Summary
Detta protokoll visar hur att bevara friska, odifferentierade embryonala stamceller (ES-celler).
Abstract
Mänskliga embryonala stamceller (HES) celler måste övervakas och vårdas för att bibehålla friska, odifferentierade kulturer. Vid minst måste de kulturer matas varje dag genom att utföra en komplett medelstora förändring för att fylla på förlorade näringsämnen och för att hålla kulturer fri från oönskad differentiering faktorer. Även en liten mängd av differentiering är normalt och förväntat i kulturer stamceller bör kultur rutinmässigt saneras genom att manuellt ta bort, eller "plocka" differentierade områden. Identifiera och ta bort överskott differentiering från hES cellkulturer är viktiga tekniker för att upprätthålla en frisk population av celler.
Protocol
1. Underhåll: Beaktande kulturer under luppen
- Ta en tallrik hES celler från 37 ° C inkubator och ta med till mikroskop.
- Observera kolonier med låg effekt, med 2x eller 5x förstoring, för att bedöma den samlade kulturen kvalitet. Observera följande: normal medelstora färg, avsaknad av synliga föroreningar, övergripande koloni storlek, kvalitet och täthet, och alla andra observationer.
- Observera medelstora färgförändringar. På grund av förändringar i pH och utarmning av näringsämnen i mediet efter en natts inkubation med hES-celler, kommer mediet ändras från en röd nyans till en "halm" färg. Om mediet visas lila, har en grundläggande pH-skift inträffat. Om skivan verkar extremt gult, har mediet försurade. Mycket gult medium kan vara ett resultat av extremt trångbodda kolonier i brunnen eller förorening. Mediet skall vara klar vid alla tillfällen. Även om en viss nivå av cellfragment på medellång är normalt, bör den visas aldrig grumligt. Om en hög cellfragment observeras, är kulturen inte hälsosamt och kan vara förorenade.
- Om kulturerna inte kräver underhåll eller passaging, kan de tas till den biologiska säkerheten skåpet matas (se avsnitt 2).
- Om kulturerna innehåller mer än ca 10% skilja kolonier bör cellerna "städas upp" genom att manuellt ta bort differentierade områden (se avsnitt 3).
- Om kulturerna innehåller stora eller täta kolonier, eller MEF matare skiktet är mer än 12 dagar gamla, bör cellerna passerats (se avsnitt 4).
2. Utfodring hES-celler
- I en steril biologisk säkerhet skåp, ta bort locket på kulturen skålen och aspirera det använda mediet. Låt inte spetsen på pipetten att röra någon del av plattan än direkt i brunnarna. Om det finns någon oro för smitta, byt till en ny, steril pipett.
- Använd en steril glas pipett, tillsätt lämplig mängd uppvärmd hES cellkulturmedium i varje brunn. För kulturer i en 6-brunnar, tillsätt 2,5 mL medel per brunn.
- Återgå plattan till inkubatorn att stanna vid 37 ° C och 5% CO 2.
3. Ta bort Differentiering från hES cellkulturer
- Förvandla 9 tums glas Pasteur pipetter i plocka verktyg genom gjutning tipsen över kontrollerad eld i ett alkohol-brännare. Se till att spetsen på pipetten är förseglad för att förhindra förorening och rundade för att undvika repor i plast av kulturen skålen. Sterilisera plocka verktyg före användning med hjälp av UV-ljuskällan i den biologiska säkerhetsskåp eller plocka kapsling.
- Ta bort de differentierade områden. Differentiering förekommer ofta i bara en del av en hES cell koloni, oftast längs kanterna eller som isolerade platser i centrum. Om endast en del av en koloni är särskiljande, behöver bara de differentierade området ska tas bort. Differentiering kan ofta lyfta av plattan i en "klibbiga" blad, och det är bra att först separera differentierade celler från resten av kolonin genom att rita en linje genom kolonin med slutet av plockning verktyg.
- När bitar av kolonin är separerade, försiktigt glida plockning verktyg längs plattan bort oönskade celler. Se till att inte skrapa bort för mycket av MEF matare lagret mellan kolonierna i denna process.
- När alla de differentierade cellerna tas bort från plattan (och flytande på medellång), tillbaka kulturen till biologisk säkerhet skåp. Sug mediet innehåller differentierade celler och ersätta med färsk hES cellkulturmedium.
