Summary
Bu protokol, sağlıklı, farklılaşmamış insan embriyonik kök (ES) hücreleri korumak için nasıl kullanılacağını gösterir.
Abstract
İnsan embriyonik kök (embriyonik kök) hücreler, sağlıklı, farklılaşmamış kültürleri korumak için izlenmeli ve bakım gerekir. En azından, kültürler kayıp besin doldurmak ve istenmeyen farklılaşma faktörleri kültürleri tutmak için tam bir orta değişikliği yaparak her gün beslenen olmalıdır. Küçük bir miktar farklılaşma normaldir ve kök hücre kültürleri bekleniyor olmasına rağmen, kültür rutin elle kaldırma veya diferansiye alanların "toplama" temizlenir olmalıdır. Belirlenmesi ve embriyonik kök hücre kültürleri fazla farklılaşma kaldırarak hücrelerin sağlıklı bir nüfus bakımında temel teknikler vardır.
Protocol
1. Bakım: Mikroskop altında Gözlem Kültürleri
- 37 ° C inkübatör embriyonik kök hücrelerinin bir tabak çıkarın ve mikroskop getirmek.
- Genel kültür kalitesini değerlendirmek için, 2X veya 5X büyütme kullanarak, düşük güç koloniler uyun. Aşağıdaki Not: normal orta renk, herhangi bir görünür kirlenme, genel koloni boyutu, kalite ve yoğunluk olmaması, ve başka herhangi bir gözlem.
- Orta renk değişiklikleri gözlemleyin. PH değişikliği ve embriyonik kök hücreleri ile bir gecelik inkübasyondan sonra orta besinlerin tükenmesi nedeniyle, orta bir "saman" renk kırmızı bir renk tonu değişecektir. Orta mor belirirse, temel bir pH değişimi meydana gelmiştir. Orta derece sarı görünüyorsa, orta asitlendirilmiş vardır. Çok sarı orta, iyi ya da kirlenme çok kalabalık koloniler sonucu olabilir. Orta her zaman açıkça görünmelidir. Orta hücre enkaz belli bir seviyesi normal olmasına rağmen, bulanık görünür asla. Yüksek düzeyde bir hücre enkaz görülürse, kültür sağlıklı değildir ve kontamine olabilir.
- Kültürleri, bakım veya Pasajlanması gerek duymuyorsanız, onlar (bkz. Bölüm 2) beslenebilir biyolojik güvenlik kabini alınabilir.
- Kültürleri, yaklaşık% 10 koloniler ayırt daha fazla içeriyorsa, hücreler diferansiye alanların (bkz. Bölüm 3) el kaldırarak "temizlenmiş" olmalıdır.
- Kültürlerin büyük ya da yoğun koloniler içeren veya MEF besleyici tabaka fazla 12 gün ise, hücreler (bkz. bölüm 4) geçişli olmalıdır.
2. Besleme embriyonik kök Hücreler
- Steril bir biyolojik güvenlik kabini, kültür çanağı kapağı kaldırın ve harcanan orta aspire. Pipet ucu plakası doğrudan kuyuları içinde başka herhangi bir bölümünün temas etmesine izin vermeyin. Kontaminasyon herhangi bir endişeniz varsa, yeni bir steril pipet değiştirin.
- Steril bir damlalıklı cam kullanarak, her bir kuyu için ısıtılmış embriyonik kök hücre kültür ortamı uygun miktarda ekleyebilirsiniz. 6 plaka kültürleri için, ortalama 2.5 ml orta ekleyin.
- 37 ° C ve% 5 CO 2 kalmasını inkübatör plaka dönün.
3. Embriyonik kök Hücre Kültürleri Farklılaşma çıkarma
- Kalıplama alkol brülör kontrollü ateşte ipuçları toplama araçlarına 9 inç cam Pasteur pipetler dönüştürün. Pipet ucu bulaşmasını önlemek için mühürlü ve kültür çanağı plastik çizilmesini önlemek için yuvarlak olduğunu emin olun. Toplama araçları kullanımı, biyolojik güvenlik kabini UV ışık kaynağı kullanılarak veya muhafaza toplama önce sterilize edin.
- Diferansiye alanların çıkarın. Farklılaşma, genellikle sadece bir kısmını genellikle kenarlarında veya merkezi izole noktalar olarak embriyonik kök hücre kolonisi oluşur. Bir koloni sadece bir bölüm ayırt ise, sadece farklılaştırılmış alanda kaldırılması gerekir. Farklılaşma plakası genellikle bir "yapışkan" sayfasında kaldırın, ve koloni toplama aracı ile bir çizgi çizerek farklılaşmış hücrelerin ilk koloninin geri kalanından ayırmak için yararlı olur.
- Koloninin parçalara ayrılır sonra hafifçe istenmeyen hücreleri ayırmak için plaka boyunca toplama aracı kayma. Bu süreçte kolonileri arasında çok MEF besleyici tabaka kazınması için özen gösterin.
- Farklılaşmış hücrelerin tüm plaka (orta yüzen) kaldırıldığında, biyolojik güvenlik kabini kültür dönün. Farklılaşmış hücrelerin bulunduğu orta aspire edin ve taze embriyonik kök hücre kültür ortamı ile değiştirin.
