Summary
Este protocolo demonstra como manter saudável, indiferenciada-tronco embrionárias humanas (ES) células.
Abstract
Estaminais embrionárias humanas (CTeh) devem ser monitorados e tratados a fim de manter saudável, culturas indiferenciada. No mínimo, as culturas devem ser alimentados todos os dias, realizando uma mudança meio completo para repor os nutrientes perdidos e para manter as culturas livres de factores de diferenciação indesejados. Embora uma pequena quantidade de diferenciação é normal e esperado em culturas de células-tronco, a cultura deve ser rotineiramente limpos por remoção manual, ou "pegar" áreas diferenciadas. Identificação e remoção de excesso de diferenciação de culturas de células-tronco embrionárias humanas são técnicas essenciais para a manutenção de uma população saudável de células.
Protocol
1. Manutenção: Culturas Observando Sob o Microscópio
- Remover uma placa de células-tronco embrionárias humanas a partir do 37 ° C incubadora e trazer para o microscópio.
- Observe as colônias em baixa potência, usando uma ampliação de 2X ou 5X, para avaliar a qualidade da cultura em geral. Observe o seguinte: cor média normal, ausência de qualquer contaminação visível, tamanho da colônia em geral, qualidade e densidade, e quaisquer outras observações.
- Observar as mudanças de cor médio. Devido à mudança no pH eo esgotamento de nutrientes no meio, após um período de incubação durante a noite com as células-tronco embrionárias humanas, o meio irá mudar de uma tonalidade vermelha com um "canudo" de cor. Se o meio aparece roxo, uma mudança de pH básicos ocorreu. Se o meio parece extremamente amarelo, o meio tem acidificado. Meio muito amarela pode ser o resultado de colônias extremamente superlotadas no bem ou contaminação. O meio deve aparecer claro em todos os momentos. Apesar de um certo nível de restos celulares no meio é normal, ele nunca deve aparecer nublado. Se um nível elevado de restos celulares é observado, a cultura não é saudável e pode estar contaminada.
- Se as culturas não necessitam de manutenção ou passaging, eles podem ser levados para o gabinete de segurança biológica de ser alimentado (ver secção 2).
- Se as culturas contêm mais de cerca de 10% diferenciar as colônias, as células devem ser "limpos" por manualmente removendo as áreas diferenciadas (ver secção 3).
- Se as culturas contêm grandes colônias ou denso, ou a camada de alimentação MEF é mais do que 12 dias de idade, as células devem ser várias passagens (ver secção 4).
2. Alimentação Células-tronco embrionárias humanas
- Em uma cabine de segurança biológica estéril, retire a tampa da placa de cultura e aspire o meio gasto. Não permita que a ponta da pipeta para tocar em qualquer parte da placa que não seja diretamente dentro dos poços. Se houver qualquer preocupação de contaminação, a mudança para uma pipeta nova, estéril.
- Usando uma pipeta de vidro estéril, adicionar a quantidade apropriada de aquecido meio de cultura de células-tronco embrionárias humanas a cada poço. Para as culturas em uma placa de 6 poços, adicionar 2,5 mL médio por poço.
- Devolver a placa para a incubadora de permanecer em 37 ° C e 5% CO 2.
3. Diferenciação remoção de culturas de células-tronco embrionárias humanas
- Transformar 9 polegadas de vidro Pasteur pipetas em ferramentas escolher por moldagem as dicas sobre a chama controlada de um queimador de álcool. Certifique-se que a ponta da pipeta é selada para evitar a contaminação e arredondadas para evitar riscar o plástico da placa de cultura. Esterilizar as ferramentas escolher antes de usar usando a fonte de luz UV no gabinete de segurança biológica ou escolher gabinete.
- Remover as áreas diferenciadas. Diferenciação ocorre muitas vezes em apenas uma parte de uma colônia de células-tronco embrionárias humanas, geralmente ao longo das bordas ou como pontos isolados no centro. Se apenas uma seção de uma colônia é a diferenciação, apenas a área diferenciada precisa ser removido. Diferenciação pode muitas vezes levantar a placa em uma folha de "pegajoso", e é útil para primeiro separar as células diferenciadas do resto da colônia desenhando uma linha através da colônia com o fim da ferramenta de colheita.
- Uma vez que as peças da colônia são separados, suavemente deslizar a ferramenta escolhendo ao longo da placa para retirar as células indesejáveis. Tome cuidado para não raspar muito da camada de alimentador MEF entre as colônias nesse processo.
- Quando todas as células diferenciadas são removidos da placa (e flutuando no meio), o retorno da cultura para o gabinete de segurança biológica. Aspirar o meio contendo as células diferenciadas e substituir por novos meios de cultura de células-tronco embrionárias humanas.
