으로 식민지를 통해 라인을 그림으로써 식민지의 나머지 부분에서 차별화된 세포를 첫째 분리 도움이됩니다.
- 식민지의 조각이 분리되면 부드럽게 원치 않는 세포를 분리하기 위해 접시 따라 채집 도구를 활강. 이 과정에서 식민지 사이에 너무 많이 MEF의 피더 레이어 멀리 밀고 안됩니다.
- 차별화된 세포의 모든 접시 (그리고 중간에 떠있는)에서 제거됩니다 때, 생물 안전 캐비닛에 문화를 반환합니다. 차별화된 세포를 포함하는 매체를 대기음 신선한 hES 세포 배양 매체로 바꿉니다.
4. Passaging hES 셀
효소 배양
- 무균 생물 학적 안전 캐비넷에서 6 잘 문화 접시의 뚜껑을 제거하고 passaged 수 우물에서 보낸 매체를 대기음. 피펫의 팁을 직접 우물 내부가 아닌 다른 접시의 어떤 부분을 만지는 것을 허용하지 않습니다.
- 멸균 유리 pipet을 사용하여 passaged으로 각 잘하기 위해 예열 collagenase IV 1 ML를 추가합니다.
- 5 분 37 ° C 배양기에 플레이트를 반환합니다.
근근이 살아가고 및 hES 세포를 풀링
- collagenase와 세포 잠복기 후, 현미경으로 식민지를 관찰합니다. 효소는 식민지의 가장자리에있는 미묘한 변화를 관찰할 수 있지만 원인이됩니다.
- 생물 학적 안전 캐비닛에서 부드럽게 각 우물에서 효소를 대기음 및 2.0 ML hES 세포 배양 매체로 바꿉니다.
- 팁 문화가 약간 당신을 향한 판과 5 ML 유리 pipet 최초의 우물에 2.0 ML 매체를 가져가라. 천천히 매체를 발표하면서 접시의 바닥에 pipet의 직각을 개최하면 부드럽게 잘 건너 pipet 팁을 활강.
- 힘든 및 pipetti를 반복NG 모션 3-4 회는 식민지의 모든 때까지 우물에서 삭제되었습니다. Pipet 부드럽게 조각 너무 작은으로 식민지를 파괴하지 않도록합니다. 세포가 최초의 우물에서 제거된 경우, 우물에 내용을두고 잘 다음의 세포를 근근이 살아가고 시작합니다.
- passaged 수 우물의 모든 스크랩한되었습니다, 수영장 살균 15 ML 원뿔 튜브의 각 우물에서 식민지의 조각을 포함하는 매체를.
- 각 잘하는 hES 세포 배양 매체 1 ML을 추가하여 스크랩한 우물 린스. 이 헹굼과 원뿔 관에 전달 수집합니다.
- 원하는 크기로 식민지 조각을 깨지 튜브 부드럽게 Pipet 세포.
- 200 X G.에서 5 분 동안 세포를 원심 분리기
hES 셀 전지를 도금
- hES 세포는 원심 분리기에있는 동안, 새로운 6 자 MEF 공급기 플레이트를 준비합니다. 셀 라인, 새로운 통로 번호 및 통로 날짜 : 적절한 hES 세포 정보 접시를 분류. 우물에서 MEF 미디어를 대기음 각 물론 1.0 ML PBS를 추가합니다. 부드럽게 소용돌이는 우물 주위에 버퍼와 PBS 세척을 대기음. 각 물론 1.5 ML hES 세포 배양 매체를 추가하고 접시를 따로 설정할 수 있습니다.
- hES 세포가 centrifuging 완료되면, 생물 안전 캐비닛 다시 튜브를 가져와. 느슨하게 - 포장 세포 펠렛을 방해하지 않도록주의하고, 표면에 뜨는를 대기음.
- 1 ML hES 세포 배양 매체마다 잘 도금 될 정도로 매체와 펠렛의 세포를 Resuspend. 6 개의 새 항목의 우물로 분할은 6 ML 매체에서 펠렛을 resuspend 때.
- 부드럽게하고 균일하게 MEF 피더 판을 잘 준비하기 위해 각 세포 현탁액 1 ML를 추가합니다.
- 37 ° C 배양기에 접시를 놓고 신중하게 고르게 잘 내내 세포를 배포하는쪽으로 뒤로 앞으로 판과 측면을 슬라이드.
- 세포 ° C 야간 37 첨부할 수 있습니다.
5. 대표 결과 :
Undifferentiated hES 세포는 작은 있으며, 단단히 - 포장, 그리고 일반적으로 세포 밖으로 더 크고 확산 구성되어 있습니다. 차별화는 식민지 (그림 1A) 내부 또는 식민지 (그림 3B) 사이에 발생할 수 있습니다.
다른 morhopologies는 현미경으로 낮은 배율에 따라 볼 수 있습니다. 같은 그림 2A에서 본 좋은 세포 형태, monolayer 성장 작은 단단히 포장 세포가 포함되어 있습니다. 전지없이 차별을 거의 깨끗한 정의 가장자리가 있어야합니다. 그림 2B에 표시된 세포가 passaging 준비하고 있으며, 그림 2C와 같이 세포가 초만원입니다.