4. Pasajlanması embriyonik kök Hücreler
Enzim Kuluçka
- Steril bir biyolojik güvenlik kabini, 6-iyi bir kültür çanağı kapağı çıkarın ve geçişli olmak için kuyulardan harcanan orta aspirat. Pipet ucu plakası doğrudan kuyuları içinde başka herhangi bir bölümünün temas etmesine izin vermeyin.
- Steril bir damlalıklı cam kullanarak, geçişli olması için her iyi ısıtılmış kollajenaz IV 1 ml ekleyin.
- 5 dakika boyunca 37 ° C inkübatör plaka dönün.
Kazıma ve embriyonik kök Hücreler havuzu
- Kollajenaz hücreleri kuluçka sonra, mikroskop altında koloniler gözlemliyoruz. Enzim koloni kenarları ince ama gözlemlenebilir bir değişikliğe neden gerekir.
- Biyolojik güvenlik kabini, enzim yavaşça her kuyudan aspirat ve 2.0 mL embriyonik kök hücre kültür ortamı ile değiştirin.
- İpucu kültür plaka ve hafifçe kendinize doğru bir 5 ml damlalıklı cam ile ilk kuyuda 2.0 mL orta sürebilir. Yavaş yavaş orta bırakırken plakasının altına pipetlemeyin dik tutarak yavaşça iyi genelinde pipetlemeyin ucu kayma.
- Kazıma ve pipetti tekrarlayın.ng hareketi 3-4 kez, tüm kolonilerin kadar iyi çıkarıldı. Pipetleyin hafifçe adet çok küçük koloniler kesiliyor önlemek için. Hücrelerin ilk kuyudan söküldükten, iyi içindekilerin terk edip de sonraki hücreleri kazıyarak başlamak.
- geçişli kuyulardan tüm kazınarak, havuz orta steril 15 ml konik tüp her iyi koloni parçaları içeren.
- Embriyonik kök hücre kültür ortamı, her bir kuyunun 1 ml ekleyerek kazınarak kuyu durulayın. Durulayın ve konik tüp transfer toplayın.
- Koloni parçaları istediğiniz boyuta kadar kırmak için tüp hafifçe pipetleyin hücreler.
- 5 dakika için 200 x g. hücreleri Santrifüj
Embriyonik kök Hücre Hücreler Kaplama
- Embriyonik kök hücreler santrifüj olmasına rağmen, yeni bir 6-iyi MEF besleyici plaka hazırlar. : Hücre hattı, yeni bir geçit sayısı, ve geçiş tarihini uygun embriyonik kök hücre bilgisi plaka etiketleyin. Kuyulardan MEF orta aspire ve her kuyuya 1.0 ml PBS ekleyin. Yavaşça girdap kuyuları etrafında tampon ve PBS yıkayın aspire. Her kuyuya 1.5 mL embriyonik kök hücre kültür ortamı ekleyin ve plaka kenara koyun.
- Embriyonik kök hücreler santrifüj bittiğinde, biyolojik güvenlik kabini geri tüp getirmek. Gevşekçe paketlenmiş hücre pelletini rahatsız etmemek için dikkatli olmak, süpernatantı aspire edin.
- 1 ml embriyonik kök hücre kültür ortamı için iyi kaplama için yeterli ortamı ile pelet hücrelerin tekrar 6 yeni kuyu bölme, 6 ml orta pelet tekrar süspansiyon haline getirin.
- Yavaşça ve eşit MEF besleyici plaka iyi hazırlanmış her hücre süspansiyonu 1 ml ekleyin.
- Plaka 37 ° C inkübatör içine yerleştirin ve dikkatle kuyu boyunca hücreler eşit olarak dağıtmak için ileri geri plaka ve yan tarafına kaydırın.
- Hücrelerin ° C gecede 37 takmak için izin verin.
5. Temsilcisi Sonuçlar:
Farklılaşmamış embriyonik kök hücreleri küçük, sıkıca paketlenmiş, ve genellikle daha büyük, daha fazla yayılmasını hücreleri oluşur. Farklılaşma, bir koloni (Şekil 1A) içinde veya koloniler (Şekil 3B) arasında oluşabilir.
Farklı morhopologies, mikroskop altında düşük büyütme altında görülebilir. Şekil 2A görüldüğü gibi iyi bir hücre morfolojisi, bir tek tabaka yetişen küçük, sıkışık hücre içerir. Hücreler herhangi bir farklılaşma küçük, temiz, tanımlı kenarları olmalıdır. Şekil 2B gösterilen hücreler Pasajlanması için hazır ve Şekil 2C gösterilen hücreler kalabalık.
Şekil 1. Embriyonik kök kültürleri Farklılaşma (A) bir koloni farklılaşma (B) kolonileri arasında ayrım.
Şekil 2. Morfolojileri embriyonik kök kültürleri görülmektedir. (A) iyi bir hücre morfolojisi (B), (C) kalabalık hücreleri Pasajlanması için hazır embriyonik kök hücreler.