4. Passaging Células-tronco embrionárias humanas
A incubação da enzima
- Em uma cabine de segurança biológica estéril, retire a tampa da placa de cultura de 6 bem e aspirar o médio gasto dos poços a serem várias passagens. Não permita que a ponta da pipeta para tocar em qualquer parte da placa que não seja diretamente dentro dos poços.
- Usando uma pipeta de vidro estéril, adicionar 1 mL de colagenase IV aquecido a cada poço a ser várias passagens.
- Devolver a placa para a 37 ° C incubadora por 5 minutos.
Raspagem e Pooling as células-tronco embrionárias humanas
- Após incubar as células com colagenase, observe as colônias sob o microscópio. A enzima deve causar uma mudança sutil, mas perceptível nas bordas da colônia.
- No gabinete de segurança biológica, aspirar cuidadosamente a enzima de cada poço e substituir com 2,0 mL meio de cultura de células-tronco embrionárias humanas.
- Dica placa de cultura um pouco para você e assumir a médio mL 2.0 no primeiro poço, com uma pipeta de vidro de 5 mL. Segurando a pipeta perpendicular ao fundo do prato, suavemente deslizar a ponta da pipeta em todo o bem, enquanto liberando lentamente o meio.
- Repita a raspagem e pipettivezes ng movimento 3-4 até que todas as colônias foram retiradas do poço. Pipeta com cuidado para não romper as colônias em muito pequeno de peças. Quando as células foram removidas do primeiro poço, deixe o conteúdo no poço e começar a raspar as células fora da próxima também.
- Quando todos os poços a serem várias passagens foram raspados piscina, o meio contendo as peças de cada colônia bem em um tubo estéril 15 ml cônico.
- Lave os poços raspada, adicionando 1 mL de cultura de células-tronco embrionárias humanas média a cada poço. Coletar essas lavar e transferir para o tubo cônico.
- Pipeta suavemente as células no tubo para quebrar os pedaços colônia até o tamanho desejado.
- Centrifugar as células por 5 minutos a 200 x g.
Chapeamento as células-tronco embrionárias humanas Célula
- Enquanto as células-tronco embrionárias humanas são na centrífuga, prepare um novo 6 bem-alimentador placa MEF. Rótulo a placa com as informações apropriadas de células-tronco embrionárias humanas: linha celular, o número de nova passagem, ea data de passagem. Aspirar o meio de MEF dos poços e adicionar 1,0 mL de PBS a cada poço. Agite suavemente o tampão ao redor dos poços e aspire a lavagem PBS. Adicione 1,5 mL de cultura de células-tronco embrionárias humanas média a cada poço e colocou o prato de lado.
- Quando as células-tronco embrionárias humanas terminar a centrifugação, o tubo de trazer de volta para o gabinete de segurança biológica. Aspirar o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o frouxamente cheia de pellet celular.
- Ressuspender as células do pellet com o meio suficiente para 1 mL meio de cultura de células-tronco embrionárias por também ser banhado. Quando se dividir em seis novos poços, ressuspender o sedimento em 6 de médio mL.
- Suavemente e uniformemente, adicione 1 mL da suspensão de células a cada preparado poço da placa de alimentação MEF.
- Coloque a placa no 37 ° C incubadora e deslize com cuidado a placa para a frente para trás, e para os lados para distribuir uniformemente as células ao longo do poço.
- Permitir que as células para anexar a 37 ° C durante a noite.
5. Resultados representativos:
Células indiferenciadas-tronco embrionárias humanas são pequenas, bem-embalado, e geralmente consistem de propagação maior, mais fora das células. Diferenciação pode ocorrer dentro de uma colônia (Figura 1A) ou entre as colônias (Figura 3B).
Morhopologies diferentes pode ser visto sob baixa ampliação sob o microscópio. A morfologia das células boas, como visto na Figura 2A, contém pequenas células hermeticamente embalados, que crescem em uma monocamada. Células devem ter limpo, bordas definidas, com pouca ou nenhuma diferenciação. As células mostrado na Figura 2B estão prontos para passaging, e as células mostrado na Figura 2C estão superlotadas.
Figura 1. Diferenciação em culturas-tronco embrionárias humanas. (A) a diferenciação de uma colônia (B) diferenciação entre colônias.
Figura 2. Morfologias visto nas culturas tronco embrionárias humanas. (A) a morfologia das células bom (B) células-tronco embrionárias humanas que estão prontos para passaging (C) celas superlotadas.