그림 1. hES 문화의 차별화. 식민지의 (A) 분화 (B) 식민지 사이의 차별화.
그림 2. Morphologies는 hES 문화에서 본. (A) 좋은 세포 형태 (B) (C) 콩나물 세포를 passaging 준비 hES 세포.
Discussion
hES 세포와 함께 작업을 할 때 불임이 항상 유지되어야합니다. 사용하기 전에 생물 학적 안전 캐비닛 및 모든 장비를 청소하고 소독. 모든 시약은 사용하기 전에 0.22 μm의 기공 크기의 필터를 사용하여 필터링해야합니다. hES 세포 문화에 antiboiotics의 사용은 필요하지 않으며 피해야한다.
별도의 환경을 지정 따기 스테이션으로 설정해야합니다. 역에 대한 살균 인클로저는 자외선 광원, 층류 후드, 또는 생물 학적 안전 캐비닛과 정적 인클로저 (예 : PCR 워크 스테이션 등)하실 수 있습니다. 따기 기지 내부의 해부 현미경은 차별화된 영역이 제거됩니다으로 식민지를 관찰하기 위해 필요합니다. 정적 인클로저 또는 생물 학적 안전 캐비닛의 전면 유리 패널은 적절한 공기 흐름 및 불임을 손상시키지 않고 패널을 통해 확장할 수있는 현미경의 oculars 수 있도록 수정해야합니다.
건강한 hES 세포 문화를 유지하기 위해 세포는 일반적으로 모든 4~7일, 최적의 시간에 passaged해야합니다. 이때 식민지들은 최대 크기에 도달하고 병합 시작 수 있습니다. 병합된 식민지의 문화에 분화의 속도를 높일 수 있습니다. 분할 비율은 일반적으로 도금 식민지, 확장 속도, 문화 조건의 개수에 따라 1시 3분과 1시 5분 사이의 가을. Overplated 식민지 (너무 낮은 분할 비율)은 가능성이 완전히 병합하고 그들의 최대 크기에 도달하기 전에 passaged해야합니다.
이상의 이주 된 MEF 피더 계층에 대한 문화가 undifferentiated 성장과 확산을 지원하는 새로운 MEFs에 passaged해야합니다.
차별 자연스럽게 hES 세포 배양에서 발생 이후, 소량 예정입니다. 문화가 적절한 치료를받지 못하면 자주하거나 과도한 차별이 발생할 수 있습니다. 세포가 매일 공급해야하며, 통로 사이의 전면에 자라난 것은 피해야한다. 항상 신선한 시약을 사용합니다. 미디어 MEFs 및 시약의 모든 undifferentiated hES 세포의 성장을 피하기 위해 14 일 이내에 사용해야합니다. 이러한 넉아웃 세럼 교체, FBS 및 MEFs 같은 시약의 새로운 많이는 사용하기 전에 검사해야합니다. passaging 이전에 제거되지 않은 차별화된 세포가 새로운 문화로 전송됩니다 잊지 마십시오. 또한 ° C 가능한 37 세포를 유지하려고합니다. 세포는 세포가 오랜 기간에 대한 보육이 될 경우에는 온수 현미경 무대가 아주 도움이 될 수 있습니다 (현미경의 무대에서 또는 생물 학적 안전 캐비넷에서 예.) 배양기 밖을 보내고 시간을 최소화합니다.
현미경 hES 세포 배양을 관찰하면, 먼저 식민지보기가 낮은 전력 (2X 또는 5 배)를 사용하여 목표의 전반적인 품질과 크기를 평가. 잠재적 차별화된 세포는 낮은 전력에서 관찰하는 경우, 높은 배율의 목표를 (10X)를 사용하여 차별화된 형태를 확인합니다.
바로 차별을 제거 후, 식민지의 가장자리는 톱니 또는 손상된 나타날 수 있습니다. 나머지 undifferentiated 세포 복구할 수 있도록 새로운 매체 하룻밤 식민지를 품어. 문화 분화의 영향없이,이 남은 식민지는 정상적으로 세포 분열 따위에 의해 번식 나갈 것입니다.
가능하면 낮은 통로 hES 세포를 사용하여 실험을 시작합니다. 모든 주요 실험 전후의 세포 핵형.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM | Invitrogen | 11965-092 | For MEF medium |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Certified | Invitrogen | 16000-044 | Heat-inactivated For MEF medium |
| D-MEM/F-12 | Invitrogen | 11330-057 | |
| Knockout™ Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | Pre-screen to ensure support of hES cells |
| bFGF | Stemgent | 03-0002 | Use at [4 ng/mL] final |
| Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 200 mM (100X) Use at [1X] final |
| PBS | Invitrogen | 14190-250 | Without Ca2+ or Mg2+ |
| Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12 |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | Type A, Porcine |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Defined | Hyclone | SH300.70.01 | For freezing medium |
| 6-well plates | Nalge Nunc international | 140675 | For general culture |
| 4-well plates | Nalge Nunc international | 176740 | For thawing |
| 5 mL glass pipets | Fisher Scientific | 13-678-27E | Individually wrapped |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430052 | Polypropylene |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | 9” glass |
References
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. , 5th edition, Wiley-Liss. (2005).