4. Passaging hES-celler
Enzym Inkubation
- I en steril biologisk säkerhet skåp, ta bort locket på 6-bra kultur skålen och aspirera det använda mediet från brunnarna ska passerats. Låt inte spetsen på pipetten att röra någon del av plattan än direkt i brunnarna.
- Använd en steril glas pipett tillsätt 1 ml uppvärmd kollagenas IV till varje brunn för att bli passerats.
- Återgå plattan i 37 ° C inkubator i 5 minuter.
Skrapning och samlande hES-celler
- Efter inkubering av cellerna med kollagenas, observera kolonierna under mikroskop. Det enzym bör medföra en subtil men märkbar förändring i kolonin kanterna.
- I den biologiska säkerhetsbänk försiktigt aspirera enzymet från varje brunn och ersätta med 2,0 ml hES cellkulturmedium.
- Tips odlingsplattan något mot dig och ta upp 2,0 ml medium i den första brunnen med ett 5 ml glasflaska pipett. Håll pipett vinkelrätt mot botten av plattan, försiktigt glida pipettspetsen över väl medan långsamt släppa mediet.
- Upprepa skrapning och pipetting rörelse 3-4 gånger tills alla kolonier har tagits bort från brunnen. Pipettera försiktigt för att undvika att bryta upp kolonier i för små bitar. När cellerna har tagits bort från den första brunnen, lämna innehållet i brunnen och börja skrapa celler bort av nästa brunn.
- När alla de brunnar som passerats har skrapats, pool mediet innehåller kolonin bitar från varje brunn i en steril 15 ml koniska rör.
- Skölj skrapas brunnar genom att tillsätta 1 mL av hES cellkulturmedium i varje brunn. Samla här Skölj och överföring till den koniska röret.
- Pipettera cellerna försiktigt i röret för att bryta upp kolonin bitarna upp till önskad storlek.
- Centrifugera cellerna i 5 minuter vid 200 x g.
Plätering hES Cell celler
- Medan hES celler i centrifugen, förbereda en ny 6-och MEF matare plattan. Etikett plattan med lämplig hES cellinformation: cellinje, ny passage nummer och passage datum. Aspirera MEF mediet från brunnarna och tillsätt 1,0 mL PBS i varje brunn. Vagga försiktigt bufferten runt brunnarna och aspirera PBS tvätt. Tillsätt 1,5 mL hES cellkulturens medium till varje brunn och ställ in plattan åt sidan.
- När hES-celler är klar centrifugering, ta tuben tillbaka till biologisk säkerhet skåp. Aspirera supernatanten försiktigt så att inte störa den löst packade cellpelleten.
- Resuspendera cellerna i pellets med tillräckligt med medel för 1 mL hES cellkulturmedium per brunn vara klädd. När delas upp i sex nya brunnar, suspendera pelleten i 6 ml medium.
- Försiktigt och jämnt tillsätt 1 ml av cellsuspensionen till var väl förberedd av MEF matare plattan.
- Placera plattan i 37 ° C inkubator och skjut försiktigt plattan framåt till bakåt och från sida till sida att fördela de celler i hela väl.
- Låt cellerna att fästa vid 37 ° C över natten.
5. Representativa resultat:
Odifferentierade hES celler är små, tätt packade, och består vanligtvis av större och mer utspridda celler. Differentiering kan ske inom en koloni (Figur 1A) eller mellan kolonier (Figur 3B).
Olika morhopologies kan ses under låg förstoring i mikroskop. En bra cellmorfologin, som visas i figur 2A, innehåller små, tätt packade celler som växer i ett monolager. Celler bör ha rena, definierade kanter, med liten eller ingen differentiering. De celler som visas i figur 2B är klara för passaging, och de celler som visas i figur 2C är överfulla.
Figur 1. Differentiering vid HES kulturer. (A) differentiering av en koloni (B) differentiering mellan kolonier.
Figur 2. Morfologier sett i hES kulturer. (A) bra cellmorfologin (B) hES celler som är redo för passaging (C) överfulla celler.