Discussion
Esterilidade deve ser mantida em todos os momentos quando se trabalha com células-tronco embrionárias humanas. Limpar e esterilizar o gabinete de segurança biológica e todos os equipamentos antes do uso. Todos os reagentes devem ser filtrados utilizando um filtro de 0,22 mM tamanho dos poros antes de usar. O uso de antiboiotics em cultura de células-tronco embrionárias humanas não é necessária e deve ser evitado.
Um ambiente separado deve ser configurado como uma estação de colheita designado. O invólucro estéril para a estação pode ser um gabinete estático (como uma estação de trabalho PCR) com uma fonte de luz UV, uma capela de fluxo laminar, ou uma câmara de segurança biológica. Um microscópio de dissecação dentro da estação de colheita é necessária para observar as colônias como áreas diferenciadas são removidos. O painel de vidro frontal de um gabinete estático ou um gabinete de segurança biológica deve ser modificado para permitir o oculares do microscópio para estender através do painel, sem comprometer a ventilação adequada e esterilidade.
Para manter a cultura de células-tronco embrionárias humanas saudáveis, as células devem ser várias passagens no momento ideal, geralmente a cada 4-7 dias. Neste momento as colônias atingiram o seu tamanho máximo e pode estar começando a se fundir. Colônias fundiu pode aumentar a taxa de diferenciação na cultura. Relações dividido geralmente caem 1:03 - 01:05, dependendo do número de colônias banhado, a taxa de expansão, e as condições de cultura. Colônias Overplated (razão de separação muito baixo) provavelmente fundir prematuramente e precisam ser várias passagens antes que eles atinjam seu tamanho máximo.
Culturas em uma camada de alimentação MEF que é mais de 2 semanas de idade deve ser várias passagens sobre a nova MEFs que irá apoiar o crescimento e proliferação indiferenciada.
Uma vez que a diferenciação ocorre naturalmente em culturas de células-tronco embrionárias humanas, uma pequena quantidade é esperada. Diferenciação freqüente ou excessivo pode ocorrer se as culturas não recebem os cuidados adequados. As células devem ser alimentados todos os dias, overgrowth entre as passagens devem ser evitados. Sempre usar reagentes frescos. Todos os, meios de comunicação MEFs e reagentes deve ser usado dentro de 14 dias para evitar o crescimento de células-tronco embrionárias indiferenciadas. Novos lotes de reagentes, tais como a substituição Knockout Serum, FBS e MEFs, deve ser rastreada antes de usar. Lembre-se que as células diferenciadas não removidos antes da passaging serão transferidos para as novas culturas. Além disso, tente manter as células a 37 ° C, sempre que possível. Minimizar o tempo de as células passam fora da incubadora (por exemplo, no palco microscópio ou no gabinete de segurança biológica.) Um estágio do microscópio aquecida pode ser muito benéfico se as células serão da incubadora por longos períodos de tempo.
Ao observar a culturas de células-tronco embrionárias sob o microscópio, primeiro avaliar a qualidade geral eo tamanho das colônias vista usando uma potência baixa (2x ou 5x) objetiva. Se as células potencialmente diferenciados são observados em baixa potência, confirme a morfologia diferenciadas com um objetivo maior ampliação (10X).
Imediatamente após a remoção de diferenciação, as bordas das colônias poderão aparecer irregulares ou danificadas. Incubar as colônias durante a noite em meio fresco para permitir que as células restantes indiferenciadas para se recuperar. Sem a influência de diferenciação na cultura, estas colônias restantes continuarão a proliferar normalmente.
Se possível, começar os experimentos com células-tronco embrionárias humanas passagem de baixo. Cariótipo das células antes e depois de todos os experimentos principais.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM | Invitrogen | 11965-092 | For MEF medium |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Certified | Invitrogen | 16000-044 | Heat-inactivated For MEF medium |
| D-MEM/F-12 | Invitrogen | 11330-057 | |
| Knockout™ Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | Pre-screen to ensure support of hES cells |
| bFGF | Stemgent | 03-0002 | Use at [4 ng/mL] final |
| Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 200 mM (100X) Use at [1X] final |
| PBS | Invitrogen | 14190-250 | Without Ca2+ or Mg2+ |
| Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12 |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | Type A, Porcine |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Defined | Hyclone | SH300.70.01 | For freezing medium |
| 6-well plates | Nalge Nunc international | 140675 | For general culture |
| 4-well plates | Nalge Nunc international | 176740 | For thawing |
| 5 mL glass pipets | Fisher Scientific | 13-678-27E | Individually wrapped |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430052 | Polypropylene |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | 9” glass |
References
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. , 5th edition, Wiley-Liss. (2005).