Discussion
Embriyonik kök hücreleri ile çalışırken Sterilite her zaman sağlanmalıdır. Biyolojik güvenlik kabini ve tüm ekipman kullanmadan önce temizleyin ve sterilize edin. Tüm reaktifler kullanmadan önce 0.22 mikron gözenek boyutu filtre kullanarak filtre edilmelidir. , Embriyonik kök hücre kültüründe antiboiotics kullanımı gerekli değildir ve kaçınılmalıdır.
Ayrı bir ortamda belirli bir toplama istasyonu olarak ayarlanmış olmalıdır. Istasyonu için steril muhafaza UV ışık kaynağı, laminer akış kaputu, ya da biyolojik güvenlik kabini ile statik bir muhafaza (PCR iş istasyonu olarak) olabilir. Diferansiye alanların kaldırılır koloniler dikkat çekme istasyonu içindeki bir diseksiyon mikroskobu gereklidir. Statik muhafaza veya biyolojik güvenlik kabini ön cam panel, uygun hava akımı ve kısırlık ödün vermeden paneli üzerinden genişletmek için mikroskop Okülerin izin vermek için değiştirilmesi gerekir.
Hücrelerin sağlıklı embriyonik kök hücre kültürleri korumak için, genellikle her 4-7 gün, en uygun zamanda geçişli olmalıdır. Şu anda koloniler maksimum boyutuna ulaştı ve birleştirme başlangıcı olabilir. Birleştirilmiş koloniler kültür farklılaşma oranını artırabilir. Bölünmüş oranları genelde, 01:03 ve 01:05 arasında kalan kaplama koloniler, büyüme oranı ve kültür koşulları sayısına göre. Overplated koloniler (split oranı çok düşük) muhtemelen erken birleştirme ve onların maksimum boyutuna ulaşmadan geçişli olması gerekir.
2 haftadan daha uzun bir MEF besleyici tabaka Kültürler farklılaşmamış büyüme ve proliferasyonunu destek olacak yeni MEFS geçişli olmalıdır.
Farklılaşma doğal embriyonik kök hücre kültürleri oluşur, küçük bir miktar bekleniyor. Sık sık veya aşırı farklılaşma kültürler uygun bakım almazsanız oluşabilir. Hücrelerin her gün beslenmesi gerekir, pasajlar arasında aşırı çoğalma kaçınılmalıdır. Her zaman taze reaktifler kullanın. Bütün medya, MEFS ve reaktifler farklılaşmamış embriyonik kök hücre büyümesini önlemek için, 14 gün içinde kullanılmalıdır. Nakavt Serum Değiştirme, FBS ve MEFS, reaktiflerin lot kullanmadan önce taranmalıdır. Pasajlanması için önce kaldırılmaz farklılaşmış hücrelerin yeni kültürler transfer olacağını unutmayın. Ayrıca, hücreler 37 ° C mümkün olduğunca az tutmaya çalışın. Hücreleri hücrelerin uzun süre kuluçka edilecektir Isıtılmış bir mikroskop aşamasında çok yararlı olabilir (örneğin mikroskop sahnede veya biyolojik güvenlik kabini) kuluçka dışında geçirdikleri zamanı en aza indirin.
Mikroskop altında embriyonik kök hücre kültürleri gözlemlemek, ilk kolonilerin görünümü bir düşük güç kullanarak (2x veya 5x) amacı genel kalitesi ve boyutu değerlendirir. Potansiyel olarak farklılaşmış hücreleri düşük güç görüldüğü takdirde, daha yüksek bir büyütme objektif (10X) ile farklılaştırılmış morfolojisi onaylayın.
Çıkardıktan sonra hemen farklılaşma, kolonilerin kenarları tırtıklı veya bozuk görünebilir. Kalan farklılaşmamış hücreleri kurtarmak için izin taze orta gecede koloniler inkübe edin. Kültüründe farklılaşmanın etkisi olmadan, bu kalan koloniler normal sayısı hızla artmaya devam edecektir.
Eğer mümkünse, düşük geçiş embriyonik kök hücreler kullanılarak deneyler başlar. Tüm büyük deney öncesi ve sonrası hücreleri Karyotip.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM | Invitrogen | 11965-092 | For MEF medium |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Certified | Invitrogen | 16000-044 | Heat-inactivated For MEF medium |
| D-MEM/F-12 | Invitrogen | 11330-057 | |
| Knockout™ Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | Pre-screen to ensure support of hES cells |
| bFGF | Stemgent | 03-0002 | Use at [4 ng/mL] final |
| Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 200 mM (100X) Use at [1X] final |
| PBS | Invitrogen | 14190-250 | Without Ca2+ or Mg2+ |
| Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12 |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | Type A, Porcine |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Defined | Hyclone | SH300.70.01 | For freezing medium |
| 6-well plates | Nalge Nunc international | 140675 | For general culture |
| 4-well plates | Nalge Nunc international | 176740 | For thawing |
| 5 mL glass pipets | Fisher Scientific | 13-678-27E | Individually wrapped |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430052 | Polypropylene |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | 9” glass |
References
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. , 5th edition, Wiley-Liss. (2005).