Discussion
Sterilitet måste underhållas hela tiden när man arbetar med HES celler. Rengör och sterilisera biologisk säkerhet skåp och all utrustning före användning. Alla reagenser måste filtreras med hjälp av en 0,22 ìm porstorlek filtret före användning. Användningen av antiboiotics vid HES cellkultur är inte nödvändig och bör undvikas.
En separat miljö bör inrättas som en designerad plocka station. Den sterila kapsling för stationen kan vara en statisk inhägnad (t.ex. ett PCR-arbetsstation) med en UV-ljuskälla, ett laminärt flöde huva, eller en biologisk säkerhet skåp. En dissekera mikroskop inuti plocka stationen behövs för att observera de kolonier som de differentierade områden tas bort. Den främre glas panel en statisk inhägnad eller ett biologiskt säkerhetsbänk måste ändras för att möjliggöra okularen i mikroskop för att förlänga genom panelen utan att kompromissa korrekt luftflöde och sterilitet.
För att bibehålla sunda hES cellodlingar, måste cellerna passerats vid den optimala tidpunkten, typiskt var 4-7 dagar. Vid denna tid kolonierna har nått sin maximala storlek och kan börja gå samman. Sammanslagna kolonier kan öka graden av differentiering i kulturen. Split nyckeltal faller i allmänhet från 1:03 till 01:05, beroende på antalet kolonier pläterade, expansionstakt och villkor kultur. Overplated kolonier (delningsfaktorn för låg) kommer sannolikt att slås samman för tidigt och måste passerats innan de når sin maximala storlek.
Kulturer på en MEF matare lager som är mer än 2 veckor gamla måste passerats på nya MEFs som kommer att stödja odifferentierad tillväxt och spridning.
Sedan differentiering naturligt i hES cellkulturer, är en liten summa förväntas. Frekvent eller överdriven differentiering kan uppstå om de kulturer inte får lämplig vård. Cellerna måste matas varje dag, bör överväxt mellan passager undvikas. Använd alltid färska reagenser. Alla medier, MEFs och reagenser måste användas inom 14 dagar för att undvika odifferentierade hES celltillväxt. Nya massor av reagens, som Knockout Serum Replacement, FBS och MEFs, bör säkerhetskontrolleras innan användning. Kom ihåg att alla differentierade celler inte avlägsnas före passaging kommer att överföras till den nya kulturer. Försök också att hålla cellerna vid 37 ° C när det är möjligt. Minimera den tid de celler tillbringar utanför kuvösen (t.ex. på mikroskop scenen eller i den biologiska säkerhetsskåp.) En uppvärmd mikroskop skede kan vara mycket fördelaktigt om cellerna kommer att vara av inkubatorn under längre perioder.
När observera hES cellkulturer i mikroskop, först bedöma den övergripande kvaliteten och storleken på kolonierna vyn med en låg effekt (2x eller 5x) mål. Om potentiellt differentierade celler observeras vid låg effekt, bekräfta de differentierade morfologi med hjälp av en högre förstoring mål (10X).
Omedelbart efter att ta bort differentiering kan kanterna av kolonierna hackiga eller skadade. Inkubera kolonierna natten i nya medium till att återstående odifferentierade celler att återhämta sig. Utan påverkan av differentiering i kulturen, kommer dessa kvarvarande kolonier fortsätta att föröka sig normalt.
Om möjligt, börja experiment med låga passagen hES celler. Karyotyp cellerna före och efter alla större experiment.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM | Invitrogen | 11965-092 | For MEF medium |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Certified | Invitrogen | 16000-044 | Heat-inactivated For MEF medium |
| D-MEM/F-12 | Invitrogen | 11330-057 | |
| Knockout™ Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | Pre-screen to ensure support of hES cells |
| bFGF | Stemgent | 03-0002 | Use at [4 ng/mL] final |
| Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 200 mM (100X) Use at [1X] final |
| PBS | Invitrogen | 14190-250 | Without Ca2+ or Mg2+ |
| Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12 |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | Type A, Porcine |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Defined | Hyclone | SH300.70.01 | For freezing medium |
| 6-well plates | Nalge Nunc international | 140675 | For general culture |
| 4-well plates | Nalge Nunc international | 176740 | For thawing |
| 5 mL glass pipets | Fisher Scientific | 13-678-27E | Individually wrapped |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430052 | Polypropylene |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | 9” glass |
References
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. , 5th edition, Wiley-Liss. (2005).
